STAg和霍乱毒素不同程序滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫作用

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)佐剂不同程序滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染能力,确定STAg和CT滴鼻免疫的最佳程序。方法BALB/c小鼠随机分为3组:1次、2次和3次免疫组,用20 μg STAg 1 μg CT/只分别滴鼻免疫1次,2次或3次,前2次间隔2周,末次间隔1周。末次免疫后第14天,用4×104个速殖子/只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况,攻击后第30天处死,ELISA法检测血清IgG和粪便IgA,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数派伊尔结(Peyer′spatches,PP)和脾淋巴细胞数。结果2次和3次免疫组小鼠存活率明显高于1次免疫组(P<0.05),肝、脑组织内虫荷显著低于1次免疫组(P<0.001),血清IgG和粪便IgA高于1次免疫组,PP和脾淋巴细胞数无显著性变化。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫2次或3次能有效诱导小鼠抗弓形虫感染。     

霍乱毒素佐剂联合弓形虫ESA鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用

目的 观察霍乱毒素(cholera toxin,CT)佐剂和弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用。方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组20只。分别用PBS 20μl、ESA 20μg或CT 1.0μg+ESA 20μg每只滴鼻免疫2次,间隔2周。末次免疫后14 d,用4×104个弓形虫速殖子每只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况。速殖子攻击后30 d,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。结果 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠的健康状况明显好于PBS组和ESA组,存活率(95%)也显著高于PBS组(55%)。与PBS组相比,CT+ESA组肝和脑组织内速殖子数分别减少了80.19%(P0.001)和78.24%(P0.005)。CT作为佐剂联合ESA滴鼻免疫小鼠诱导了高水平的黏膜免疫应答和系统免疫应答。结论 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答可有效抵抗弓形虫速殖子攻击。     

STAg和霍乱毒素滴鼻免疫小鼠诱导的鼻相关淋巴组织细胞免疫应答

目的研究可溶性速殖子抗原(solubletachyzoiteantigen,STAg)和霍乱毒素(choleratoxin,CT)佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠后鼻相关淋巴组织(nasal-associatedlymphoidtissue,NALT)的免疫效应及持续时间。方法BALB/c小鼠96只随机分为实验组和对照组,实验组以免疫原性好的STAg(20μg/只)为抗原,CT(1μg/只)为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。滴鼻2次(间隔2周)后分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死6只小鼠。分离NALT的淋巴细胞,计数并涂片,用免疫细胞化学法(immunocytochemistry,ICC)检测其CD4 、CD8 T细胞亚群水平。结果小鼠免疫后,NALT淋巴细胞第1、2、6、8、12(P<0.05)周显著增生,可持续至免疫后第12周;CD4 T细胞第1周至第6周(P<0.05)持续显著增高,CD8 T细胞在第1周至第4周持续增高(P<0.01),CD4 /CD8 比值第2、3周显著降低(P<0.05)。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠能够有效诱导NALT的免疫效应,并可持续较长时间。     

酶联免疫印迹法对弓形虫速殖子功能性抗原分析

目的：研究弓形虫功能性抗原,为开发弓形虫诊断试剂及商苗提供理论基础。方法：采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法,对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析。结果;弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在ＳＤＳ－ＡＧＥ中用１２５ｇ／Ｌ的分离胶可产生较好的分辨率,分离出３０多条区带。     

不同佐剂的弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠诱导的黏膜免疫应答

目的比较IFN-γ、蜂胶佐剂以及两种佐剂混合鼻内免疫辅助可溶性速殖子抗原(STAg)增强机体黏膜免疫应答的水平,探讨两种佐剂联合应用的免疫效果。方法将5～6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4组(各15只):20μgSTAg,20μgSTAg 40μg蜂胶,20μgSTAg 1000UIFN-γ或20μgSTAg 40μg蜂胶 1000UIFN-,γ均溶于总体积为20lμ的PBS中,滴鼻免疫(10lμ/鼻孔),免疫2次,间隔14d。末次免疫后第10天用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。攻击后第43天处死全部存活小鼠,比较各组小鼠肠黏膜小肠上皮内淋巴细胞(IEL)、PP结T淋巴细胞数;检测小鼠粪便、鼻咽冲洗液、肺冲洗液、阴道冲洗液中弓形虫特异性sIgA含量。结果各佐剂组小鼠IEL、PP结T淋巴细胞数显著高于STAg组,黏膜sIgA含量显著高于STAg组;蜂胶 IFN-γ联合组小鼠黏膜免疫应答水平高于单独佐剂组,其中显著高于蜂胶组(P<0.05)。结论IFN-γ作为弓形虫黏膜疫苗佐剂的效应优于蜂胶,IFN-γ 蜂胶作为复合黏膜佐剂鼻内免疫效果优于两者单独应用。     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的弓形虫IgA抗体特异性免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,血清、小肠液和粪便IgA抗体分泌的动态变化。方法将6～7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只,分别用10μl缓冲液PBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo 500UIFN-γ鼻内免疫小鼠。用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,收集血清、小肠液及粪便,ELISA法测定IgA含量。结果各组血清IgA抗体水平在攻击后第10天达到峰值,TSo IFN-γ组血清IgA抗体含量高于其他各组。小肠液和粪便IgA抗体含量在攻击后第13天达到峰值,在实验期各时点TSo IFN-γ组小肠液和粪便IgA抗体含量高于其他组。小肠液与粪便IgA抗体水平呈正相关。结论TSo或IFN-γ或TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可诱导黏膜免疫,产生高水平的弓形虫特异性IgA抗体。TSo联合IFN-γ鼻内免疫优于单独免疫,免疫小鼠肠道产生大量SIgA,发挥抗虫作用。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。     

酶联免疫印迹法对弓形虫速殖子功能性抗原分析

研究弓形虫功能性抗原,为开发弓形虫病诊断试剂及疫苗提供理论基础。方法：采用十二烷基硫 酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和免疫印迹方法,对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和 弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析。结果：弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中 用１２５ ｇ／Ｌ的分离胶可产生较好的分辨率,分离出 ３０多条区带。免疫印迹分析表明 ２种抗血清均能特异地识别弓 形虫速殖子抗原,共同识别的抗原组分相对分子质量为 ４３ ０００、３３ ０００、２７ ０００、１４ ０００。结论：这些抗原组分是诱导 宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原。     

STAg滴鼻免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用

目的 观察可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)于妊娠前不同时间滴鼻免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用.方法 BALB/c雌鼠130只随机分为STAg和PBS组,分别用sTAg(20 μg/只)和PBS滴鼻免疫2次(间隔2周).末次滴鼻后雌雄鼠以2:1分批交配,各组获得孕鼠30只,各组按末次免疫时间的不同(妊娠前3 d,9 d,15 d)分为3小组,分别为PBS3、PBS9、PBS15组和STAg3、STAg9、STAg15组.全部孕鼠于妊娠第8天用8 000个/只速殖子灌胃攻击.妊娠第18天颈椎脱臼处死,记录孕鼠感染率、活胎率,检测孕鼠小肠冲洗液sIgA水平,测定孕鼠肝、胎盘和胚胎脑组织弓形虫抗原.结果 随着免疫时间推迟,STAg组感染率降低,STAg15组感染率最低,但三组间比较无统计学差异(P＞0.05),STAg各组孕鼠感染率均低于相应PBS各组,但差异无统计学意义(P＞0.05).STAg组小肠冲洗液sIgA水平逐渐升高,STAg15组高于STAg3组(P＜0.05)和STAg9组(P＞0.05),STAg15组明显高于PBS各组(P＜0.05).随着免疫时间推迟STAg组活胎率增加,STAg15组活胎率高于STAg3组和STAg9组,但差异无统计学意义(P＞0.05),STAg15组活胎率显著高于PBS15组(P＜0.05).STAg组胎盘感染率和胚胎感染率均呈减少趋势(P＞0.05),STAg组胎盘和胚胎感染率均低于PBS各组,但差异无统计学意义(P＞0.05).各组胎盘感染率高于胚胎感染率,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 妊娠前15 d STAg末次滴鼻免疫小鼠,可有效诱导孕鼠黏膜及系统免疫应答,提高孕鼠抗弓形虫感染作用,降低胎盘、胚胎感染率,减少垂直传播的发生,部分阻断垂直传播.     

弓形虫速殖子和包囊的分离纯化

采用植物血凝素P(PHAP)亲和凝集分离法自小鼠腹腔液内分离弓形虫速殖子,纯度达99.5％,收获率为73.2％。与胰蛋白酶消化法相比,前法对虫体无损伤。此外,应用淋巴细胞分离介质Ficoll-Paque密度梯度离心法自鼠脑组织内分离出较纯净的包囊。     

弓形虫ESA鼻内免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答

目的 观察弓形虫排泄-分泌抗原(excreted-secreted antigen,ESA)鼻内免疫小鼠诱导黏膜和系统免疫应答的效果.方法 将64只BALB/c小鼠随机分为8个组,每组8只.实验组小鼠分别用腹腔感染弓形虫小鼠第0,6,12,24,36,48和60小时无菌收集的腹腔液中获取的ESA 20 μg/只滴鼻免疫小鼠2次,间隔14 d,以PBS20 μl/只滴鼻为对照.逐日观察小鼠状况,于末次免疫后第14天颈椎脱位处死小鼠,检测血清特异性IgG、小肠冲洗液sIgA水平,分离肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,iIEL)及肠系膜淋巴结淋巴细胞(mesenteric lymph node lymphocytes,MLNL)并计数.结果 60 h组小鼠初次免疫后第8-11天,有倦怠、饮水及采食量减少等表现,体重增长较其他组缓慢(P＜0.05),其他组小鼠健康状况良好.不同时相ESA鼻内免疫小鼠后特异性抗体水平升高,MLNL、iIEL发生增殖性应答.48 h组和60 h组各项指标均明显高于0 h组(P＜0.01)及PBS组(P＜0.05).结论 48 h和60 h弓形虫ESA均能诱导黏膜及系统免疫应答,但60h ESA可能对机体有毒副作用,不适宜直接滴鼻免疫,48 h ESA可作为弓形虫黏膜疫苗的候选抗原.     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的肠IEL持续性免疫应答

目的采用可溶性速殖子抗原(solubletachyzoiteantigen,STAg)和霍乱毒素(choleratoxin,CT)佐剂制备弓形虫复合黏膜疫苗,观察经滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的肠上皮内淋巴细胞(intraepitheliallymphocytes,IEL)免疫应答及持续时间,探讨其抗弓形虫感染的作用机制。方法BALB/c小鼠96只随机分为实验组和对照组,实验组以免疫原性好的STAg(20μg/只)为抗原和CT(1μg/只)为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。滴鼻2次(间隔2周)后分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死小鼠。制备肠IEL细胞悬液,计数并涂片;免疫细胞化学法(immunocytochemistry,ICC)检测CD4 T、CD8 T细胞亚群水平。结果免疫后肠IEL显著增生,第2周达高峰,第1周至第4周(P<0.01)高于对照组。其中以CD8 T细胞增生为主,CD8 T细胞水平第2周达高峰,第1周至第6周增高显著(P<0.01),CD4 T细胞也略有增生,第2、3周(P<0.05)有显著性,CD4 /CD8 比值倒置,第1、2周明显低于对照组(P<0.05)。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导肠IEL免疫应答,且可持续较长时间,在预防弓形虫感染中起重要作用。     

不同佐剂的复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用

目的比较IFN-γ和蜂胶作为佐剂鼻内免疫小鼠抗弓形虫攻击的能力,探索两种佐剂联合应用的效果。方法将5～6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4个组,每组15只,分别用20μg可溶性速殖子抗原(STAg)、20μgSTAg+40μg蜂胶、20μgSTAg+1000UIFN-γ或20μgSTAg+40μg蜂胶+1000UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔14d。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43天处死全部存活小鼠,计算胸腺、脾指数,计数脑、肝组织速殖子。结果STAg+IFN-γ组、STAg+蜂胶+IFN-γ组胸腺、脾指数显著高于STAg组(P<0.05);组织内速殖子虫荷显著降低(P<0.01),STAg+IFN-γ组小鼠脑、肝组织减虫率分别为57.00%和79.06%;STAg+蜂胶+IFN-γ组小鼠脑、肝减虫率分别为68.30%和79.06%。STAg+蜂胶组小鼠胸腺、脾指数有升高趋势,组织内速殖子虫荷降低,但与STAg组比较差异无统计学意义。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ、蜂胶+IFN-γ的佐剂效果优于蜂胶,IFN-γ、蜂胶+IFN-γ辅助...     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导NALT和GALT黏膜部位的免疫应答

目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的鼻相关淋巴组织（NALT）和肠相关淋巴组第（GALT）黏膜部位的免疫应答。探讨弓形虫黏膜疫苗能否在感染起始阶段有效诱导免疫应答。方法将BALB／小鼠随机分为免疫和对照组,免疫组小鼠以弓形虫复合黏膜疫苗20μl／只（20μg STAg＋1μg CT）滴鼻免疫2移（间隔2周）,对照组PBS滴鼻。于末次滴鼻后14d颈椎脱臼处死小鼠,ELISA测定粪便和鼻咽冲洗液IgA抗型水平;计数NALT、NC及PP、IEL淋巴细胞数,免疫细胞化学法检测CD4^＋、CD8^＋T细胞亚群水平。结果免疫匀小鼠粪便IgA和鼻咽冲洗液IgA抗体显著高于对照组（P〈0．05）。NALT内淋巴细胞明显增生（P〈0．05）,其中CD4^＋、CD8^＋T细胞均有增生（P〈0．01）,CD4^＋／CD8^＋比值降低（P〈0．05）。NC中淋巴细胞数明显升高（P〈0．01）,以CD4^＋T细胞水平为主（P〈0．01）。GALT部位PP淋巴细胞增生显著（P〈0．01）,主要以CD4^＋T细胞为主;而IEL以CD8^＋T细胞增生为主（P〈0．01）,CD4^＋／CD8^＋比值降低（P〈0．05）。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠可有效诱导NALT和GALT黏膜部位免疫应答。     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞持续性免疫应答

目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的脾淋巴细胞的免疫应答及持续时间。方法96只BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组以弓形虫复合黏膜疫苗20μl/只(20μg可溶性速殖子抗原 1μg霍乱毒素)滴鼻免疫2次(间隔2周),对照组以PBS滴鼻。分别于末次滴鼻后第1,2,3,4,6,8,10,12周处死小鼠,脾淋巴细胞计数,免疫细胞化学法检测CD4 、CD8 T细胞亚群水平。结果免疫组小鼠于第1,2周脾淋巴细胞明显高于对照组(P<0.01),其中以CD4 T细胞增生为主,第1,2,3,4,6周增生显著(P<0.01),CD8 T细胞水平在第2,3周也有增生(P<0.05),CD4 /CD8 比值第6周高于对照组(P<0.01)。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导脾淋巴细胞增殖性免疫应答,且可持续较长时间。     

弓形虫 SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答

目的分析弓形虫 SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.方法重组表达质粒 pVAX1-SAG1瞬时转染 vero细胞, Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒 pVAX1-SAG1及空质粒 pVAX1于 0、 4周分别经肌注免疫 BALB/c小鼠;第 8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经 ConA和抗原刺激,用 MTT法测定免疫鼠脾脏 T淋巴细胞转化率 ;使用直接免疫荧光法 ,用流式细胞仪对 CD4+、 CD8+ T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.结果 Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的 26 000u的特异带,与理论值相符 ;抗原刺激小鼠脾 T淋巴细胞发生增殖反应 , 免疫组与空质粒对照组间差异有显著性 (P< 0.05),但 ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性 (P >0.05); T细胞亚群 CD4+、 CD8+动态分析 ,CD4+、 CD8+ T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性 (P1< 0.05, P2< 0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.结论 真核表达质粒 pVAX1-SAG1在 vero细胞中获得表达 ,且能诱导 BALB/c小鼠产生细胞免疫应答.