血小板受体C型凝集素样受体2在巨核细胞自噬中的作用

目的：用C型凝集素样受体?2（C?type lectin like receptor 2,CLEC?2）缺陷小鼠检测CLEC?2在自噬过程中的作用,从而探究CLEC?2信号通路对巨核细胞发育的影响。方法：怀孕14.5 d的小鼠胚胎取出、分离并培养巨核细胞。体外雷帕霉素处理巨核细胞,检测巨核细胞CLEC?2和CD41的表达。小鼠经雷帕霉素处理后,检测小鼠骨髓自噬蛋白的表达。结果：自噬基因在胎肝来源的巨核细胞中表达,并且表达量很高。小鼠巨核细胞在雷帕霉素处理后,CLEC?2表达下调,提示CLEC?2参与调控自噬。雷帕霉素处理后,与野生型小鼠相比,敲除小鼠的巨核细胞CD41和CD61蛋白表达明显降低（P < 0.001）。体内实验发现雷帕霉素能显著增强敲除小鼠LC3蛋白的表达。CLEC?2的缺陷能显著降低自噬紊乱导致的高倍体巨核细胞数。CLEC?2的缺陷降低雷帕霉素诱导胎肝来源的巨核细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin D2的表达。结论：血小板受体CLEC?2在巨核细胞自噬中具有重要的调控作用。     

小鼠各期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白的动态表达及其亚细胞定位

目的：检测小鼠各期卵母细胞中血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3 (SGK3) mRNA和蛋白的表达及其亚细胞定位,为阐明SGK3对小鼠卵母细胞周期变化的调控作用机制提供依据。方法：通过超排卵技术收集小鼠生发泡（GV）期、生发泡破裂（GVBD）期、第1次减数分裂（MⅠ）期卵母细胞和第2次减数分裂（MⅡ）期卵母细胞,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和Western blotting法检测各期小鼠卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平,收集GV、GVBD和MⅠ期卵母细胞后采用Western blotting法检测小鼠各期卵母细胞中Cdc25B-Ser30的磷酸化表达情况,免疫荧光法观察小鼠各期卵母细胞中SGK3亚细胞定位情况。结果：在小鼠各期卵母细胞中均有SGK3mRNA和蛋白表达。与GV期比较,GVBD和MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.01）;与GVBD期比较,MⅠ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.01）,MⅡ期卵母细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.01）;与MⅠ期比较,MⅡ期卵母细胞中SG...     

雄激素对卵母细胞生长分化因子

通过观察雄激素对小鼠卵母细胞生长分化因子 9（growth differentiation factor 9,GDF 9）表达的影响，研究GDF 9参与卵泡生长发育及其表达调控机制，探讨GDF 9与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系。方法：以性成熟昆明小鼠为研究模型，体内实验分为实验组（注射丙酸睾丸酮）和对照组（注射等体积的生理盐水），每组各20只小鼠，采用原位杂交法检测卵巢组织GDF 9 mRNA的表达水平。体外实验：胶原酶消化加机械法分离性成熟昆明小鼠卵泡进行体外培养，实验组培养液中加睾丸酮,对照组不加睾丸酮,72?h后收集卵泡，免疫组化检测卵母细胞GDF 9的表达水平。结果：体内实验：实验组较对照组卵巢组织GDF 9 mRNA表达水平降低, 差异有统计学意义（P＜0.05）；体外实验：实验组卵母细胞GDF 9蛋白表达较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：雄激素减弱卵母细胞GDF 9 mRNA和蛋白的表达强度；表达强度降低的GDF 9可能与PCOS卵泡发育停滞有关     

雷帕霉素对白血病SUP-B15细胞株HIF-1α、VEGF表达的影响

目的:观察雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞的生长及HIF-1α、VEGF表达的影响.方法:实验分为雷帕霉素处理组和对照组,雷帕霉素处理组以含不同终浓度雷帕霉素( 10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/C)的IMDM培养处理,对照组以相同体积细胞IMDM培养液培养,并于处理后24 h、48 h、72 h观察各组细胞形态,实时荧光定量PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达.结果:雷帕霉素处理后SUPB15活细胞数量减少,死细胞数量增加,可见细胞抱团生长、胞膜出泡、细胞破碎等现象,随药物浓度升高和作用时间增加变化程度明显.瑞氏染色观察可见,雷帕霉素处理组早期无明显变化,处理后期(72 h)细胞出现明显空泡样改变,并呈浓度依赖关系;雷帕霉素处理组细胞HIF-1α mRNA的表达在24h变化不明显;48 h时,10 nmol/L、100nmol/L雷帕霉素处理细胞HIF-1 αmRNA的表达上调,20 nmol/L、50 nmol/L雷帕霉素处理细胞HIF-1α表达下调;72 h时,各浓度的雷帕霉素对HIF-1αmRNA的表达均呈上调趋势;在雷帕霉素处理后,除较低浓度(10 nmol/L、20 nmol/L)雷帕霉素处理72 h外,SUP-B15细胞的VEGF mRNA表达均呈显著下调.结论:雷帕霉素可抑制SUP-B15细胞生长,导致形态明显改变,并能下调SUP-B15细胞VEGF mRNA的表达.     

不同浓度雷帕霉素对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响

目的 探究不同浓度雷帕霉素对小鼠卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)结局的影响及其在最佳浓度下对卵母细胞质量产生的具体效应。方法 收集雌性ICR小鼠的未成熟卵母细胞(GV期)进行IVM,在培养液中添加不同浓度的雷帕霉素(1 nmol/L～10μmol/L),通过比较成熟率和激活率,筛选最佳作用浓度。随后,在处理组的培养液中加入最佳浓度的雷帕霉素,对处理组与对照组中IVM卵母细胞的激活后发育情况、纺锤体组装、染色体排列情况进行比较。结果 10 nmol/L雷帕霉素培养组的卵母细胞在IVM后呈现出较高的成熟率[(84.5±1.6)%]和激活率[(62.4±1.5)%],故选择10 nmol/L作为添加雷帕霉素的最佳浓度。在随后的培养中,10 nmol/L雷帕霉素组激活胚胎的卵裂率和囊胚形成率也较对照组显著升高[卵裂率：(54.9±2.6)%vs.(41.9±2.1)%,P=0.0178;囊胚形成率：(12.5±1.6)%vs.(6.4±1.4)%,P=0.0441]。此外,与对照组相比,10 nmol/L雷帕霉素组的成熟卵母细胞染色体排列异常率降低[染色体异...     

薄荷醇通过mTOR活化促进人支气管上皮细胞气道炎症相关因子的表达

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活化对薄荷醇诱导的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）气道炎症相关因子表达的影响及其机制。 方法 将细胞分为4组：正常对照组、薄荷醇组、雷帕霉素组、薄荷醇+雷帕霉素组。用CCK-8法检测细胞存活率,实时荧光定量 PCR检测瞬时受体电位蛋白-8（TRPM8）、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-1β mRNA的表达,Western blot检测BEAS-2B 中磷酸化的mTOR（p-mTOR）、TRPM8、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。用流式细胞术检测胞内Ca2+荧光强度。 结果 与正常对照组相比,薄荷醇组中细胞TNF-α和IL-1β mRNA及蛋白表达升高,p-mTOR蛋白表达升高,胞内Ca2+浓度升高（P<0.05）。与正常对照组相比,雷帕霉素组中细胞TNF-α和IL-1β mRNA及蛋白表达均无差异（P>0.05）,p-mTOR蛋白表达降低（P<0.05）,胞内Ca2+浓度无差异（P>0.05）。与薄荷醇组相比,薄荷醇+雷帕霉素组中细胞TNF-α和IL-1β mRNA及蛋白表达降低,p-mTOR蛋白表达降低,胞内Ca2+浓度降（P<0.05）。 结论 薄荷醇可能通过活化mTOR诱导胞内Ca2+浓度升高,进而促进气道炎症相关因子IL-1β和TNF-α的表达。     

Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞纺锤体组装和稳定

目的:确定Synaptotagmin1(Syt1)对小鼠卵细胞纺锤体组装和稳定的影响。方法:免疫荧光法检测Syt1在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位。用紫杉醇处理小鼠MⅠ期卵母细胞,明确Syt1与微管动力的关系。注射Syt1特定的寡聚核苷酸降调卵母细胞中Syt1的表达,免疫荧光法检测Syt1降调后卵母细胞纺锤体的形态变化、染色体异常以及中心体蛋白γ-tubulin定位变化。结果:Syt1在卵母细胞减数分裂成熟的不同发育阶段都有表达,主要集中分布皮质区和MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极。Syt1在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白γ-tubulin共定位。紫杉醇实验发现Syt1集中定位于星体和高度集中的微管两极。降调Syt1表达后,染色体排列紊乱,纺锤体组装异常比例升高,且大多数为无极、单极或者多级纺锤体,其次有拉长纺锤体和形态各异纺锤体。并影响微管组织中心相关蛋白γ-tubulin的正确定位。结论:Syt1可能作为一种微管组织中心相关蛋白调节纺锤体的组装稳定。     

雷帕霉素对大鼠肾缺血再灌注后心肌损伤的作用及机制研究

目的探究雷帕霉素(rapaycin,RAPA)对大鼠肾缺血再灌注(renal ischemia reperfusion,RIR)后远隔器官心脏损伤的影响。方法 40只大鼠随机平均分为四组:空白组、假手术组、RIR组和雷帕霉素处理组,每组10只。雷帕霉素处理组的大鼠接受雷帕霉素灌胃给药。术后24 h处死每组大鼠,收集血液,脾和心脏。测定血浆中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)的水平。用PAS染色半定量分析表示心脏病理损伤程度。TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。流式细胞仪检测NKT细胞数量的百分比。RT-qPCR方法检测CXC趋化因子配体10(CXCL10)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factoR-1α,HIF-1α) mRNA和血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达。结果 RIR组血清BUN值和SCr值高于假手术组。雷帕霉素处理组血清CK值和CK-MB值水平低于模型组。心脏病理损伤的半定量评分表明,雷帕霉素处理组的病理损伤评分明显低于RIR组。雷帕霉素处理组心脏和外周血NKT细胞百分比明显高于RIR组。雷帕霉素处理组脾NKT细胞百分比低于RIR组。雷帕霉素处理组HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达程度低于RIR组。雷帕霉素处理组CXCL10 mRNA的表达水平高于RIR组。结论 RAPA可以显著上调CXCL10的表达水平,促进NKT细胞从脾到外周血在心脏中的集聚。RAPA还可以抑制HIF-1α表达水平从而对RIR后心脏发挥保护作用。     

补肾调经方、逍遥丸对促排卵小鼠排卵前卵巢卵母细胞分泌因子表达的影响

目的探讨补肾调经方、逍遥丸对促排卵小鼠排卵前卵巢中影响排卵率的重要因子卵母细胞分泌因子生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)蛋白及其mRNA表达的影响,分析补肾法、疏肝法诱发排卵可能的分子机制。方法将性未成熟雌性小鼠随机分为对照组、补肾组和疏肝组,均于第3天腹腔注射血促性素(PMSG)5 IU/只、第5天腹腔注射绒促性素(h CG)5 IU/只,补肾组、疏肝组分别灌服补肾调经方(其中第1~3天灌服Ⅱ号方18.70 g/kg,第4~5天灌服Ⅲ号方28.57 g/kg)和逍遥丸(其中第1~3天灌服高剂量2.34 g/kg,第4~5天灌服低剂量1.17 g/kg)促进卵泡发育并诱发排卵,实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组化分析注射h CG后0、8、12h卵巢GDF-9、BMP-15蛋白及其mRNA的表达。结果与对照组比较,补肾调经方、逍遥丸均可使促排卵小鼠在注射h CG后8、12 h GDF-9、BMP-15 mRNA及其蛋白的表达均升高(均P0.05)。结论补肾调经方、逍遥丸通过对促排卵小鼠排卵前卵巢卵母细胞分泌因子GDF-9、BMP-15蛋白及其mRNA表达的影响,促进卵泡颗粒细胞增殖、卵丘扩散、卵母细胞成熟,进而发挥促进诱发排卵的作用。     

白头翁汤对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织mTORC1-STAT3-COX-2信号通路的影响

目的 探讨白头翁汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的可能作用机制。方法 40只C57BL/6雌鼠随机分为空白组、模型组、白头翁汤给药组及雷帕霉素给药组。采用3.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液构建小鼠UC模型。造模同时进行给药处理。白头翁汤组每日给予6.83 g·kg^-1白头翁汤灌胃,雷帕霉素组每日用2 mg·kg^-1雷帕霉素药液进行腹腔注射,空白组和模型组每日给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。记录小鼠每日体质量变化及粪便性状,7 d后处死小鼠。测量结肠长度并观察结肠组织病理学变化。采用流式细胞术检测小鼠血清炎症因子含量,采用免疫印迹法检测结肠组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、转录激活因子3(STAT3)、核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)及其磷酸化蛋白表达,免疫组化法检测结肠组织中磷酸化P70S6K的表达,qPCR检测结肠组织环氧化酶(COX-2) mRNA表达水平。结果 与空白组相比,模型组小鼠体质量减轻,结肠长度缩短、疾病活动指数(DAI)和组织病理学评分升高(P<0.001),血清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子...