HPLC法测定复方淫羊藿颗粒剂中淫羊藿甙的含量

采用高效液相色谱法以甲醇－水（５５：４５）为流动相，色谱柱为ＯＤＳＣ＿(１８)，检测波长为２７０ｎｍ，测定复方淫羊藿颗粒剂中淫羊藿成含量，结果表明在２１．４～１０μｇ·ｍ￣(－１)浓度范围内线性关系良好，ｒ＝０．９９９８，加样回收率：９８．７２％。     

淫羊藿甙对成骨细胞凋亡的影响

目的 通过研究淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞凋亡的影响,探讨淫羊藿甙防治骨质疏松的可能机制.方法 采用酶消化法和机械分离法获得新生SD大鼠成骨细胞,取第四代细胞随机分为,雌二醇组(1×10-8 mmol/l),淫羊藿甙低剂量组(1 ng/ml),中剂量组(10 ng/ml),高剂量组(100 ng/ml)对照组,经药物处理48 h后,用TUNEL和扫描电镜的方法检测成骨细胞的凋亡.结果 与对照组相比较,淫羊藿甙各剂量组的凋亡指数均下降(P<0.05),其中淫羊藿甙中剂量组的凋亡指数下降明显,差异有高度统计学意义(P<0.01);扫描电镜显示淫羊霍甙各组的凋亡细胞较对照组减少,尤以淫羊霍甙中剂量组最少.结论 淫羊藿甙可以通过抑制成骨细胞的凋亡,促进骨形成,减少骨吸收,从而发挥抗骨质疏松的作用.     

淫羊藿降压有效部位中活性成分淫羊藿甙含量的RP—HPLC分析

建立了淫羊藿Epimediumgrandiflorum降压有效部位中降压活性成分淫羊藿甙（icariin）含量的RP－HPLC分析方法。并对由不同产地的淫羊藿药材制备的淫羊藿降压有效部位中淫羊藿甙的含量进行了分析。这为淫羊藿降压有效部位质量标准的制定奠定了基础。     

淫羊藿甙对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

本实验根据小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力对巨噬细胞产生白细胞介素－１（ＩＬ－１）和肿瘤坏死因子的能力进行活测定。观察了淫羊藿甙对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。     

淫羊藿甙促成骨细胞分化的分子机制研究

【立论依据】 骨质疏松症是以骨量减少和骨的微观结构退化为特征,导致骨的脆性增加以致易于发生骨折的一种全身性代谢性骨病。骨质疏松严重威胁人类健康,且发病率呈逐年上升趋势,目前全世界约有2亿多骨质疏松症患者。目前临床上治疗骨质疏松的化学合成药物存在毒性大、价格昂贵等问题,而天然中草药及其制剂则可以克服上述缺点。淫羊藿(Herba Epimdii)是目前临床上治疗骨质疏松的常用中药,已有研究显示其主要成分淫羊藿甙(Icariine, ICA)具有促成骨分化功能,但具体机制不详。microRNA (miRNA)是一类长度约为20~25 nt、在基因转录后水平发挥调控作用的小分子非编码RNA,它几乎参与生物所有的生理病理过程。作为重要的生物调节分子,miRNA是否参与了ICA促成骨分化过程呢?关于ICA促成骨分化的分子机制的研究,可以为临床上提高淫羊藿治疗骨质疏松的效果提供理论和实验依据。 【设计思路】 首先确定ICA促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量,然后进行差异miRNAs筛选并选取部分差异miRNAs进行验证,最后挑选miR-27a进行深入研究。 【实验内容】 (1)ICA处理时间和剂量的确定:用MTT、real-time PCR确定ICA促MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量。(2)差异miRNAs的筛选:将5 μM ICA处理48 h 的MC3T3-E1 RNA及对照进行miRNA测序和分析。(3)差异miRNAs的验证:挑选15个差异miRNAs用Real-time PCR进行验证(已完成),并从中挑选miR-27a进行深入研究。(4)miR-27a在ICA促成骨分化中的作用及机制:① miR-27a靶基因的预测:运用miRWalk在线工具预测miR-27a的靶基因。② Osterix是miR-27a靶基因的验证:A. 构建含有Osterix 3'UTR以及miR-27a结合位点突变的荧光素酶报告质粒;B. 将miR-27a的mimic或对照和构建的荧光素酶报告质粒共转染HEK 293 T细胞,检测并比较荧光素酶活性;C. 将miR-27a的mimic或对照转染MC3T3-E1细胞,确定miR-27a对Osterix mRNA和蛋白表达的影响。③ miR-27a在ICA促成骨分化中的作用:将miR-27a的mimic、inhibitor和对照分别转染MC3T3-E1细胞,再用ICA处理,然后分别用Real-time PCR和碱性磷酸酶染色确定miR-27a在ICA促成骨细胞分化中的作用。 【材料】 HEK 293-T、MC3T3-E1细胞;pGL3-promoter荧光素酶报告基因载体、Real-time PCR用引物及试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体;碱性磷酸酶染色用试剂。 【可行性】 我们具备本课题实施所需要的研究材料包括试剂和仪器;课题设计所用的方法均为指导教师课题组常用的方法;本课题已顺利实施,我们目前已完成了ICA处理时间和剂量的确定、差异miRNAs的筛选和鉴定、miR-27a靶基因的预测。以上实验的实施和结果的获得表明本课题在理论和技术上均可行。 【创新性】 (1)首次证明miRNAs参与ICA促成骨细胞分化过程;(2)首次证明miR-27a 在ICA促成骨细胞分化中起重要作用。研究结果将进一步阐明ICA促成骨细胞分化的分子机制,从而为提高淫羊藿的临床治疗效果提供理论和实验依据。     

淫羊藿甙腹腔注射对新生大鼠卵巢发育的影响

目的 应用淫羊藿甙对新生大鼠进行腹腔注射,了解其对卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响.方法 用淫羊藿甙对出生后1～8 d大鼠腹腔注射50 mg/(kg·d),分别取出生后2、4、8 d龄卵巢,用苏木素-伊红(hematoxylin-eoxin,HE)染色观察不同发育阶段卵泡比例,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化.结果 在淫羊藿甙腹腔注射组的新生的鼠中,1、2 d龄卵巢内未装配卵泡比例及4、8 d龄卵巢内原始卵泡比例均高于对照组;各日龄组卵巢中卵母细胞TUNEL阳性率明显低于对照组.结论 淫羊藿甙可能通过延缓卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵母细胞凋亡从而增加新生大鼠卵巢中卵母细胞的储备量.     

金雀异黄素对高糖培养下大鼠系膜细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨金雀异黄素对体外高糖条件下大鼠系膜细胞(MC)增殖及凋亡的影响.方法:对照组:低糖DMEM培养液(不含金雀异黄素),实验组:高糖DMEM培养液(含0,1,5,10,30,50 μmol/L金雀异黄素),各组分别培养12,24,36,48 h.氮蓝四唑盐(MTT)法检测MC的增殖情况,DNA琼脂糖电泳、末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法、流式细胞术3种方法检测细胞凋亡情况.结果:10,30,50μmol/L金雀异黄素作用24 h可明显诱导细胞凋亡(P＜0.05),而0,1,5 μmol/L作用不显著.随着金雀异黄素浓度的增加,凋亡比例增加;同一浓度的金雀异黄素随着作用时间的延长,凋亡比例亦增加.结论:一定浓度的金雀异黄素在体外高糖培养条件下,可抑制大鼠MC增殖,促进其凋亡,且与其浓度和作用时间有关.     

Genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响

目的观察genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响。方法应用RT-PCR检测不同浓度genistein作用LiBr细胞48 h后Livin的表达变化;取最适浓度的genistein作用LiBr细胞后应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用Western blot检测其对凋亡效应蛋白Ccaspase-3表达的影响及应用MTT比色法检测其对细胞增殖的作用。结果 Genistein可增加LiBr细胞早、晚期凋亡率[分别为(27.87±5.38)%和(11.87±3.86)%],诱导LiBr细胞凋亡(P<0.01);引起细胞G0/G1期阻滞[G0/G1=(72.11±5.89)%、S=(14.53±3.47)%、G2/M=(12.36±2.64)%];下调caspase-3蛋白表达及抑制细胞增殖(P<0.01)。结论 Genistein可诱导LiBr细胞凋亡、使细胞增殖周期进展受阻、抑制细胞增殖。     

木黄酮对培养肝星状细胞增殖及脂质过氧化的影响

目的 以培养的大鼠肝星状细胞(HSC)为模型,测定植物雌激素木黄酮对HSC增殖及培养液中脂质过氧化产物的影响.以明确木黄酮抑制肝纤维化形成的作用.方法 采用培养的SD大鼠肝星状细胞(HSC-T6)为模型,培养后加入H2O3诱导氧化应激,分为3组,用不同浓度的木黄酮温育48 h,收集细胞培养基的上清液,每个浓度设6个重复组,用MTT法检测HSC增殖;收集细胞培养基上清液,采用试剂盒方法测定脂质过氧化产物超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX).结果 木黄酮各剂量组不同程度降低HSC的增殖.呈剂量-效应关系.给予木黄酮后,MDA和GSH水平明显降低,SOD和GSH-PX活力明显升高.也呈剂量-效应关系.结论 植物雌激素木黄酮具有抑制肝纤维化形成的作用,其作用机制可能与抑制HSC的增殖及抗HSC氧化应激、抗脂质过氧化作用有关.     

淫羊藿苷和淫羊藿素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响

目的 研究淫羊藿苷及淫羊藿素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响,探讨雌激素受体（ER）与其作用机制的关系。方法 用不同浓度的淫羊藿苷和淫羊藿素处理雌激素受体呈阳性的乳腺癌T47D细胞系后,MTT法检测T47D细胞增殖,流式细胞术检测T47D细胞周期的变化,Western blotting法检测T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达。结果 淫羊藿苷和淫羊藿素浓度为1×10^?9～1×10^?6 mol/L,能显著促进T47D细胞增殖,且该作用可被雌激素受体拮抗剂ICI 182.780（1×10^?6 mol/L）所拮抗。与对照组相比,淫羊藿苷和淫羊藿素1×10^?7 mol/L使S期T47D细胞比例明显增加,增殖指数显著升高,但该作用可被ICI 182.780抑制。淫羊藿苷和淫羊藿素1×10^?7 mol/L还可显著增加ERα、ERβ蛋白表达（P＜0.01）。结论 淫羊藿苷和淫羊藿素均可显著促进T47D细胞增殖,该作用可能是通过上调胞内ERα、ERβ蛋白表达介导的。     

木黄酮和雌激素对人垂体催乳素瘤细胞的作用

目的 :观察植物雌激素木黄酮和雌激素对培养的人垂体催乳素瘤细胞增殖和凋亡的影响 .方法 :将木黄酮(genistein ,GST)、β 雌二醇 (β E2 )作用于体外培养的人催乳素瘤细胞 ,测定MTT值及3 H TdR掺入量 ,流式细胞仪测定细胞周期 ,并用TUNEL法观察细胞凋亡情况 .结果 :GST可抑制催乳素瘤细胞的增殖 ,并存在着剂量效应 ,1× 10 -5mol·L-1GST可使G1期的细胞比例从对照组的 0 .5 5上升为0 .90 .β E2 以剂量依赖方式刺激催乳素瘤细胞的增殖 ,并使G2期的细胞比例从对照组的 0 .16上升为 0 .4 2 .不同浓度的GST均明显促进催乳素瘤细胞的凋亡 ,E2 对GST的促凋亡作用无明显影响 .雌激素受体阻断剂可阻断雌激素的作用 ,但对木黄酮的作用无影响 .结论 :木黄酮对培养催乳素瘤细胞的影响与雌激素的作用不同 ,木黄酮在体外能明显抑制培养人催乳素瘤细胞的增殖 ,促进其凋亡 ,并不受雌激素受体阻断剂的影响 .     

辛基酚和三羟异黄酮联合作用对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的观察辛基酚(octylphenols,OP)、三羟异黄酮(gen iste in,GEN)联合作用对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,并探讨其分子机制。方法以MTT试验、流式细胞分析、免疫细胞化学和RT-PCR等方法观察辛基酚、三羟异黄酮对MCF-7细胞增殖、细胞周期、雌激素受体α(estrogen receptor,αERα)及磷酸化酪氨酸蛋白、ERα及乳腺癌共激活因子1(amp lified in breast cancer 1,AIB1)mRNA的影响。结果8×10-6mol/L OP、5×10-5mol/L GEN及其两者联合作用MCF-7细胞72 h时,其增殖率分别为114.82%、65.98%和56.90%,G2/M期细胞分别为12.98%、46.16%和36.44%,细胞凋亡率分别为3.57%、11.41%和8.24%,磷酸化酪氨酸蛋白表达量荧光值分别为(62.84±9.80)、(26.75±5.09)、(39.15±7.83)。OP能增加细胞核中AIB1 mRNA的表达。GEN及其与OP联合组均降低ERα蛋白的表达,抑制细胞核中AIB1 mRNA的表达。结论OP能促进MCF-7细胞增殖,GEN及其与OP联合均抑制MCF-7细胞增殖,其机制可能是通过调节细胞中ER、AIB1、磷酸化酪氨酸蛋白的表达来作用的。     

接骨木中的酚酸类化合物及其对大鼠类成骨细胞UMR106增殖及分化的影响

目的研究接骨木Sambucus williamsii Hance中抗骨质疏松的活性成分,及其对UMR106类成骨细胞增殖和分化的影响。方法以大鼠类成骨细胞UMR106的增殖为指导活性成分分离的指标,利用各种分离手段追踪分离接骨木茎枝60%乙醇提取物活性部位的化学成分,并利用光谱学方法鉴定其结构,检测对UMR106细胞增殖和分化的影响。结果从接骨木中分离得到了7个酚酸类化合物,分别鉴定为香草醛(vanillin,)、香草乙酮(aceto-vanillone,)、松柏醛(coniferyl aldehyde,)、丁香醛(syringaldehyde,)、对羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid,)、对羟基桂皮酸(4-hydroxycinnamic acid,)、原儿茶酸(protocatechuic acid,)。检测了化合物、～和对UMR106细胞活性的影响。结论7个酚酸类化合物均为首次从接骨木中分离得到,化合物可同时促进UMR106细胞的增殖和分化,化合物和可促进细胞的增殖,化合物和可促进细胞碱性磷酸酶活性。     

淫羊藿苷对大鼠睾丸间质细胞射线损伤的保护作用

目的研究中药单体淫羊藿苷对于大鼠睾丸间质细胞60Co-γ照射后的保护作用。方法 50只成年雄性SD大鼠,完全随机分为A(正常对照组)、B(照射对照组)、C(3 d灌胃组)、D(7 d灌胃组)、E(15 d灌胃组)等5组(n=10)。A、B 2组以生理盐水灌胃15 d,C、D、E组于照射前以淫羊藿苷[80 mg/(kg.d)]分别灌胃3、7、15 d后,B、C、D、E 4组行60Co-γ射线8 Gy下腹部均匀照射1次。照射后空腹12 h处死大鼠,光镜下观察大鼠睾丸组织形态学变化,反转录PCR法检测睾酮合成限速酶胆固醇侧链裂解酶(P450scc)基因的表达量。ELISA法测定睾酮(T)、黄体生成素(LH)水平。结果B组睾酮较A组降低(P<0.05),黄体生成素升高(P<0.05)。C、D、E组较B组睾酮升高,其中D、E组与B组比较有统计学意义(P<0.05),黄体生成素水平较B组降低,其中E组与B组比较有统计学意义(P<0.05),P450scc表达量B组较A组降低,具有统计学意义(P<0.05),C、D、E组较B组升高,其中E组与B组比较具有统计学意义(P<0.05)。结论淫羊藿苷对大鼠睾丸间质细胞射线照射具有保护作用,且以15 d灌胃组效果最佳。     

金雀黄素对子宫内膜癌细胞体外生长影响的研究

目的 研究金雀黄素抑制人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞体外增殖作用机理.方法 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞进行体外培养,用MTT法检测细胞增殖作用,用流式细胞仪检测细胞周期情况.结果 金雀黄素能明显抑制Ishikawa细胞体外增殖,并且随着药物浓度增加其抑制作用更加明显,呈剂量依赖性,金雀黄素对Ishikawa细胞体外增殖抑制最显著的时间是加药48 h,加药后72 h的抑制率虽然有所上升,但不甚明显,加药96h其抑制率稍低,加药后120 h其抑制率明显降低;金雀黄素处理的Ishikawa细胞明显阻滞于G2-M期.结论 金雀黄素通过阻滞细胞于G2-M期,从而抑制Ishikawa细胞体外增殖.     

中药黄芪对成骨细胞体外成骨能力的观察

目的 :观察黄芪水提液对新生大鼠颅骨成骨细胞体系增殖、分化及成骨能力的影响。方法 :取 2 4 h新生大鼠颅骨成骨细胞按细胞密度 1× 1 0 5个 / ml接种 96孔培养板 ,然后将生理盐水 (NS)、黄芪低剂量 (0 .5 g/ ml)、黄芪高剂量 (5 g/ml) ,终稀释成 1∶ 2 0 ,1∶ 4 0 ,1∶ 80分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞体系 ,进行细胞增殖 (MTT法 )、AL P活性测定以及矿化结节计数。结果 :黄芪低剂量 (0 .5 g/ ml)在 1∶ 80稀释比 ,MTT法所测吸光度 A值及 AL P活性显著高于 NS对照组 (P<0 .0 1 ) ;黄芪高剂量 (5 g/ ml)在 1∶ 2 0稀释比 ,MTT法所测吸光度 A值及 AL P活性亦显著高于 NS对照组(P<0 .0 1 ) ;矿化结节计数两组均显著高于 NS对照组 (P<0 .0 1 )。结论 :黄芪在体外对成骨细胞的增殖与分化具有一定的双向调节作用