三七总苷对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质分泌及降解的影响

目的探讨三七总苷(PN S)对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质(ECM)分泌及降解的影响,为临床上应用PN S延缓慢性肾衰竭(CRF)的进展提供理论依据。方法无菌条件下收集40份尿毒症病人血清和20例正常人血清,用相差显微镜、扫描电镜结合细胞角蛋白18(CK-18)免疫组化鉴定人肾小管上皮细胞株HK-2。应用消化法检测HK-2细胞培养上清液中羟脯氨酸水平,EL ISA方法检测HK-2细胞培养上清液中纤连蛋白(FN)、金属蛋白酶-1(MM P-1)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(T IM P-1)蛋白分泌量,RT-PCR方法检测MM P-1和T IM P-1 mRNA表达。结果10%尿毒血清组与正常对照组相比,HK-2细胞培养上清液中胶原蛋白和FN分泌量显著增高,MM P-1/T IM P-1基因表达和蛋白分泌的比值降低,而PN S 400、600、800 m g/L可使尿毒血清增加的HK-2培养上清液胶原蛋白分泌量回降;200、400、600、800 m g/L可使FN分泌量回降;100、200、400、600、800m g/L可使尿毒血清降低的MM P-1/T IM P-1基因表达和蛋白分泌的比值回升。结论在体外实验中,PN S可降低尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞胶原蛋白及FN的分泌,升高MM P-1/T IM P-1基因表达和蛋白分泌的比值,促进ECM降解,从而有效延缓人肾小管-间质纤维化的进展。     

脂多糖对人肾小管上皮细胞株（HK-2）增殖和细胞因子表达的影响

目的:观察脂多糖(LPS)对人肾小管上皮细胞株(HK-2)增殖及炎症因子表达的影响.方法:体外培养的人肾小管上皮细胞分为两组:阴性对照组和LPS刺激组(1.0 ng/ml).应用MTT法检测LPS对HK-2增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态学的变化;间接免疫荧光方法检测白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF)的表达;采用ELESA方法检测细胞培养上清中IL-1、IL-10、TNF的含量.结果:LPS组能促进HK-2细胞的增殖,促进细胞表达IL-1、IL-10、TNF.结论:LPS在体外促进HK-2增殖,可分泌促纤维化因子抗纤维化的因子.     

BMP-7对油酸诱导的肾小管上皮细胞转分化的预防作用

目的探讨BMP-7对油酸诱导的人肾小管上皮细胞转分化的预防作用。方法应用体外细胞培养技术培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）。先用不同浓度BMP-7预处理HK-2细胞,再用400μmol/L油酸刺激HK-2细胞,采用RT-PCR法和ELISA法检测转化生长因子-β1的表达,采用RT-PCR法检测α-平滑肌动蛋白的表达。结果不同浓度BMP-7预处理对静息培养的肾小管上皮细胞TGF-β1和α-SMA的表达无显著影响。而一定浓度BMP-7可以显著下调油酸诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1和α-SMA的表达,并下调TGF-β1的分泌。结论BMP-7可以预防油酸诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

阿昔洛韦诱导的人肾小管上皮细胞NGAL、IL-18表达及其意义

目的观察不同浓度阿昔洛韦诱导的体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK-2）的形态变化、IL-18、NGAL的表达及其意义。方法将正常培养的HK-2细胞分组：1正常组;22μg/ml阿昔洛韦组;33μg/ml阿昔洛韦组（模型组）。各组干预12 h后,倒置显微镜下观察各组细胞状态、细胞数量变化,逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测各组细胞IL-18、NGAL基因表达水平,Western-blotting法检测各组IL-18、NGAL蛋白表达。结果12μg/ml阿昔洛韦及3μg/ml阿昔洛韦组,细胞生长与正常组比较无差异,但细胞形态异常;2在mRNA水平,模型组干预后,IL-18水平明显增高,NGAL水平明显增高,与正常组比较P〈0.01;与蛋白水平表达方面类似。结论阿昔洛韦对HK-2细胞的生长有浓度依赖性抑制作用;高浓度的阿昔洛韦可导致HK-2细胞结晶,低浓度阿昔洛韦诱导的肾小管上皮细胞损伤伴有NGAL、IL-18的异常表达和分泌,对临床早期监测阿昔洛韦所致急性肾损伤有重要意义。     

AM12质粒对体外肾小管上皮细胞凋亡和分泌转化生长因子-β_1的影响

目的观察AM12质粒(含乙型肝炎病毒3.2 kb全基因组)对体外培养的人近端肾小管上皮细胞HK-2凋亡和分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响。方法以体外培养的HK-2细胞为对象,以AM12质粒转染HK-2细胞为转染组,以正常HK-2细胞作为对照组,用流式细胞仪检测细胞的凋亡及Fas表达率;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中TGF-β1的浓度。结果转染组HK-2凋亡率为(1.49±0.02)%,高于对照组的(1.03±0.09)%(P<0.05);Fas表达率为(10.09±2.34)%,高于对照组的(6.58±0.65)%(P<0.05);上清液TGF-β1水平为(283.85±61.12)ng.L-1,高于对照组的(210.28±47.21)ng.L-1(P<0.05)。结论 HBV-DNA质粒转染体外培养的人肾小管上皮细胞可诱导其凋亡并上调其对TGF-β1的分泌。     

法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞增殖和纤维化的影响

目的：探讨法舒地尔（Fasudil）对高糖培养的肾小管上皮细胞（HK-2）增殖和纤维化的影响。方法：将HK-2细胞分为正常对照组（NG组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L）、高张组（HM组,葡萄糖浓度5.5 mmol/L＋甘露醇54.5 mmol/L）、高糖组（HG组,葡萄糖浓度60 mmol/L）、高糖＋小剂量法舒地尔干预组[FA（5）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔5μmol/L]、高糖＋中剂量法舒地尔干预组[FA（10）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔10μmol/L];6高糖＋大剂量法舒地尔干预组[FA（20）组,D-葡萄糖60 mmol/L＋法舒地尔20μmol/L]。四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定HK-2细胞增殖;免疫共沉淀法检测p-MYPT1-Thr853;Western印迹法检测结缔组织生长因子（CTGF）的表达;ELISA法检测细胞培养上清液转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（Fn）的含量。结果：与NG组比,HG组HK-2细胞出现增殖增加,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达增加。与HG组比,FA（5）组、FA（10）组、FA（20）组均抑制了HK-2细胞的过度增殖,p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表达均减少。结论：法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖和纤维化。     

肿瘤坏死因子对HK-2细胞增殖及表达结缔组织生长因子的影响

目的观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖及表达结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的影响。方法采用DMEM/F12培养基体外培养HK-2细胞,分别用不同浓度的TNF-α刺激HK-2细胞,用噻唑蓝(MTT)法检测HK-2细胞的增殖,用流式细胞术(FCM)检测细胞周期,ELISA方法检测培养细胞的上清液中CTGF蛋白含量。结果与对照组(不加TNF-α)相比,0.1ng/mLTNF-α组、0.5ng/mL TNF-α组、1.0ng/mL TNF-α组、5ng/mL TNF-α及10ng/mL TNF-α组,MTT法测定的吸收光度A值、细胞增殖指数、ELISA方法检测培养细胞的上清液中CTGF蛋白含量,均有极显著性升高(P0.01),并随着TNF-α浓度的增加而递增(P0.05或P0.01)。但是,当培养液中TNF-α浓度到达1.0ng/mL后达到高峰,即在1.0ng/mL TNF-α、5ng/mL TNF-α及10ng/mL TNF-α组间,上述指标均无显著性差异(P0.05)。结论炎症因子TNF-α能促进肾小管上皮细胞的增殖、分泌致纤维化因子CTGF,从而在慢性肾脏疾病的发生发展中发挥重要作用。     

乙醛对人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1的影响研究

目的 通过研究乙醛对体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌转化生长因子-β1 (TGF-β1)的影响,以探讨乙醛导致肾小管间质纤维化的机制.方法 选取人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养于含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液中.以不同浓度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2细胞24 h.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HK-2细胞中TGF-β1的基因表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中TGF-β1的蛋白表达.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中TGF-β1的水平.结果 RT-PCR和Western blot结果显示,乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞中TGF-β1基因和蛋白的表达;ELISA法结果显示,乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞培养上清液中TGF-β1的水平.结论 乙醛能够促进体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1,从而促进肾小管间质纤维化的进展.     

高糖对人肾小管上皮细胞肌醇加氧酶表达的影响

目的:研究高糖环境下人近端肾小管上皮细胞肌醇加氧酶(MIOX)的表达.方法:将人近端肾小管上皮细胞株HK-2分组培养,正常对照组培养基含5.5 mmol/L D-葡萄糖,渗透浓度对照组培养基含19.5 mmoL/L甘露醇和5.5 mmoL/L D-葡萄糖,高糖组培养基含25 mmol/L D-葡萄糖.分别于培养12、24、48、72 h后取出爬片,应用免疫荧光细胞化学法检测MIOX蛋白的表达.结果:正常对照组和渗透浓度对照组HK-2细胞胞质MIOX蛋白微弱表达,各时间点表达量差异无统计学意义(P>0.05).高糖组培养12 h时,HK-2细胞MIOX蛋白表达即增高,随培养时间的延长,MIOX蛋白表达量逐渐升高,于48 h达高峰.高糖组MIOX蛋白表达水平较正常对照组升高(P<0.01).结论:高糖能促进人近端肾小管上皮细胞MIOX的表达,从而介导糖尿病患者体内肌醇耗竭.     

普罗布考对1-甲脲乙醇酸酐诱导HK-2细胞表达纤维化相关因子的影响

目的研究降脂药普罗布考对小分子尿毒素1-甲脲乙醇酸酐诱导纤维化相关因子在人肾小管上皮细胞表达的影响。方法 HK-2细胞分3组培养,正常对照组：不加干预因素;1-甲脲乙醇酸酐组：培养基中加入0.5mmo1/L1-甲脲乙醇酸酐;1-甲脲乙醇酸酐＋普罗布考组：培养基中加入0.5mmo1/L1-甲脲乙醇酸酐和20μmol/L普罗布考。各组细胞培养48h后用免疫细胞化学、RT-PCR检测TGF-β1、CTGF和FN,并用流式细胞仪对以上因子作定量检测,以观察其在HK-2细胞中的表达。结果在1-甲脲乙醇酸酐刺激后,免疫细胞化学染色HK-2细胞质中着色,显示TGF-β1、CTGF和FN均有表达。正常对照组HK-2细胞质中无着色。测定结果显示1-甲脲乙醇酸酐组TGF-β1、CTGF和FN显著高于正常对照组（P〈0.01）,加入普罗布考后,表达显著下降（P〈0.05）。结论 1-甲脲乙醇酸酐能促进纤维化相关因子在肾小管上皮细胞中表达;普罗布考能抑制1-甲脲乙醇酸酐诱导纤维化相关因子在肾小管上皮细胞的表达。     

游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol／L）软脂酸的DMEM—F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及凋亡相关蛋白caspase8蛋白表达的变化。结果FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0．05）,并可诱导细胞凋亡（P〈0．05）。经FFAs作用后,iNOS及Caspase8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,FFAs可能通过激活肾小管上皮细胞内的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,加剧肾小管上皮细胞的凋亡,而caspase8参与了其发生和发展的过程。     

原代培养大鼠肾小管上皮细胞在有机阴离子转运中的应用

目的优化原代培养大鼠肾小管上皮细胞(RTEC)的方法,探讨其应用于有机阴离子转运分析研究的优点。方法将大鼠肾皮质剪碎,经消化、过滤、短暂贴壁,所得大鼠RTEC在含体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基/F12培养基中培养,同时加入胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)营养添加剂。人肾小管HK-2细胞的培养条件同大鼠RTEC,但不添加ITS。反转录聚合酶链反应法检测大鼠RTEC及人肾小管HK-2细胞中β-actin、α-酮戊二酸(盐)受体1及有机阴离子转运蛋白1(OAT1)mRNA的表达。将HK-2细胞、大鼠RTEC应用于荧光素转运实验,观察2种细胞荧光强度随时间变化的差异。结果大鼠RTEC可传代,且生长状态良好。HK-2细胞无OAT1表达,不具有转运荧光素的能力;大鼠RTEC有OAT1表达,具有转运荧光素的能力。结论 ITS营养添加剂有利于原代培养大鼠RTEC的传代生长,该细胞可成功用于有机阴离子转运的研究,较HK-2细胞株更能客观地反映肾小管的转运功能,是研究肾脏相关功能的理想细胞学模型。     

褐藻多糖硫酸酯对 TGF-β1体外诱导的肾小管上皮细胞间质转分化过程中细胞骨架的影响

目的：通过体外观察褐藻多糖硫酸酯对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞（HK-2）间质转分化过程中细胞角蛋白（cytok-eratin,CK）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle action ,α-SMA）表达的影响,探讨该药对HK-2上皮-间质转分化的影响及其作用机制。方法体外培养正常人肾小管上皮细胞（ HK-2）细胞株,采用倒置相差显微镜观察对照组、诱导组和药物组细胞形态的变化,免疫细胞化学SABC法和图像分析技术检测培养第3 d对照组、诱导组和药物组HK-2细胞CK和α-SMA阳性细胞的平均光密度值。结果培养第3 d,对照组HK-2细胞呈现铺路石样上皮细胞形态特点,诱导组细胞呈长梭形,类似纤维细胞,药物组细胞以上皮细胞为主,少数细胞呈梭形;与对照组相比较,诱导组CK阳性细胞平均光密度值显著降低（ P＜0.05）,α-SMA阳性细胞平均光密度值增加（P＜0.05）;与诱导组相比较,药物组CK阳性细胞平均光密度值显著增加（P＜0.05）,α-SMA阳性细胞平均光密度值显著降低（P＜0.05）。结论①褐藻多糖硫酸酯具有抑制TGF-β1体外诱导的肾小管上皮细胞间质转分化的作用;②褐藻多糖硫酸酯可能通过改变细胞骨架成分发挥抑制肾小管上皮细胞间质转分化作用。     

雷帕霉素对肾小管上皮细胞生物学行为的影响及其治疗糖尿病肾病分子机制的初步研究

目的 研究雷帕霉素(RAPA)对肾小管上皮细胞生物学行为的影响及其治疗糖尿病肾病分子机制.方法 体外培养肾小管上皮细胞(HK-2),使用转化生长因子 β1(TGF-β1)处理HK-2细胞,以建立肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转化(EMT)的细胞模型,并联合RAPA处理HK-2细胞,通过Transwell迁移实验和侵袭实验观察HK-2细胞的迁移和侵袭等细胞生物学行为变化;通过RT-PCR、Western blot法观察EMT分子标志物表达的变化;结合前期建立的糖尿病肾病小鼠模型的肾组织及通过腹腔注射RAPA[1 mg/(kg·d)]处理后的模型小鼠肾组织,利用HE染色分析肾组织的病理变化;利用免疫组化检测EMT分子标志物的表达变化.结果 Transwell实验结果表明,TGF-β1诱导HK-2细胞发生迁移和侵袭能力明显增加;联合应用RAPA后,迁移和侵袭能力明显抑制.RT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示TGF-β1可以促进间质细胞标志分子Vimentin的表达,而上皮标志分子E-cadherin的表达明显降低;联合应用RAPA后可以抑制TGF-β1诱发的EMT作用.HE染色显示,RAPA治疗后,能显著改善糖尿病肾病小鼠肾小管形态病变.结论 RAPA具有抑制肾小管上皮细胞发生EMT作用.     

IL-18对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌的影响

目的 探讨白细胞介素18（IL-18）对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌影响。 方法 应用终浓度为0、0.1、1、10、100ng/mL的IL-18处理体外培养人类近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）24h、48h和72h。应用RT-PCR法检测IL-18对HK-2细胞Ⅳ型胶原（Col-IV）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA表达;采用ELISA法测定细胞培养上清中Col-IV及MCP-1分泌水平。 结果 IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IVmRNA和MCP-1 mRNA的表达,IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IV的分泌,呈剂量依赖性地促进HK-2细胞MCP-1分泌,但其蛋白分泌量在24h即达高峰,未见时间依赖关系。 结论 IL-18可能部分通过促进细胞外基质的过度分泌和炎症细胞趋化,参与促进肾间质纤维化的进程。     

白细胞介素-10对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的研究白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）转分化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）的影响。方法将培养的HK-2细胞通过完全随机设计分为5组：①对照组：5．5mmol／L的D-葡萄糖组;②高糖组：30mmol／L的D-葡萄糖组;③30mmol／L的D-葡萄糖＋1ng／ml IL-10组;④30mmol／L的D-葡萄糖＋5ng／ml IL-10组;⑤30mmol/L的D-葡萄糖＋25ng／ml IL-10组。培养48h后,RT-PCR法检测各组细胞CTGF mRNA的表达;免疫细胞化学法和Western blot法检测各组细胞α-SMA的表达;ELISA法检测各组细胞FN的分泌。结果在高糖中加入1、5、25ng／ml的IL-10作用后,与高糖组相比HK-2细胞CTGF、α-SMA和FN表达减少,且均有统计学差异（P〈0．05）。结论IL—10可以抑制高糖环境下的。肾小管EMT。     

高尿酸通过TLR4/NF-κB信号通路诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质转化的作用研究

目的 探讨尿酸诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质细胞转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制.方法 采用不同质量浓度的尿酸预孵育肾小管上皮细胞(HK-2)48 h,通过倒置显微镜观察尿酸对HK-2细胞形态的影响,Western blot检测Fibronectin、α-SMA和E-cadherin蛋白表达变化.Real-time PCR检测炎症因子IL-1 β、IL-6以及TNF-α mRNA的表达变化,免疫荧光检测上皮细胞标志物cytokeratin和间充质细胞标志物vimentin的表达变化.结果 与正常组相比,15 mg/dL的尿酸处理HK-2细胞48 h后,HK-2细胞间隙增大,呈长梭形改变.间充质细胞标志物Fibronectin、α-SMA表达明显升高,而上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显下降(P＜0.05).同时,高浓度尿酸诱导了HK-2细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的表达升高(P＜0.05),TLR4/NF-κB信号通路活化,而靶向抑制NF-κB信号通路活化可以显著抑制尿酸诱导的EMT.结论 高尿酸可以通过活化TLR4/NF-κB信号通路诱导肾小管上皮细胞EMT的发生,靶向干预NF-κB信号通路可以显著抑制尿酸诱导的肾间质纤维化.     

醛固酮对人肾小管上皮细胞MMP-1/TIMP-1基因表达和合成分泌纤维连接蛋白的影响

目的 探讨醛固酮(ALD)对人肾小管上皮细胞基质金属蛋白酶1(MMP-1)和金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)基因表达,以及合成分泌纤维连接蛋白(FN)的影响.方法 人肾小管上皮细胞(HK-2)培养于含5％ FCS的DMEM/F12培养液中,以不同浓度的ALD (10-11、10-10、10-9、10-8mol/L)刺激HK-2细胞48h后,应用半定量RT-PCR法检测细胞中MMP-1、TIMP-1和FN的基因表达,ELISA法测定培养上清液中纤维连接蛋白(FN)的含量.结果 ALD呈剂量依赖性地下调HK-2细胞中MMP-1的基因表达,上调TIMP-1和FN的基因表达,MMP-1/TIMP-1比值降低(P＜0.05).ALD呈剂量依赖性地增加培养上清液中FN的含量(P＜0.05).结论 ALD通过调控HK-2细胞中MMP-1和TIMP-1的基因表达,促进其合成分泌FN,导致肾间质纤维化的进展.