微泡超声造影剂:一种新型的药物靶向载体

药物携载是目前重要的研究领域,如何使得药物安全、有效、靶向性地导入体内特定器官、组织并使其释放在靶细胞内是研究的重点.微泡超声造影剂作为一种新型的体内药物载体,受到国内外学者的广泛关注.本文对有关微泡超声造影剂作为药物载体的作用原理、制备要求、制备方法、特点和应用等方面的研究作了介绍.     

一种载基因阳离子微泡超声造影剂的制备及特性研究

目的 制备一种新型的阳离子超声造影剂,评价其理化性质,载基因及体内显影能力.方法 采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备一种阳离子脂质微泡;观察其形态、粒径、表面电位等物理特性,并考察平均粒径及浓度在一定条件下随时间变化情况;检测其载基因量,评价其体内显像效果及对细胞的毒性作用. 结果 所制备的阳离子微泡形态规则,稳定性好,马尔文电位仪测得平均表面电位为(29.02±1.30) mV.与普通脂质微泡比较,阳离子微泡载基因量明显增加,最大基因结合量达4 μg/108个微泡,最大基因结合率为39.2％.对细胞无明显毒性,且体内实验阳离子微泡持续增强兔肝脏显影超过15 min.结论 自制的新型阳离子微泡是一种理想的超声造影剂,并能显著增加基因携带量,可望提高超声靶向微泡破坏技术介导的基因转染效率.     

超声微泡造影剂在基因转移中的应用

大量研究表明,不仅超声照射本身可促进目的基因在体外和体内的转染与表达,而且超声介导的微泡造影剂破坏可进一步增强基因的转染率,其主要机制是空化效应.超声造影剂作为一种新型、无创的基因运载系统具有广阔的应用前景.     

超声联合阳离子微泡造影剂体外增强基因转染

目的探讨超声介导自制阳离子微泡破坏、增强基因转染的效果,并与普通脂质微泡对比,寻找一种更可靠、完善的基因载体工具。方法采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备阳离子微泡,观察其物理特性并检测其体外载基因能力。将微泡和质粒DNA加入人脐静脉血管内皮细胞后分为6组,观测不同微泡浓度对细胞存活率的影响,应用荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测基因转染率,MTT法分析细胞存活率。结果自制阳离子微泡形态规整、分散度好,最大载基因率为39.7%。超声联合阳离子微泡能够增强基因转染,与普通脂质微泡组相比差异有统计学意义;随着微泡浓度增加,细胞损伤增大。结论采用自制阳离子微泡可在体外实现较高效率的基因转染。     

纳米级微泡:一种新的超声造影剂

随着分子生物学技术的发展和延伸,超声分子成像获得了飞速的发展,但由于常规造影剂微泡不能透过血管壁,超声分子成像的研究仅限于血管内的靶分子.最近纳米级微泡超声造影剂的出现为针对肿瘤细胞的超声分子成像带来了希望.本文对纳米级微泡超声造影剂的研究背景、研究现状及下一步的研究与应用进行了综述.     

超声微泡造影剂促进腺病毒载体感染肝细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂促进腺病毒载体感染肝细胞的有效性。方法 将昆明小白鼠分为三组，每组5只，一组经尾静脉输入含腺病毒载体的造影剂1ml，用低频超声波照射至微泡完全消失(约5min)。第二组经尾静脉输入含腺病毒载体的微泡造影剂，不采用超声波照射。第三组既不输入腺病毒载体也不采用超声波照射，用于对照。转基因后第14d，断颈处死小鼠，立即剖腹，取出肝脏，进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察肝组织内荧光蛋白表达情况。结果 以超声触发破坏携带腺病毒微泡方式进行感染的小鼠肝脏中，绝大多数肝细胞均有大量荧光素蛋白表达；而单纯静脉注射腺病毒载体小鼠肝脏中，仅见少数肝细胞中有荧光素蛋白的表达；对照组小鼠肝组织中无荧光素蛋白的表达。结论 利用低频超声波在肝脏局部击碎携带腺病毒的微泡造影剂，有效地提高了腺病毒载体在肝细胞的感染率。     

评价超声联合白蛋白微泡造影剂实现基因转染靶向性的研究

目的 评价超声联合白蛋白微泡造影剂实现基因转染的靶向性.方法 选择增强型绿色荧光蛋白质粒为报告基因,经股静脉输入黏附质粒的白蛋白微泡的同时在大鼠背部脊斜肌区域经皮辅予一定强度的超声照射对大鼠脊斜肌行基因转染,转染7 d后,取脊斜肌、肝、肾、心肌组织快速冷冻切片,荧光显微镜下观察各组织内的荧光表达.结果 脊斜肌组织中可见较多特异性绿色荧光,多位于微血管周围,荧光强度较其余组织明显增强(P<0.05),肝脏、肾脏组织中见少量特异性绿色荧光,肝脏荧光强度约为肾脏的4倍(P<0.05),心肌组织中未见特异性绿色荧光.结论 静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,可以较好地实现基因的靶向转染.     

靶向超声微泡造影剂与超声分子显像

超声分子显像是一门新兴发展的，以靶向超声微泡造影剂为显像剂，能够对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与显像的方法。本文对靶向超声微泡造影剂与超声分子显像的研究现状及发展方向进行了综述。     

超声波与微泡声学造影剂增强基因定位转染动物实验研究

目的观察经静脉注射基因与微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏方式能否增强小鼠肝脏基因定位转染及其转染效率.方法昆明种小白鼠24只,随机分为4组,每组6只.第1组为单纯质粒转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg乙型肝炎核心抗原(pcDNA3.1/HBV)质粒的生理盐水溶液.第2组为单纯微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂.第3组为单纯超声转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的生理盐水溶液,同时采用频率为1 MHz、声强为0.5 W/cm2的超声波经小白鼠体表肝区辐照1 min.第4组为超声与微泡转染组:经尾静脉快速注入2 ml含20 μg质粒的微泡声学造影剂,同时经小白鼠体表肝区局部采用相同剂量超声辐照1 min.7天后处死小鼠,分别取肝、肾、肺、心、脾、骨骼肌组织进行pcDNA3.1/HBV免疫组化检测,记录不同组织每高倍视野(×400)pcDNA3.1/HBV表达阳性细胞数.结果第1、2组肝、肾组织内偶见pcDNA3.1/HBV表达弱阳性细胞,肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达阳性细胞.第3组肝组织内可见少量pcDNA3.1/HBV阳性细胞,每高倍视野表达阳性细胞(26.5±3.9)个.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.第4组肝组织内pcDNA3.1/HBV表达最强,每高倍视野表达阳性细胞(84.2±4.4)个,为第3组的约3.2倍.肾、肺、心、脾、骨骼肌组织未见表达.结论静脉注射黏附质粒的微泡声学造影剂同时经体表给予一定强度的超声辐照,能显著增强辐照部位局部组织的基因转染与表达,有望成为一种安全、高效的体内基因定位转染新技术.     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

Ultrasound targeted microbubble destruction increases capillary permeability in hepatomas

Ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD) has evolved as a promising tool for organ-specific gene and drug delivery. Taking advantage of high local concentrations of therapeutic substances and transiently increased capillary permeability, UTMD could be used for the treatment of ultrasound accessible tumors. The aim of this study was to evaluate if UTMD can locally increase capillary permeability in a hepatoma model of the rat. Furthermore, we evaluated whether UTMD can transfect DNA into such tumors. Subcutaneous Morris hepatomas were induced in both hind limbs of ACI rats by cell injection. A total of 18 rats were divided into three groups. Only one tumor per rat was treated by ultrasound. The first group received injection of Evans blue, followed by UTMD. The second group received a phosphate-buffered saline solution infusion and ultrasound to the target tumor after Evans blue injection. The third group received UTMD first, followed by Evans blue injection. Tumors and control organs were harvested, and Evans blue extravasation was quantified. Another 12 rats received DNA-loaded microbubbles by UTMD to one tumor, encoding for luciferase. Evans blue injection followed by UTMD showed about fivefold higher Evans blue amount in the target tumors compared with the control tumors. In contrast, no significant difference in Evans blue content was detected between target and control tumors when ultrasound was applied without microbubbles or when UTMD was performed before Evans blue injection. Plasmid transfection was not successful. In conclusion, ultrasound targeted microbubble destruction is able to transiently increase capillary permeability in hepatomas. Using naked DNA, this technique does not seem to be feasible for noninvasive transfection of hepatomas.     

超声微泡介导大鼠肾脏β-半乳糖苷酶基因转导

目的 应用超声微泡介导β-半乳糖苷酶基因转导大鼠肾脏,探讨超声微泡介导肾脏基因转导的效率和可行性.方法 Wistar大鼠40只,分为超声微泡质粒组、微泡质粒组、超声质粒组、裸质粒组、超声微泡组和超声PBS组.超声微泡质粒组经肾动脉注射微泡和质粒混合物,并以0.3 W/cm2超声辐照肾脏,转导后3 min、12 h、3 d、7 d取肾和肝、脾等肾外器官;超声质粒组、超声微泡组和超声PBS组给予肾动脉注射质粒、微泡和PBS后超声辐照肾脏,微泡质粒组和裸质粒组仅给予肾动脉注射微泡和质粒混合物,不予超声暴露,转导后12 h取材.冰冻切片行X-gal染色观察肾脏和肾外器官β-半乳糖苷酶基因表达,Megalin免疫组化复染观察转导基因的肾组织定位;PAS染色观察肾组织病理变化;生化检测血AST、ALT、BUN和Cr水平.结果 超声微泡介导质粒转导12 h后大鼠肾组织可见较大量β-半乳糖苷酶基因表达,集中在肾小管,靠近皮质较多,肾小球和肾间质无表达,至7 d时肾小管仍有表达,Megalin免疫组化复染显示β-半乳糖苷酶基因主要在近端小管表达.超声质粒组大鼠肾脏有极微量基因表达,其他四组均无基因表达.各实验组大鼠肝、脾等肾外器官均无基因表达,肾脏PAS染色和血清学检查均无明显病理学变化.结论 超声微泡可有效促进大鼠肾脏基因转导,是一种较为安全有效的基因转导方法.     

超声靶向破坏微泡介导腺相关病毒为载体的基因转染

腺相关病毒(AAV)是相对理想的基因治疗载体,但其转染效率低。超声靶向破坏微泡(UTMD)通过声孔效应、内吞作用和化学作用促进细胞摄取,是简单、易于操作、安全的提高基因转染率的方法。目前UTMD介导AAV为载体的基因转染已用于研究心脏、眼睛和肝脏的基因治疗。本文对AAV载体的转染特点、UTMD介导AAV为载体的基因转染机制及其应用进行综述。     

超声联合微泡增加内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶和一氧化氮生成的体外实验

目的 评估诊断性超声联合微泡对内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及一氧化氮(nitric oxide,NO)生成的增强效应.方法 将正常培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)分为空白对照组(A组)、纯微泡组(B组)、单纯超声组(C组)和超声联合微泡组(D组).其中,D组按条件不同又分为:辐照时间不同组(1 min、5 min、10 min)、机械指数不同组(0.09、0.4、1.0)、微泡浓度不同组(5×10~8/ml、2.5×10~8/ml、1.25×10~8/ml).干预后即刻和干预后24 h分别在光镜下观察细胞形态结构,RT-PCR测细胞eNOS相对表达量,NO试剂盒测培养液中NO水平,并用统计学方法对上述指标进行组间比较.结果 D组中eNOS及NO含量明显较其他三组高;当参数选择为机械指数1.0、微泡浓度2.5×10~8/ml、辐照时间10 min时,D组中eNOS和NO的增加程度最明显;并且干预后即刻和干预后24 h各组细胞及细胞膜形态结构在光镜下均无显著变化.结论 超声联合微泡辐照能增加内皮细胞中eNOS和NO生成;给予的超声及微泡条件不同,其增强效果也不同.     

超声靶向破坏微泡技术的应用进展

随着分子生物学及生物技术的迅速发展,近年来基因治疗的基础研究与应用得到了长足进步。超声靶向破坏微泡(UTMD)是一种靶向、高效、有广阔应用前景的非病毒基因输送技术,其通过诱发细胞膜声孔作用,增加膜通透性,进而有效促进大分子物质的胞内传输,且可避免其他基因传输方法的不良反应。本文对UTMD介导基因或药物传递的应用领域予以综述。     

Microbubble Stability is a Major Determinant of the Efficiency of Ultrasound and Microbubble Mediated in vivo Gene Transfer

In the search for an efficient nonviral gene therapy approach for the treatment of genetic disorders of cardiac and skeletal muscle such as Duchenne muscular dystrophy, ultrasound in combination with contrast enhancing microbubbles has emerged as a promising tool for safe and site-specific enhancement of gene delivery. Indeed, microbubble-enhanced gene transfer (MBGT) has been investigated for a wide variety of target sites using both reporter and therapeutic genes. Although a range of different microbubbles have been used for MBGT studies, comparison of their efficiencies is difficult because microbubble concentration and the ultrasound settings used for the application vary considerably. Only two studies to date have attempted a direct comparison of commercially available microbubbles, and both concluded that not all microbubbles show the same efficiencies with MBGT. Thus far, the reason for this is unclear. Here, the efficiency of three commercially available microbubbles—Optison, SonoVue and Sonazoid—was analyzed to understand the microbubble properties that are important for their function as an effective enhancer for gene transfer in vivo. In this study, plasmid DNA or antisense oligonucleotides were delivered by systemic injection with MBGT, focused on the heart. Gene delivery to the heart with equalized concentrations of the three microbubbles showed that Optison and Sonazoid are more efficient in MBGT compared with SonoVue, which showed the weakest gene transfer to the myocardium. Investigations into the properties of these microbubbles showed that size and shell composition did not directly influence MBGT, whereas the microbubbles with increased stability in an ultrasound field showed better MBGT results than those degrading faster. Moreover, the microbubble concentration used for MBGT was also found to be an important factor influencing the efficiency of MBGT. In conclusion, the stability of a microbubble was shown to be a major influential factor for its performance in MBGT, as is the concentration of the microbubbles used. These findings emphasize the importance of detailed investigations into the properties of microbubbles to allow the production of a microbubble specifically designed for optimum performance with MBGT. (E-mail: d.wells@imperial.ac.uk)     

超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的 对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数.方法 选用 Ishikawa、Hela 和 MCF-7 3种细胞系为研究对象,用1 MHz超声仪.超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光索酶质粒(pCMV-LUC)的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用.结果 基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30 μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同.与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P＜0.01).辐照3 min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间.无超声辐照时,单独应用质粒或微泡十质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白.与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P＜0.01).结论 UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染.     

微泡造影剂联合超声辐照介导的绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究

目的探讨微泡造影剂SonoVue联合超声辐照在介导体内基因转染中的作用。方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒（pEGFP），添加或不添加SonoVue，脉冲多普勒超声辐照（1MHz，2W／cm^2）瘤组织。持续时间1、5、10min，7d后流式细胞仪、荧光显微镜评价pEGFP转染率。HE染色行肿瘤病理学检查。结果SonoVue联合超声辐照组pEGFP的转染率显著高于单纯超声辐照组（P〈0．01）；仅SonoVue与单纯pEGFP2组间转染率无显著差异（P〉0．05）；辐照时间5、10min时pEGFP表达明显高于1min（P〈0．05）。5与10min组间pEGFP表达无显著差异（P〉0．05）。HE染色肿瘤组织无坏死灶出现。结论微泡造影剂联合超声辐照可明显提高基因转染率，且对组织无损害。     

超声微泡造影剂对心肌组织毛细血管通透性的影响实验研究

目的　研究超声破坏微泡造影剂对靶区内心肌组织毛细血管通透性的影响 ;探讨超声微泡造影剂增强基因转染的机制。方法　 2 4只健康雄性 Wistar大鼠 ,取 15只分为 3组 ,第 1组经静脉输入含有伊文思蓝 (Evans blue,EB)的微泡造影剂 ,并采用超声波在鼠胸壁辐照约 6 min破坏心肌组织内造影剂 ;第 2组采用超声照射 ,同时经静脉单纯输入 EB溶液 ;第 3组单纯经静脉输入 EB作为对照。照射完毕 2 h后放血处死大鼠 ,使用标准曲线和分光光度法测量各组大鼠心肌组织中 EB含量 (作为反映血管通透性的指标 )。另 9只大鼠随机分为 3组 ,每组 3只。第 1组经静脉输入微泡造影剂 ,并采用超声波在鼠胸壁辐照约 6 min破坏心肌组织内造影剂 ;第 2组单纯采用超声照射 ;第 3组不加任何处理 ,作为对照。照射完毕即刻处死大鼠 ,取心肌组织进行电镜观察毛细血管的改变。结果　采用超声照射 ,并经静脉输入微泡造影剂的大鼠 ,心肌组织中 EB含量为 (75 .33± 16 .80 )μg/ g,比单纯超声照射[(32 .2 1± 9.5 3)μg/ g]及心肌正常组织 EB含量 [(37.16± 7.98)μg/ g]明显增加 (P<0 .0 5 )。电镜结果显示超声破坏微泡后 ,能使毛细血管破裂 ,红细胞溢出于毛细血管外。结论　超声波触发破坏微泡造影剂后能使心肌组织毛细血管通透性增加 ,可