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相似文献
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1.
为探讨腺苷A1受体与表皮生长因子受体(EGFR)之间的信号作用,阐明原代培养皮层神经元上腺苷A1受体介导的神经保护机制。采用原代培养大鼠皮层神经元缺氧损伤模型、免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀、Western Blot等方法在原代培养的大鼠皮层神经元和HEK293/A1R细胞上研究腺苷A1受体与表皮生长因子受体的相互作用方式,揭示由腺苷A1受体介导的神经保护机制。  相似文献   

2.
Difelikefalin是2021年8月由美国食品药品监督管理局批准的首个用于成人血液透析患者中重度慢性肾病相关性瘙痒(CKD-aP)的治疗药物。Difelikefalin是一种外周选择性κ-阿片受体(KOR)激动药,通过激活外周神经元和免疫细胞上的KOR发挥止痒作用,其外周特异性限制了对中枢神经系统KOR的影响,从而避免了阿片类药物的副作用。本文从Difelikefalin作用机制、药物临床前药效学研究、临床前毒理学研究、药代动力学、临床研究及安全性等方面作一介绍。  相似文献   

3.
《中国药房》2015,(16):2184-2187
目的:构建大鼠Ⅰ型大麻素受体(CB1)真核基因表达载体,并检测其在细胞中的表达情况。方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出CB1基因片段,产物连接到p MD18-T载体上。阳性实验筛选出阳性克隆,经Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后,将其连接到载体pc DNA 3.1(+)中,构建质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1,脂质体转染原代人胚肾293细胞(HEK293细胞)。用Western blot实验鉴定细胞中CB1蛋白的表达,用免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法检测其在细胞中表达的部位。结果:采用RT-PCR成功获得大鼠CB1基因,PCR扩增得到1 500 bp左右的CB1基因片段,双酶切鉴定及DNA测序证实质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1构建成功。Western blot实验、免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法证实载体pc DNA3.1(+)-CB1能在HEK293细胞中表达,且表达产物主要分布在细胞膜表面和细胞质中。结论:构建的pc DNA3.1(+)-CB1表达载体能成功转入真核HEK293细胞,并在细胞膜表面和细胞质中表达CB1蛋白。  相似文献   

4.
目的构建能够表达TRPV1通道用于实验研究的HEK 293T细胞表达体系。方法采用脂质体转染方式将TRPV1质粒转入人胚胎肾HEK 293T细胞,建立TRPV1型通道瞬时异源表达体系,并对转染后的TRPV1表达体系进行了鉴定,同时对该通道功能特性进行了研究。结果经荧光显微镜观察,转染率可达40%~50%;Western Blot研究发现转染后的HEK 293T细胞在与TRPV1通道蛋白相应的位置上具有明显的条带,提示TRPV1通道蛋白在转染后的细胞中有异源性表达;共聚焦显微成像显示,转染后的HEK293T细胞在受到TRPV1通道激动剂刺激后,胞内荧光强度明显变强,提示TRPV1通道介导钙离子功能正常。结论研究结果表明,基于HEK 293T细胞的TRPV1通道瞬时转染的异源表达体系成功构建。  相似文献   

5.
目的:研究α_1-肾上腺素受体各亚型介导的HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积反应的特点。方法:(1)用磷酸钙沉淀法将编码三种亚型α_1-肾上腺素受体的全长cDNA分别转染到HEK293细胞中。(2)采用放射配基结合实验测定各亚型α_1-肾上腺素受体在HEK293细胞的表达量。(3)用[~3H]腺嘌呤掺入法测定环腺苷一磷酸蓄积率。结果:(1)各亚型激活后均使HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积率呈浓度依赖性增加,并被α_1-受体选择性拮抗剂哌唑嗪阻断。(2)比较各亚型的药理学特性发现,在三种亚型中,α_(1A)-肾上腺素受体介导的效应最强,而α_1-肾上腺素受体各亚型对去甲肾上腺素的敏感性最高。结论:三种亚型α_1-肾上腺素受体均能介导HEK293细胞中环腺苷一磷酸的生成,并且在介导的效应和敏感性的高低等方面存在差异。  相似文献   

6.
目的建立稳定表达CRFR1的HEK293细胞株,并鉴定cAMP评价体系构建是否成功。方法采用Lipofectamine2000将CRFR1质粒转染至HEK293细胞中,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术、RT-PCR法、免疫荧光法证实稳定表达CRFR1细胞株构建成功。并用CRF刺激稳定表达CRFR1的HEK293细胞株,绘制CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的量效曲线。结果 Western blot、RT-PCR、免疫荧光结果表明,CRFR1受体在HEK293细胞系中成功表达。cAMP释放量效实验显示,CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的EC50为(5.64±0.05)×10-10mol·L-1。结论成功建立了稳定表达CRFR1的HEK293细胞株,并且cAMP含量评价体系构建成功,为研究CRFR1的生物学功能及筛选CRFR1受体靶向药物奠定了基础。  相似文献   

7.
中枢神经系统主要存在 μ、δ、κ阿片受体以及新发现的阿片受体样 - 1(ORL - 1)受体。阿片受体急性激活时激活Gi o蛋白 ,三磷酸鸟苷 (GTP)置换Gα结合的三磷酸鸟苷 (GDP)后 ,Gα与 βγ亚单位解离 ,它们分别作用于下游多个效应分子 ,可调节腺苷酸环化酶和磷酯酶C(PLC)的活性 ,激活K +通道 ,抑制Ca2 + 通道并增加胞内Ca2 + 浓度。阿片长期作用于机体后可产生严重的耐受和依赖 ,伴随有神经系统细胞和分子水平的功能以及基因表达的改变[1] 。1996年LiLY等报道了激活阿片受体可将丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen -activatedproteinkinase…  相似文献   

8.
目的研究眼镜蛇毒神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响,探讨nNGF诱导PC12细胞分化的分子机制。方法用RT-PCR方法半定量地考察nNGF及κ阿片受体的一些拮抗剂和激动剂对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响。结果(1)在25,50和100 ng/mL 3个nNGF剂量组中,50和100 ng/mL nNGF显著下调PC12细胞κ阿片受体mRNA的表达。(2)50 ng/mL nNGF分别处理PC12细胞1,3,5,7,10 d后,结果显示κ阿片受体mRNA表达随时间有降低的趋势,7 d时显著下调(P<0.05),10 d时特别显著(P<0.01)。(3)10μmol/L吗啡上调PC12细胞κ阿片受体mRNA表达,并能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。10μmol/L纳络酮对PC12细胞κ阿片受体的表达无显著影响,也能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。但吗啡和纳络酮共存时不能逆转NGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。结论nNGF诱导PC12细胞分化时,能下调其κ阿片受体mRNA表达,这种下调能分别被吗啡或纳络酮逆转,但不能被吗啡和纳络酮共存时逆转。  相似文献   

9.
目的:研究α_1-AR三种亚型对细胞增殖和Ca~(2 )-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CCDPK)的作用。方法:采用磷酸钙沉淀法进行转染,用放射配基结合实验测定α_1-AR表达量。用[~3H]胸腺嘧啶参入量测定细胞增殖,用免疫沉淀和髓鞘蛋白底物法测定CCDPK的活性。结果:三株表达α_(1A)-,α_(1B)-和α_(1D)-AR的细胞株表达受体密度约为0.6 nmol·g~(-1)。在普萘洛尔存在下,去甲肾上腺素(NE)作用24 h可浓度依赖地刺激HEK293/α_(1A)-AR和HEK293/α_(1B)-AR细胞DNA合成。NE 10 μmol·L~(-1)可促进HEK293/α_(1A)-AR和HEK293/α_(1B)-AR细胞DNA合成增加,刺激CCDPK活性的升高。NE不引起HEK293/α_(1D)-AR细胞DNA合成和CCDPK活性的显著改变。结论:在转染α_1-AR亚型的HEK293细胞中激动α_(1A)-或α_(1B)-AR可引起细胞增殖,激动α_(1D)-AR则无显著改变。  相似文献   

10.
目的 利用受体克隆技术 ,建立骨骼肌细胞乙酰胆碱受体 (m nAChR)的实验模型 ,以便进行各种药理研究。方法 应用分子生物学技术将编码小鼠m nAChR的α、β、γ、δ、ε亚基之cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3 1+ 上 ,用脂质体转染技术 ,将重组后的pcDNA3 1+ 导入HEK2 93细胞 ,使其细胞膜上表达胚胎型乙酰胆碱受体 (γ nAChR)和成年型乙酰胆碱受体 (ε nAChR) ,这样建立了两种m nAChR亚型的实验模型。应用全细胞膜片钳技术测量转染细胞对该受体的内生配基乙酰胆碱的反应。结果 乙酰胆碱可激发转染细胞产生一内向电流 ,电流的大小与乙酰胆碱呈浓度依赖性。结论 HEK2 93细胞在转染后 2 4~ 72h内 ,其细胞膜上表达γ nAChR或ε nAChR ,用于进行各种药理实验。  相似文献   

11.
以往认为阿片受体以单聚体与G蛋白发生相互作用,其比例是按1:1偶联。然而,近年来随着G蛋白偶联受体克隆的成功及其特异性抗体的出现,关于阿片受体二聚化出现了大量报道,用Western印迹法分析异源细胞表达系统,已证明有免疫反应性复合体,而这些复合体相当于阿片受体(μ,k,δ)单体、二聚体、高级寡聚体。  相似文献   

12.
用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。  相似文献   

13.
作为一类经典镇痛药物,阿片类药物在临床广泛使用。已有大量研究阐述了阿片受体的功能,除调节疼痛、依赖和情绪外,阿片受体还介导多种生理效应,影响机体正常生理及病理活动。已发现4种主要的阿片受体亚型(μ,δ,κ和ORL1),它们在作用特点和脑区分布上存在显著差异,这决定了其所介导生物效应的不同。基于阿片受体不同亚型功能的差异,开发相应特异性靶向药物已成为药物研发的新方向。本文综述了基于阿片受体亚型的药物研究进展,并展望了其发展前景。  相似文献   

14.
激动剂诱导的受体的磷酸化、内化和细胞内的运输是调控细胞表面G蛋白偶联受体的应答以及细胞内信号转导的关键,而关于受体磷酸化调控受体细胞内分选的具体机制尚不清楚。阿片受体是一类重要的G蛋白偶联受体,它的激活和信号转导可以调控许多重要的生理功能,如镇痛,应激,免疫应答等,同时它还是内源性的阿片肽以及许多阿片类药物发挥作用的生理靶位点。我们采用HEK293细胞,  相似文献   

15.
目的 探讨中华眼镜蛇毒(Naja NaBAtra)神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响.方法 PC12细胞分为正常对照组和给药组,采用Western blot方法检测各组PCI2细胞κ阿片受体蛋白质的表达.结果 ①nNGF的25、50、100 μg·L-13个剂量中,50和100μg·L-1nNGF下调PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达,50μg·L-1剂量组下调最明显(P<0.01),100 μg·L-1剂量组下调(P<0.05).②50μg·L-1nNGF分别处理PC12细胞1、3、5、7、10 d后,其κ阿片受体蛋白质表达呈降低趋势,其中d 5、7下调(P<0.05),d 10下调明显(P<0.01).③10μmol·L-1吗啡可上调PC12细胞κ阿片受体蛋白表达,而10 μmol·L-1纳络酮对其无影响,二者分别都能逆转nNGF的下调效应,但是二者共存时不能逆转nNGF的下调效应.结论 nNGF诱导PC12细胞分化中,可引起PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的下调效应,该效应能被吗啡或纳络酮逆转,但二者共存不能被逆转效应.  相似文献   

16.
目的:构建人趋化因子受体6(CCR6)cDNA序列的真核表达载体,并了解其在HEK293细胞中的表达。方法:提取人淋巴结总RNA,通过逆转录PCR扩增出CCR6基因片段,并构建真核表达载体pcDNA3,1(+)-CCR6;重组载体通过脂质体转染HEK293细胞,免疫荧光法鉴定CCR6的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有CCR6编码序列.转染实验表明重组质粒能在HEK293细胞中表达出具有活性的CCR6片段。结论:CCR6真核表达载体构建及表达成功,为下一步CCR6拈抗剂的筛选奠定了基础。  相似文献   

17.
目的研究激活小胶质细胞上的α7-烟碱型乙酰胆碱受体对减少由于β-淀粉样蛋白1-42沉积所致的慢性炎性反应对神经元毒性作用。方法取孕18 d的胎鼠大脑皮质做原代神经元的培养,选用微管相关蛋白-2与神经元特异性烯醇化酶作为神经元特异性标志物,用免疫细胞化学技术对神经元进行鉴定。培养10 d的神经元与小胶质细胞共同培养于带有膜插件的培养皿中。试验分空白对照组、β-淀粉样蛋白组、共培养组、烟碱预处理组,各组添加β-淀粉样蛋白1-42共培养96 h后,用流式细胞仪及免疫荧光法检测神经元的凋亡率。结果体外培养10 d的神经元,用免疫荧光及DAB显色鉴定神经元均能显色,细胞纯度达到了94.49%。激活组与未激活组相比神经元的凋亡率明显下降(P<0.05)。结论激活小胶质细胞上的α7-烟碱型乙酰胆碱受体能减少β-淀粉样蛋白介导的神经元凋亡,对神经元产生保护作用。  相似文献   

18.
目的:从细胞水平探讨LPK-26对κ受体的作用及分子机制。方法:通过[3H]-Dip和[35S]GTPγS放射性结合实验研究LPK-26对CHO细胞上稳定表达κ阿片受体的竞争性受体结合特征及LPK-26对κ阿片受体偶联的G蛋白的激活。结果:LPK-26是一种κ阿片受体激动剂,其Ki值是0.66 nmol.L-1,与U50,488H相似;并且通过[35S]GTPγS结合实验,LPK-26激活G蛋白的能力明显大于U50,488H。结论:LPK-26可能是一种较为理想的新型镇痛药物。  相似文献   

19.
目的:构建副黏病毒Tianjin株NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,经G418筛选出稳定表达NP蛋白的细胞.方法:应用RT-PCR技术克隆副黏病毒Tianjin株NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经PCR、酶切和测序鉴定后,将构建的pcDNA3.1(+)-NP用LipofectaminenTM2000转染试剂转染HEK293细胞.应用免疫荧光法及Western Blot检测NP蛋白的瞬时和稳定表达.结果:RT-PCR扩增得到NP基因,重组质粒pcDNA3.1(+)-NP转染HEK293细胞后,经免疫荧光法检测到目的蛋白的瞬时和稳定表达.Western Blot法可见NP蛋白瞬时和稳定表达的条带.结论:副黏病毒Tianjin株NP基因在HEK293细胞可以瞬时和稳定表达,为研究副黏病毒Tianjin株NP蛋白功能与病毒致病性、宿主亲嗜性奠定了基础.  相似文献   

20.
目的:检测人类血栓素α受体(TPα)C端丝氨酸/苏氨酸残基的各种两氨酸诱变体作为PKC底物的能力,以确定被PKC磷酸化和脱敏的特异的丝氨酸/苏氨酸残基.方法:为了易于鉴定被磷酰化的细胞内区段,使用甘胱甘肽S-转移酶(GST)-细胞内区段融合蛋白作纯化的PKC底物,然后突变磷酰化蛋白的cDNA,以找出TPα被PKC磷酰化的主要部位,并将有组氨酸尾野生型或诱变型血栓素受体α稳定地转移到人类胚胎肾(HEK)293细胞,以研究该受体的磷酸化和脱敏.结果:仅C-端能充当纯化PKC底物.丝氨酸-331(mP4)被显示强的磷酰化,丝氨酸-324(mP1)则轻微磷酰化,丝氨酸-329(mP3)则微弱磷酰化,而其它丝氨酸/苏氨酸残基没被发现磷酰化.佛被醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸盐(PMA)诱导表达野生型TPα的HEK 293细胞磷酰化.然而不能显示触发表达丝氨酸331丙氨酸诱变受体的HEK 293受体磷酸化.用PMA预处理表达野生型受体的HEK 293细胞能抑制I-B0P诱导Ca~(2 )释放,然而用PMA预处理表达诱变受体的细胞不能中止I-BOP抑制Ca~(2 )释放.结论:丝氨酸331是TPαa磷酰化和脱敏的主要和关键部位.  相似文献   

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