人MUC1与GM-CSF基因融合真核表达质粒的构建与表达

目的：构建人MUC1重复序列串联体基因与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片段经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。结论：人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒的成功构建,为对其免疫原性、生物学特性及免疫治疗的进一步研究奠定了基础。     

MUC1/Y基因在胃肠道肿瘤中的表达及诱导抗肿瘤免疫

目的 研究MUC1／Y基因异常表达在消化道肿瘤中的临床意义；构建MUC1／YcDNA全长载体，修饰树突状细胞(DC)诱导杀伤细胞治疗消化道肿瘤。方法 采用RT-PCR方法检测标本中MUC1／YmRNA表达。选取8例HLA-A2^ 消化道肿瘤患者，体外诱导DC，以构建的MUCl／YcDNA真核表达载体pcDNA3．1-MUC1／Y修饰DC诱导CTL。通过检测对靶细胞SW620和Raji的杀伤作用和诱导靶细胞凋亡的能力来评价抗肿瘤免疫反应。结果 93．88％肿瘤组织表达较高水平的MUC1／Y。分析表明：消化道肿瘤中MUC1／YmRNA表达与组织学分型、肿瘤生长方式、浸润程度及TNM临床分期有关；与性别、肿瘤发生部位及分化程度无关。pcDNA3．1-MUC1／Y修饰DC诱导的CTL对特异性靶细胞的杀伤活性显著高于对照组，并能有效诱导靶细胞凋亡。结论 MUC1／YmRNA表达在消化道肿瘤组织具有重要意义；经pcDNA3．1-MUC1／Y修饰的DC可有效诱导特异性抗肿瘤免疫应答。     

乙肝核酸疫苗诱导BALB/C小鼠的CTL免疫应答

目的：研究携带HBsAg基因的载体质粒pcDHBs诱导小鼠CTL应答效果。方法：将HBsAg基因连接到真核表达载体pcDNA3．1上，构建成载体质粒pcDHBs。将纯化后的质粒pcDRBs和pcDNA3．1肌肉注射免疫小鼠，眼眶采血检测血清中抗体水平。用质粒pcDHBs转染P815细胞制备乙肝疫苗诱导BALB／C小鼠CTL活性检测的靶细胞。免疫后，取脾细胞，按效靶比为10：1、25：1、50：1进行CIL杀伤检测。结果：免疫pcDHBs疫苗后，检测到小鼠血清中的RBsAb。用pcDHBs进行转染的P815细胞能够检测到HBsAg基因片段和蛋白质抗原的表达。用pcDHBs免疫组小鼠的CTL杀伤率均明显高于pcDNA3．1免疫组。结论：质粒pcDHBs作为核酸疫苗能够诱导小鼠体液免疫应答和CTL免疫应答。     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法：构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真有达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌（以空载体pcDNA3作为对照）,每间隔2wk l次,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCV-C转染并表达HCcAg r S p2/0细胞为靶细胞,采用^51Cr翻译放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果,两个实验免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当前／靶细胞比例为100：1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组（P＜0．01）;pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异（P＞0．05）。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。     

MUC1基因疫苗诱导小鼠特异性CTL和体液免疫应答

目的 :观察MUC1基因疫苗诱导小鼠特异性杀伤性T细胞及体液免疫应答的作用。方法 :采用股四头肌肌肉注射 ,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,每次间隔 3wk ,共 3次。最后 1次免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6乳腺癌细胞进行免疫保护实验。用 4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性 ;免疫组化染色法检测小鼠血清特异性抗体的水平。结果 :在效靶比为 10 0∶1、5 0∶1、2 5∶1、12 .5∶1时 ,MUC1基因疫苗免疫组特异性CTL对EMT6靶细胞杀伤活性分别为 5 4 .1%、39.8%、2 6 .4 %和2 0 .1% ,对照组分别为 13.2 %、10 .0 %、8.2 %、7.2 %和 11.7%、9.8%、7.7%、7.0 % ,前者与后二者差异显著 (P <0 .0 1)。免疫组化染色检测显示 ,人乳腺癌组织MUC1呈染色阳性 ;MUC1基因疫苗免疫组仅见 4 0 % (4/ 10 )的小鼠有肿瘤形成 ,而 pcDNA3.1对照组和生理盐水阴性对照组 10 0 %可见肿瘤形成、生长 ,表明MUC1基因疫苗免疫组小鼠具有一定的免疫保护作用。结论 :MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CTL及体液免疫应答 ,对小鼠体内荷瘤可能具有一定的预防作用     

癌胚抗原基因重组疫苗的构建及免疫效果观察

目的：探讨含癌胚抗原（CEA）部分编码基因的真核重组质粒pIRES-CEAⅢ用于CEA阳性肿瘤免疫治疗可能性。方法：应用基因重组技术构建了含CEA信号肽和Ⅲ区编码序列的真核表达质粒pIRES，CEAⅢ，肌注免疫BALB／c小鼠，再分别应用野生型小鼠肝癌细胞H22及CEAcDNA全序列转染的Hn细胞进行小鼠皮下接种，观察基因重组疫苗对CEA阳性肿瘤的抑制作用及其诱导小鼠细胞毒性T淋巴细胞（CTL）特异性杀伤CEA阳性肿瘤细胞的能力。结果：pIRES-CEAⅢ真核重组质粒免疫组小鼠CEA阳性肿瘤的生长速度趋缓，瘤块较小，与对照组小鼠（免疫空载体质粒和接种野生型H控细胞）相比有明显差异（P〈0．05）；经pIRES-CEAⅢ重组质粒免疫的小鼠脾细胞对H22．CEA（＋）细胞的杀伤率明显升高，差异显著（P〈0．01）；但对H22细胞则没有明显的杀伤作用。结论：pIRES-CEAⅢ作为基因疫苗可以抑制CEA阳性肿瘤在小鼠体内的生长，诱导小鼠CTL对CEA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤。     

HBsAg重组腺病毒转染的树突状细胞诱导BALB/c小鼠抗HBV免疫的研究

目的 研究HBsAg重组腺病毒转染的小鼠树突状细胞（DC）体内外免疫刺激活性和诱导小鼠抗HBV免疫的特点。方法 BALB／c小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC，转染HBsAg重组腺病毒Ad-S或被HBsAg蛋白冲击后，流式细胞术分析DC的表型，混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC的刺激活性；或与pcDNA3．1（＋）-S质粒分别免疫小鼠后，LDH法测定脾细胞CTL活性，放免法检测血清抗．HBs；流式细胞术分析体外自体MLR中及免疫后小鼠脾脏T细胞内细胞因子。结果 DC／Ad-S、DC／HBsAg和各对照组DC之间的表型和MLR差异无统计学意义，并均刺激TH和Tc分泌IFN-γ。DC／Ad-S免疫后2周能诱导比DNA疫苗更强产生IFN-γ的TH（P〈0．05），以及比DC／HBsAg和DNA疫苗更强分泌IFN-γ的Tc（均P〈0．01）和特异性CTL（P〈0．05，P〈0．01）。但DC／Ad-S和DC／HBsAg诱导的CTL反应及Tc分泌IFN-γ在免疫后4周均明显减弱，且诱导抗．HBs作用弱于DNA疫苗。结论 HBsAg重组腺病毒转染的DC比HBsAg冲击的DC及DNA疫苗能诱导更强的TH1/Tcl（Ⅰ型）细胞免疫和特异性CTL反应，是诱导抗HBV细胞免疫的有效刺激细胞。     

MUC1/Y基因体外冲击树突状细胞诱导抗瘤免疫反应

目的制备含MUC1/Y cDNA质粒转染的树突状细胞(DC),体外诱导杀伤细胞,研究其治疗消化道肿瘤的效果.方法构建MUC1/Y cDNA真核表达载体pIRES2-EGFP-MUC1/Y、pcDNA3.1-MUC1/Y.以pcDNA3.1-MUC/Y电转染8例HLA-A2(+)消化道肿瘤患者单个核细胞衍生的DC后,与自体T细胞混合培养,诱导CTL(T-pcDAN3.1-MUC1/Y).以SW620细胞[HLA-A2(+)、MUC1/Y(+)]为特异性靶细胞,Raji细胞[HLA-A2(-)、MUC1/Y(-)]和Lovo细胞[HLA-A2(-)、MUC1/Y(+)]为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测定杀伤活性,ELISA法检测基因修饰后DC刺激自体T细胞产生IFN-γ的能力,并以ANNEXIN V-FITC试剂盒检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡情况.结果pIRES2-EGFP-MUC1/Y转染效率为8%左右.T-pcDAN3.1-MUC1/Y诱导的杀伤作用显著高于T-pcDNA3.1[pcDNA3.1(+)修饰DC诱导的CTL]和T-IL-2(IL-2刺激外周血单个核细胞产生的CTL),P＜0.05.而且T-pcDNA3.1-MUC1/Y对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于对照组.基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平IFN-γ,与未转染的DC相比具有显著差异(P＜0.05).结论成功构建MUC1/Y全长cDNA真核表达载体.pIRES2-EGFP-MUC1/Y可用于真核细胞转染,通过观察转染效率,易于筛选阳性克隆;经pcDNA3.1-MUC1/Y修饰的DC可有效诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

MAGE-1基因疫苗的构建及其免疫学活性的研究

目的：制备MAGE-1基因疫苗，观察该疫苗诱导小鼠脾脏的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞C几活性及产生特异性抗体的影响。方法：应用基因重组技术，构建基因疫苗pcMAGE-1；转染HEK293细胞；RT-PCR及Western blot检测MAGE-1 mRNA及蛋白的表达；pcMAGE-1免疫3次BALB／c小鼠，末次免疫后7日收集血清及脾细胞。流式细胞术检测血清中抗MAGE-1多抗的产生，MTT法检测小鼠CIL杀伤活性。结果：构建的pcMAGE-1转染瑚：K293细胞，RT-PCR表明在MRNA水平有MAGE-1的表达；western blot显示表达产物46kD，与预期一致。基因疫苗免疫组小鼠血清MAGE-1抗体的产生增加，与SMMG7721结合率显著高于对照组（P〈0．05）。杀伤实验结果显示，免疫组小鼠脾细胞对SMMC-7721的杀伤率明显高于两个对照组（P〈0．05）。结论：成功地构建了MAGE-1基因疫苗，该疫苗能够有效地诱导特异性免疫应答。     

接头长度对MDC与CVB3VP1融合基因疫苗免疫效果的影响

目的构建表达不同接头（linker）长度的巨噬细胞源趋化因子（MDC）与CVB3VP1融合基因疫苗，观察接头长度对融合基因疫苗免疫效果的影响。方法构建表达接头长度分别为10、15和19个氨基酸的重组质粒pcDNA3／MDC-L-VP1；将6—8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为A-E5组，分别肌肉注射pcDNA3、pcDNA3／VP1、pcDNA3／MDC-L10-VP1、pcDNA3／MDC-L15-VP1和pcDNA3／MDC-L19-VP1，每次接种100μg/只，4周注射1次，共3次，每次免疫后第14天眼眶静脉采血，用微量中和试验滴定血清中和抗体效价。第3次免疫后3周，每组取3只小鼠，制备脾细胞，用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性；每组取3只小鼠以3LD50 CVB3病毒攻击，第7天取血处死，检测血中病毒滴度。结果成功构建了3种不同接头长度的质粒；第3次免疫后，E组中和抗体滴度和小鼠脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性显著高于其他各组，血中病毒滴度显著低于其他各组（P〈0．01）。结论融合基因疫苗pcDNA3／MDC-L19-VP1能诱导小鼠对CVB3VP1产生较强的体液和细胞免疫，有效地抑制了病毒的增殖。