miR-23c靶向调控MTDH抑制胶质瘤U87细胞增殖迁移与侵袭

目的探讨miR-23c对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响及初步机制。方法将miR-23c mimics转染于U87细胞中,用miR-无关序列转染于U87细胞做为Control组,采用MTT法、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-23 c对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用生物信息学软件分析miR-23c潜在的靶基因;采用Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测miR-23c对靶基因的调控作用;在转染miR-23c mimics的基础上同时转染MTDH质粒,通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察转染MTDH对miR-23c抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 MTT实验显示,miR-23 c组U87细胞的OD值为(0. 668±0. 032),明显低于Control组的(1. 031±0. 060)(P 0. 01);细胞划痕实验显示,miR-23c组细胞划痕愈合率(0. 35±0. 02)明显低于对照组的(0. 59±0. 03)(P 0. 01); Transwell侵袭实验显示,miR-23 c组U87细胞穿过基质胶的细胞数(153. 2±8. 30)明显低于与对照组的(348. 4±12. 12)(P 0. 01); Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测表明MTDH是miR-23 c直接调控的靶基因; MTT实验显示,miR-23 c+MTDH组U87细胞的OD值为(1. 025±0. 059),明显高于miR-23 c组的(0. 672±0. 024)(P 0. 01);细胞划痕实验显示,miR-23 c+MTDH组细胞划痕愈合率为(0. 45±0. 04),明显高于miR-23 c组的(0. 31±0. 03)(P 0. 05); Transwell侵袭实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞穿过基质胶的细胞数(260. 9±10. 23),明显高于miR-23c组的(148. 4±9. 4)(P 0. 01)。结论上调miR-23 c能明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与其下调MTDH表达有关。     

SNAI2与E-cadherin参与LRIG1对U251细胞侵袭与转移的抑制作用

目的 探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）对人脑胶质瘤U251细胞侵袭与转移及U251细胞SNAI2、E-cadherin表达的影响。方法 传代培养U251细胞,随机分为空白对照组、LRIG1空载体组、LRIG1过表达组、LRIG1低表达组、LRIG1低表达阴性对照组,应用脂质体介导的基因转染技术分别转染PBS、PEGFP-N1-U251质粒、PEGFP-LRIG1-U251质粒、LRIG1-siRNA、LRIG1-NC-siRNA。应用PCR、Western blot检测细胞LRIG1、SNAI2、E-cadherin mRNA和蛋白表达水平,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞转移能力。结果 LRIG1过表达组U251 SNAI2表达下调（P<0.05）,E-cadherin表达上调（P<0.05）,细胞侵袭与转移能力明显下降（P<0.05）。LRIG1低表达组U251细胞SNAI2表达上调（P<0.05）,E-cadherin表达下调（P<0.05）,细胞侵袭与转移能力明显提高（P<0.05）。结论 上调LRIG1可抑制U251细胞侵袭与转移,而敲除LRIG1可明显促进U251细胞侵袭与转移,SNAI2及E-cadherin可能参与其调节过程。     

CXCR4在胶质瘤细胞中的表达及对迁移的影响

目的 检测趋化因子受体CXCR4在胶质瘤细胞的表达。建立侵袭迁移模型,分析CXCR4在CXCL12作用下对U251细胞迁移的影响机制。方法 间接免疫荧光法检测CXCR4在U251的表达。流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测不同病理级别胶质瘤CXCR4的表达。建立琼脂糖下细胞迁移（Under-agarose cell migration assay）模型,研究U251在不同浓度CXCL12下的侵袭能力。设空白组与实验组,实验组以CXCL12浓度分5组。计算趋化系数（chemotaxis coefficient,cc）。结果 ①CXCR4表达于U251细胞。②Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级别胶质瘤CXCR4表达率分别为21.36±2.70%、26.39±4.27%、52.59±2.37%、56.23±1.24%。四个级别胶质瘤CXCR4的阳性率均有显著差异（P<0.05）。③对照组细胞迁移距离为40.85±5.16μm,实验组细胞迁移距离分别为49±2.26μm、105.6±3.82μm、165.3±3.89μm、245.4±5.94μm、161.45±3.18μm。因子浓度为200~500ng/ml时与阴性组相比细胞发生明显迁移（P<0.05）。结论 ①胶质瘤细胞U251表达CXCR4。②胶质瘤的病理级别越高CXCR4的阳性率越大。③成功建立了胶质瘤细胞琼脂糖下侵袭模型,为研究肿瘤细胞迁移提供新的方法;CXCL12对胶质瘤有明显的趋化作用,肿瘤细胞顺因子浓度梯度定向迁移。     

miR-370-3p对胶质母细胞瘤U87-MG细胞株增殖能力的影响

目的 探讨微小RNA-370-3p（miR-370-3p）对人脑胶质瘤细胞系U87-MG增殖能力的影响及其机制。方法 将常规培养的U87-MG细胞分为空白组、无义序列转染组和模拟物转染组,后两组分别转染miRNA无义序列及miR-370-3p模拟物,qRT-PCR法检测其转染效率,免疫印迹法检测转染细胞叉头框蛋白M1（FoxM1）的表达;采用EdU法评估细胞的增殖能力,采用平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果 与空白组和无义序列转染组比较,模拟物转染组细胞miR-370-3p表达显著增加（P<0.05）,而FoxM1的蛋白表达显著减少（P<0.05）;而且模拟物转染组U87-MG细胞增殖能力及克隆形成率均明显减少（P<0.05）。结论 miR-370-3p能够抑制U87-MG细胞的增殖能力,可能与减少FoxM1的表达有关。     

抑制miR-301a对胶质瘤U87细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的探讨抑制miR-301a对胶质瘤U87细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法体外培养人脑胶质瘤U87细胞,将细胞分为空白对照组、阴性转染组(阴性序列转染U87细胞)、miR-301a抑制剂转染组(miR-301a抑制剂转染U87细胞)。采用MTT法检测各组细胞的增殖;平板细胞克隆形成实验检测菌落形成;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;RTPCR法检测细胞中miR-301a、PTEN mRNA表达;Western blot检测细胞PTEN、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Caspase-9蛋白表达。结果与空白对照组、阴性转染组比较,miR-301a抑制剂转染组转染后不同时间点的细胞抑制率均升高,呈时间依赖性(均P0.05)。miR-301a抑制剂转染组的菌落数量明显降低,迁移距离短,细胞迁移、侵袭数量明显降低,细胞凋亡率升高(均P0.05);miR-301a mRNA表达水平降低,PTEN mRNA表达水平升高;PTEN、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平降低(均P0.05)。结论抑制miR-301a的表达,可抑制胶质瘤U87细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进胶质瘤U87细胞凋亡。     

miR-137调控人脑胶质瘤细胞增殖侵袭能力的体内外研究

目的探讨miR-137调控人脑胶质瘤细胞的增殖侵袭性生长能力及其机制。方法采用实时PCR分析miR-137在不同品系胶质瘤细胞及不同级别胶质瘤样本中的表达;脂质体介导miR-137模拟物转染胶质瘤细胞,实时PCR检测转染后miR-137的表达;应用MTT法、流式细胞术评价细胞生长和增殖的生物学特征变化;划痕实验、transwell细胞体外迁移实验检测肿瘤细胞迁移、侵袭能力;动物实验评价体内条件下肿瘤生长能力变化;Western blot、免疫组织化学染色检测肿瘤细胞Ki-67、MMP9表达水平。结果实时PCR分析显示：miR-137在胶质瘤中低表达。miR-137模拟物转染LN229和U87细胞后,实时PCR显示：miR-137表达上调;MTT法及流式细胞术显示细胞生长受抑,出现G0/G1期阻滞;划痕实验及transwell实验证实：细胞迁移侵袭能力下降;进一步Western blot、免疫组织化学染色显示：增殖侵袭相关蛋白Ki-67、MMP9表达降低;动物实验反映：肿瘤细胞生长受抑制。结论 miR-137高表达可抑制胶质瘤细胞生长和侵袭能力,提示miR-137可作为基因治疗脑胶质瘤的候选靶点。     

microRNA134对胶质瘤U87细胞增殖及侵袭的影响

目的研究微小RNA-134(miRNA-134)对人脑胶质瘤细胞系U87在侵袭、迁移方面的作用并探讨可能的作用机制。方法通过人工合成miR-134 mimic瞬时转染脑胶质瘤细胞系U87,实时定量荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞miR-134的表达水平;并通过四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;Transwell小室法检测各组U87细胞株迁移和侵袭能力;实时定量荧光PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测各组基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达水平。统计学数据处理釆用SPSS 19.0软件处理,组间比较采用单因素方差分析,P0.05有统计学意思。结果荧光显微镜下观察转染效率90%以上,实时定量荧光PCR结果显示与未处理的空白对照组(control)及空白转染组(Mock)比较,miR-134转染组的miR-134表达水平明显上调,可达到对照组的5~6倍(P0.05);MTT实验结果表明miR-134转染组细胞增殖能力明显下降(P0.05),同时Transwell实验也显示miR-134转染组细胞的迁移能力明显降低(P0.05);实时定量荧光PCR及Western blot分析MMP-3表达情况发现,过表达miR-134可以明显减少MMP-3基因及蛋白的表达水平(P0.05)。结论本研究表明miR-134能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖及侵袭迁移能力,其机制可能与抑制MMP-3的表达有关,提示miR-134可能成为胶质瘤治疗的新靶点。     

甲状腺激素受体β 1在非典型脑膜瘤的表达及其作用研究

目的 研究甲状腺激素受体β1（TRβ1）和非典型脑膜瘤的关系及其作用。方法 通过real-timePCR和免疫组化分别对良性脑膜瘤和非典型脑膜瘤中的TRβ1进行检测;同时我们在体外进行原代脑膜瘤细胞培养,并通过MTT检测TRβ1对非典型脑膜瘤细胞的影响。结果 TRβ1mRNA在非典型脑膜瘤中的表达低于良性脑膜瘤,没有统计学意义（P>0.05）;但TRβ1阳性细胞在非典型脑膜瘤为平均40.75个/mm²低于良性脑膜瘤93个/mm²,有统计学意义（P<0.05）。而在体外实验中,T3干预可有效抑制非典型脑膜瘤细胞的增殖,在浓度为20 ng/ml时MTT OD值由对照组0.24±0.028下降到0.17±0.008,抑制作用明显,具有统计学意义（P<0.05）,而在siRNA沉默TRβ1蛋白的表达后,可有效减弱T3对细胞的抑制作用。结论 TRβ1在非典型脑膜瘤上的表达下降,在被其配体T3激活后可有效抑制非典型脑膜瘤细胞增殖。提示TRβ1可能在非典型脑膜瘤的发生及生长过程中扮演着重要角色。     

既定训练动作的广场舞对帕金森患者认知功能障碍的疗效观察

目的 研究既定动作的广场舞训练对轻至中度帕金森患者认知功能障碍的疗效。方法 收集80例轻至中度帕金森患者,依照随机分配原则分为治疗组和对照组,各40例。两组患者均接受常规治疗,并且每半个月提供一次时间为1 h的非运动性健康教育课程。治疗组患者学习特定动作,按规定时间进行训练;对照组密切观察病情变化。干预前后均应用简易精神状态检查量表（MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（MoCA）对两组患者认知状况进行评分。结果 干预6个月后,治疗组患者MoCA得分（23.23±2.17）、MMSE得分（23.25±2.34）分别高于干预前（19.93±2.97）,（19.95±3.19）,差异有统计学意义（P<0.05）;且治疗组MoCA得分、MMSE得分高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 既定动作的广场舞训练对改善帕金森患者认知功能障碍有效。     

RNAi对U251细胞c-Met基因表达水平的影响

目的 探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤U251细胞c-Met基因表达的影响。方法 设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,pGenesil-1质粒为载体,构建pGenesil-1/c-Met-shRNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤U251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建pGenesil-1-c-Met shRNA重组质粒,并转染至U251细胞。转染重组质粒的U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 RNA干扰能明显降低U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。     

脑深部电刺激治疗对帕金森病患者认知功能、抑郁和焦虑的影响

目的探讨双侧丘脑底核脑深部电刺激治疗(STN-DBS)对帕金森病(PD)患者认知功能和抑郁、焦虑状态的影响。方法连续收集16例拟行双侧STN-DBS的PD患者为实验组,在术前1周、术后1月和术后3月行认知功能、抑郁和焦虑状态评估。同期在门诊收集16例优化药物治疗的PD患者为对照组,在相同时间点行同样的神经心理量表评估。结果实验组患者的Mo CA评分与术前(20.69±4.33)相比,在术后1月(19.81±4.34)及术后3月(19.44±5.35)均有下降趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。实验组患者的抑郁症状与术前(23.56±14.60)相比,在术后1月(11.94±6.16)及术后3月(7.38±5.18)有明显改善(P0.05)。实验组患者的焦虑症状与术前(22.13±6.11)相比,在术后1月(15.13±5.62)及术后3月(8.00±6.76)有明显改善(P0.05)。抑郁焦虑的改善在任何时期均与UPDRS-Ⅲ无相关性(P0.05)。结论双侧STN-DBS治疗在术后3月时并不影响PD患者的总体认知功能,但各个认知域的改变需要更为详细的神经心理量表评估;双侧STN-DBS治疗在短期内可以显著改善PD患者的抑郁和焦虑症状,且抑郁和焦虑症状的改善与STN-DBS治疗后运动症状的改善无关。     

百日咳毒素减轻脑缺血后神经元钙内流的实验研究

目的探讨百日咳毒素(PTx)对缺血性脑卒中后神经元的保护作用及其可能的机制。方法将C57BL6小鼠用大脑中动脉闭塞(MCAO)法建立卒中模型,随机分为两组,每组12只鼠。实验组卒中后予PTx 1000 ng溶于1 ml生理盐水腹腔注射干预;对照组予1 ml生理盐水腹腔注射。24 h后行TTC染色检测梗死面积,并行免疫组化检测细胞凋亡。在体外培养原代神经元,用谷氨酸兴奋刺激模拟卒中后神经元损伤模型。用MTT及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测PTx对谷氨酸兴奋刺激后神经元的存活和损伤情况。然后,检测PTx对谷氨酸诱导神经元钙离子内流的影响。结果 PTx治疗可减小卒中后小鼠脑梗死面积,使之由(51±11)%降至(34±8)%(P0.05)。免疫组化发现PTx可使脑内Caspase-3阳性细胞数由(677.7±117.8)个/mm2减少至(297.5±83.6)个/mm2(P0.05),且较少细胞凋亡。体外结果提示,PTx可增加谷氨酸刺激后神经元的存活率,使MTT吸光值由(0.618±0.06)提升至(1.1±0.12)(P0.05);同时,PTx还可减少LDH的释放,使吸光值由(1.31±0.11)降低至(0.76±0.08)(P0.05)。PTx可减缓和减少钙离子进入神经元,经PTx治疗后钙内流可由基础值的5倍降低至基础值的2~3倍,且钙离子内流达到半峰值浓度的时间也由(18.5±2.5)s延长至(85.4±10.2)s。结论百日咳毒素可减少卒中后钙离子内流到神经元,继而减少神经元损伤,减小梗死面积。     

血清高迁移率族蛋白B1及胶质纤维酸性蛋白水平预测新生儿缺氧缺血性脑病预后的价值

目的探讨血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平对预测新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)预后的价值。方法选取儋州市人民医院收治的HIE患儿115例,根据其预后情况分成存活组(87例)和死亡组(28例)。采用神经症状临床分度分为轻-中度组80例和重度组35例,比较各组第1天、第3天、第5天血清HMGB1及GFAP水平变化。应用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清HMGB1及GFAP水平对预测HIE患儿死亡的价值。结果死亡组在第1天、第3天、第5天血清HMGB1水平[(9. 35±3. 24)μg/L,(13. 60±4. 18)μg/L,(18. 64±6. 95)μg/L]及GFAP水平[(152. 80±44. 72) ng/L,(186. 24±53. 40) ng/L,(227. 50±64. 38) ng/L]均明显高于存活组相应时间点的HMGB1水平[(5. 80±2. 16)μg/L,(6. 12±2. 28)μg/L,(4. 70±1. 82)μg/L]及GFAP水平[(103. 60±31. 52) ng/L,(120. 38±34. 75) ng/L,(115. 60±32. 42) ng/L],差异有统计学意义(P 0. 05);且死亡组血清HMGB1及GFAP水平随时间推移呈升高趋势(P 0. 05)。重度组在第1天、第3天、第5天血清HMGB1水平[(9. 14±3. 15)μg/L,(12. 75±3. 84)μg/L,(16. 90±6. 42)μg/L]及GFAP水平[(145. 20±40. 83) ng/L,(172. 80±48. 63)ng/L,(213. 80±62. 42) ng/L]均明显高于轻-中度组相应时间点的HMGB1水平[(6. 38±2. 37)μg/L,(6. 63±2. 40)μg/L,(5. 82±2. 14)μg/L]及GFAP水平[(112. 73±33. 60) ng/L,(131. 46±36. 72) ng/L,(124. 73±34. 58)ng/L),差异有统计学意义(P 0. 05);且重度组血清HMGB1及GFAP水平随时间推移呈升高趋势(P 0. 05)。ROC曲线显示,第3天血清HMGB1水平联合GFAP水平预测HIE患儿死亡的曲线下面积最大(0. 926,95%CI:0. 862～0. 974),其敏感度和特异度为93. 0%和87. 3%。相关分析显示,死亡组血清HMGB1水平与GFAP水平呈正相关(r=0. 806,P 0. 01)。结论血清HMGB1及GFAP水平升高与HIE患儿的病情严重程度相关,第3天两项联合检测预测HIE患儿预后的价值较高。     

脑脊液中细胞源性囊泡对间充质干细胞向神经前体细胞分化的影响

目的探讨脑脊液微囊泡在间充质干细胞(MSCs)向神经干细胞分化中的作用。方法从人脑脊液中分离微囊泡,从小鼠骨髓中分离原代MSCs。将MSCs传代后在神经分化诱导培养基和脑脊液微囊泡作用下神经分化诱导。细胞形态学观察细胞突起数目和长度,western blot检测细胞神经特异性蛋白表达水平变化。结果单纯神经诱导液组单位面积内细胞突起长度为(2.2±0.4)mm,突起数量为(94±12)个;神经诱导液加脑脊液微囊泡诱导的细胞中细胞突起更长(5.7±1.2)mm,数目也更多(178.2±32)个,差异具有统计学意义(P0.01)。微囊泡组细胞中NSE、Nestin和MAP-2表达水平高于单纯神经诱导液组细胞,差异具有统计学意义(P0.01)。结论脑脊液微囊泡可有效促进MSCs向神经干细胞分化,有望为干细胞移植治疗神经功能缺损提供了一个新的思路。     

桂皮醛对脑缺血小鼠的脑保护作用及对Toll样受体6/核因子-κB信号通路的影响

目的探讨桂皮醛对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用及机制。方法雄性CD-1小鼠通过腹腔注射的方法给予桂皮醛干预,应用改良线栓法建立小鼠右侧永久性大脑中动脉闭塞模型,将成年健康雄性CD-1小鼠随机分为大脑中动脉闭塞(MCAO)组及桂皮醛(CA)低、中、高剂量干预组,即CA25组、CA50组和CA75组(在MCAO小鼠模型基础上腹腔给予25 mg/kg、50 mg/kg及75 mg/kg桂皮醛)。术后24 h通过测定小鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织含水量来评价桂皮醛的脑保护作用。通过Western blot法和实时荧光定量PCR法测定Toll样受体6(TLR6)、肿瘤坏死因子受体相关分子6(TRAF6)和核因子-κB(NF-κB)在脑组织中的表达。结果与MCAO组相比,CA50组神经功能评分显著改善(中位数2.0 vs.3.5),病变侧脑组织含水量降低[(83.72±0.73)%vs.(85.09±0.95)%],脑梗死体积缩小(0.45±0.06 vs.0.54±0.02),均P0.05。同样与MCAO组相比,CA50组TLR6、TRAF6及NF-κB基因表达明显下调(TLR6:3.26±0.03 vs.6.32±0.07;TRAF6:1.88±0.21 vs.3.33±0.48;NF-κB:1.47±0.33 vs 4.21±0.57,均P0.05)。TLR6、TRAF6及胞核NF-κB蛋白表达明显下降(TLR6:0.12±0.01 vs.0.19±0.03;TRAF6:0.45±0.09 vs.0.67±0.07;胞核NF-κB:0.32±0.06 vs.0.46±0.06,均P0.05)。结论桂皮醛可能通过抑制TLR6/TRAF6/NF-κB通路对局灶性脑缺血小鼠发挥脑保护作用。     

影响老年额叶胶质瘤认知功能的因素及手术治疗对认知功能的影响

目的探讨手术干预是否影响老年额叶胶质瘤患者认知功能。方法前瞻性分析于首都医科大学附属北京天坛医院行手术治疗的33例老年额叶胶质瘤患者的临床资料。在术前、术后1周、术后3月指导患者完成Mo CA、MMSE认知评估量表。采用独立样本t检验、成对样本t检验及多因素回归分析认知功能变化。结果入组患者的Mo CA、MMSE评分与术前相比,在术后1周及术后3月的下降无统计学意义(P 0. 05)。在术前,高级别胶质瘤组的Mo CA、MMSE评分(15. 33±5. 723)、(20. 444±5. 0028)低于低级别胶质瘤组(21. 58±6. 178)、(25. 167±4. 8245)(P 0. 05)。复发胶质瘤组(13. 14±4. 259)、(19. 000±4. 0415)低于首发胶质瘤组(21. 69±5. 945)、(25. 192±4. 7835)(P 0. 05)。在术后1周,延迟回忆能力较术前下降(P 0. 05)。术后3月,延迟回忆能力较术前及术后1周明显改善,计算力较术后1周改善(P 0. 05)。结论手术治疗后患者总体认知功能未出现恶化。复发和高级别胶质瘤导致更严重的认知功能障碍。在术后3月,延迟回忆能力及计算力较术前改善。