人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的将激光显微分离(laser capture microdissection, LCM) 技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程,建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片,免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法,以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水,以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞,转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果利用LCM技术,可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽,应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选,可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽;同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染,为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。     

卵巢癌细胞表面特异性结合肽的筛选及鉴定

目的利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞HO-8910表面特异性结合肽。方法利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞株HO-8910,经过3轮生物淘洗,随机挑选21个噬菌体单克隆进行ELISA试验,挑选亲和力高的17个噬菌体进行DNA序列测定,随后利用噬菌体结合实验、免疫细胞染色、免疫荧光染色、竞争抑制等实验鉴定阳性噬菌体的特异性。结果展示短肽MRMTIIN的噬菌体克隆对HO-8910细胞株有较高的亲和力和特异性。结论噬菌体展示技术筛选的短肽MRMTIIN可为上皮性卵巢癌的早期诊断提供新的思路。     

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的：将激光显微分离（laser capture microdissection，LCM）技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程，建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法：将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片，免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法，以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水，以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞，转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果：利用LCM技术，可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽，应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论：本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选，可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽；同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染，为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。     

噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定

目的:通过噬菌体随机肽库,筛选人肝癌细胞结合短肽,并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定.方法:以L-02为阴性消减细胞,HepG2为靶细胞,对噬菌体随机七肽库进行4轮消减筛选.并随机挑取26个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定H3噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性.人工合成短肽HBP3,利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性.结果:4轮筛选使噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集.所挑取的26个阳性噬菌斑,经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列,最终产生5条氨基酸序列.经BLAST分析发现,在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子.ELISA分析鉴定显示,5个阳性克隆在HepG2和L-02细胞上有差异性结合,其中H3噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大.免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示,H3噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞.免疫荧光显色证实,FITC-HBP3能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质.结论:H3噬菌体克隆所呈现的七肽HBP3能与靶细胞高亲合性结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

噬菌体肽库技术筛选肿瘤靶向短肽的研究进展

噬菌体展示技术是一项特殊的基因重组表达技术,亦是一种强大的筛选工具。1985年,Smith等成功地创立了噬菌体展示技术;1990年,Scott等在噬菌体展示技术的基础上发展并构建了噬菌体展示随机肽库。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具［1］,通过噬菌体随机肽库筛选获得的肽可以作为分子载体运载药物,起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合,起到生物治疗的作用。近年来,噬菌体肽库技术已广泛应用于肿瘤研究,如癌症的检测和诊断、肿瘤相关抗原的筛选、肿瘤药物的研制、肿瘤细胞信号转导及肿瘤的基因治疗研究等。现就近年来噬菌体展示肽库技术在筛选肿瘤靶向短肽研究中的应用综述如下。     

噬菌体肽库筛选转化生长因子βⅡ型受体亲和肽

目的:从噬菌体随机肽库中筛选转化生长因子β(TGF-β)Ⅱ型受体的亲和短肽。方法:以重组可溶性人TGF-βⅡ型受体作为靶标,应用噬菌体随机十二肽库进行筛选,经过3轮淘选,提取阳性噬菌体克隆ssDNA,测序并进行序列分析。结果:通过筛选噬菌体获得富集,挑选10个能与人TGF-βⅡ型受体特异性结合的噬菌体克隆,测序得到4个核酸序列,未发现共有保守序列。结论:通过噬菌体肽库技术能筛选出与TGF-βⅡ型受体结合的噬菌体展示肽,为进一步研究TGF-βⅡ型受体亲和短肽及在抗肝纤维化中的作用提供依据。     

与胃癌腹膜高转移细胞表面受体特异性结合的多肽片段的研究

目的利用噬菌体随机肽库筛选与胃癌腹膜高转移细胞特异性结合的多肽,为肿瘤细胞的靶向性治疗筛选药物和载体。方法利用噬菌体随机十二肽库对人胃癌细胞系GC9811和其腹膜高转移亚系GC9811P进行3轮差异筛选、富集,获得与胃癌腹膜高转移细胞亲和的噬菌体克隆。酶联免疫吸附实验(ELISA)测定其与GC9811P和GC9811细胞的亲和力,提取阳性噬菌体DNA并进行DNA序列测定,获得与胃癌腹膜高转移细胞亲和的多肽序列并予合成。利用荧光染色和流式细胞仪鉴定噬菌体克隆和合成肽与胃癌腹膜高转移细胞的体内外的结合特异性。结果筛选及ELISA结果显示得到与GC9811P细胞特异性结合并内化入癌细胞的噬菌体克隆,测序结果示45%的被检噬菌体展示相同的多肽序列SMSIASPYIALE,推测SMSI是胃癌腹膜高转移细胞特异性结合肽的基序。合成的多肽与细胞共孵育48h或多肽药物浓度达5μmol/L时,显示出明显的结合能力。平均荧光强度分别为17.19±0.42和16.89±0.31(每组实验为3个样本均值),与对照组无关肽PC的平均荧光强度(4.33±0.53)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。合成的多肽与细胞共孵育72h或多肽药物浓度达10μmol/L时细胞的平均荧光强度为23.58±0.71和24.95±0.15(每组实验为3个样本均值),与对照组无关肽PC的平均荧光强度(4.16±0.24)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。裸鼠体内试验说明合成的多肽可与GC9811P细胞成瘤的组织结合而不与GC9811及其他细胞成瘤的组织结合。结论筛选噬菌体随机肽库获得能与胃癌腹膜高转移细胞特异性结合的多肽序列SMSIASPYIALE;合成的多肽与胃癌腹膜高转移细胞有特异亲和力,为进一步临床胃癌早期腹膜转移诊断和治疗提供高度特异性和敏感性的理想标志物和靶向载体。     

噬菌体展示技术筛选小细胞肺癌细胞特异性结合多肽

目的 利用噬菌体七肽库,筛选出与小细胞肺癌细胞系H446细胞特异性结合的多肽。 方法 利用噬菌体展示技术和小细胞肺癌细胞系H446细胞,经过多次3轮筛选,每次挑取12个噬菌体单克隆进行DNA测序,分析得到多肽序列,并利用免疫组织化学技术验证多肽的特异性。 结果 多肽AF(AGALHQF)与小细胞肺癌病理组织有较高的亲和性。 结论 噬菌体展示技术筛选的多肽AF可望为小细胞肺癌靶向治疗提供新的方向。     

津白Ⅱ小鼠体内筛选乳腺癌特异性结合噬菌体融合肽

目的：利用噬菌体随机肽库，筛选特异性靶向乳腺癌的肽段，为乳腺癌的定位诊断和靶向治疗提供理论依据。方法：建立津白Ⅱ（TAⅡ）小鼠自发乳腺癌模型，并在小鼠体内对噬菌体十二随机肽库进行4轮筛选，回收肿瘤和对照组织（肝）的噬菌体并计数，同时用免疫组织化学染色法，鉴定噬菌体展示肽的特异性。结果：筛选出自发乳腺癌特异性结合的噬菌体．其结合乳腺癌细胞的能力为对照组织的14倍，随机挑选克隆测序鉴定，结果表明十二肽ASANPFPTKALL出现次数最多．免疫组化染色进一步证明该噬菌体能特异结合于乳腺癌细胞。结论：4次小鼠体内筛选得到的短肽ASANPFPTKALL能够特异结合于乳腺癌组织。为下一步的定位诊断和靶向治疗研究奠定了基础。     

灵芝酸A对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的探讨灵芝酸A对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法体外培养人骨肉瘤HOS和mg-63细胞与0.1、0.25 和
0.5 mmol/L的灵芝酸A孵育,采用CCK8检测HOS和MG-63细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞的迁移
和侵袭。Western blot 检测细胞中p-STAT3、STAT3、p-p38、p38和NF-ΚB1蛋白的表达变化。结果灵芝酸A能够显著抑制人类
骨肉瘤HOS和MG-63细胞的增殖,促进细胞凋亡以及抑制细胞迁移,并且这种效应存在剂量依赖性。与0.5 mmol/L 灵芝酸A
孵育能够显著降低HOS和MG-63细胞中STAT3的磷酸化水平,增加p38磷酸化水平,同时增加NF-κB1的表达水平。结论灵
芝酸A能够杀死人类骨肉瘤HOS和MG-63细胞,可以作为抗骨肉瘤的药物进行开发。
     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

CD20抗原模拟表位的筛选

目的：筛选CD20分子的模拟表位肽,构建针对CD20分子的治疗性疫苗,以期为淋巴瘤以及其它B细胞相关性疾病的治疗提供新的方向.方法：利用噬菌体随机呈现肽库筛选技术,以人淋巴细胞分化抗原CD20 mAb Rituximab为靶点,筛选CD20分子的模拟表位肽.通过ELISA方法检测筛选出的阳性噬菌体与Rituximab的特异性结合,并以竞争性结合实验检测筛选出的阳性噬菌体与Raji细胞表面的CD20分子竞争结合Rituximab的能力.最后以Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列,推断其氨基酸序列.结果：成功筛选出针对CD20 mAb Rituximab的阳性噬菌体,获得了CD20分子的模拟表位肽QDKLTQWPKWLE.获得的阳性噬菌体能够与Rituximab特异性结合,并且表达该表位的噬菌体可以竞争性抑制Rituximab与天然CD20分子的结合.结论：CD20分子的抗原表位肽QDKLTQWPKWLE能够与mAb Rituximab特异性结合,与天然CD20分子竞争性结合mAb Rituximab,并具有潜在的应用价值.