阿魏酸钠抑制高糖诱导的系膜细胞增殖

目的 探讨阿魏酸钠(SF)对高糖诱导的原代培养系膜细胞(GMC)增殖的作用及其机制.方法 原代培养肾小球系膜细胞,分为正常组、甘露醇组、高糖组、高糖加不同浓度SF组,分别于处理后24、48 h收集细胞.用MTT法检测细胞增殖;流式细胞术测定cyclinD1和细胞周期;免疫细胞化学检测p53蛋白的表达.结果 48 h内,高糖促进GMC增殖,使GMC由G1期进入S期细胞比例增高;同时cyclinD1蛋白表达上调而p53蛋白的表达减少;SF能明显对抗高糖的这种作用,其作用随SF浓度的增加、作用时间的延长而加强.结论 SF可能通过抑制cyclinD1蛋白表达和促进p53蛋白生成,从而抑制高糖诱导的GMC增殖.     

罗格列酮对高糖诱导下大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响

以大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)为靶细胞,观察不同浓度不同时间罗格列酮(RSG)对高糖培养的系膜细胞的作用,发现RSG在一定范围内以剂量和时间依赖关系抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖,阻止系膜细胞由G1期进入S期,并诱导细胞凋亡。RSG有效减轻了高糖诱导的肾小球系膜细胞的病理损伤。     

叉头状转录因子01对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的通过激活和抑制叉头状转录因子01（Fox01）活性及表达,探讨其对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞（MCs）氧化应激的作用。方法采用脂质体转染法将FoxOl短发夹样RNA（Fox01shRNA）质粒载体稳定转染MCs;用高糖（30．0mmol／L）和白藜芦醇（Resv20．0txmol／L）培养稳定转染后的MCs。以5．6mmol／L葡萄糖培养的MCs为正常对照组（NG）,将高糖培养的MCs分为5组：单纯高糖组（HG）、HG＋Resv组、HG＋Fox01shRNA转染组、HG＋Resv＋Fox01shRNA转染组、HG＋转染阴性对照组（shNC）。培养72h后,用荧光酶标仪检测各组MCs内活性氧（ROS）水平;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测去乙酰化酶（Sirtl）、Fox01、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）mRNA表达;Westernblotting法检测Fox01及磷酸化Fox01（p-Fox01）水平。多组间数据比较采用单因素方差分析。结果与NG组相比,HG组SirtlmRNA表达下降,p-Fox01水平升高,MnSODmRNA表达下降,ROS水平升高,差异均有统计学意义（t=12．38、13．27、14．13、8．36,均P〈0．05）。与HG组相比,HG＋Fox01shRNA转染组Fox01mRNA表达被抑制,MnSODmRNA表达更低,ROS水平更高,差异均有统计学意义（t=20．61、13．61、10．13,均P〈0．05）;HG＋Resv组SiitlmRNA表达升高,p-Fox01水平下降,MnSODmRNA表达升高,ROS水平下降,差异均有统计学意义（t=6．02、10．69、5．39、5．37,均P〈0．05）。与HG＋Resv组比较,HG＋Resv＋Fox01shRNA转染组,Fox01mRNA表达被抑制,MnSODmRNA表达降低,ROS水平升高,差异均有统计学意义（t=22．53、15．31、14．63,均P〈0．05）。结论Fox01是调节MCs内ROS水平的重要转录因子,其可能通过激活下游抗氧化靶基因MnSOD的表达,保护MCs对抗氧化应激。     

高糖对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响

目的 观察不同浓度的葡萄糖对人肾小球系膜细胞增殖的影响及对细胞外基质纤维连接蛋白(Fn),Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响.方法 体外培养人肾小球系膜细胞株,分别加入葡萄糖终浓度为5.5、10、20、30、40 mmol/L进行处理,于不同时间段(12、24、48、72 h)用MTT法检测肾小球系膜细胞的增殖情况,ELISA法检测培养48 h后条件培养基中Fn及ColⅣ的含量.结果 高糖作用12、24、48、72 h均能促进细胞的增殖,且随着葡萄糖浓度升高作用时间的延长促进作用增强.检测细胞上清液的Fn和ColⅣ.与对照组相比,30 mmol/L D-葡萄糖作用48 h后,Fn和ColⅣ表达增高.结论 高浓度葡萄糖对系膜细胞增殖作用具有量效及时效关系,我们选择30 mmol/L浓度的葡萄糖作用48 h为最合适的细胞刺激条件.高浓度葡萄糖可促进系膜细胞细胞外基质的产生,而系膜细胞细胞外基质过度表达,可以直接导致细胞外基质的积聚,从而导致肾小球硬化的发生.     

高糖及血管紧张素Ⅱ对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响

糖尿病肾病 (ＤＮ)是糖尿病常见而且严重的慢性并发症 ,高血糖和血管紧张素Ⅱ (ＡｎｇⅡ )是导致ＤＮ肾纤维化最主要的两种物质 ,它们通过共同的信号传导途径参与了肾纤维化的发生发展〔1,2〕。近年来 ,国外研究发现结缔组织生长因子 (ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＣＴＧＦ)对肾细胞增殖、表型改变及细胞外基质 (ＥＣＭ )具有较强调控作用 ,其异常表达在ＤＮ肾纤维化进程中起了重要作用。本研究拟用高糖和ＡｎｇⅡ刺激体外培养的系膜细胞 ,测定其ＣＴＧＦｍＲＮＡ的表达情况 ,以探讨高糖和ＡｎｇⅡ对系膜细胞…     

金钗石斛总碱对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞PPAR-γ表达的影响

目的 观察金钗石斛总碱对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）表达的影响.方法 金钗石斛总碱经酸性乙醇提取后,通过强酸性阳离子交换树脂富集,鉴定方法选用气质光谱分析,总碱含量采用酸性染料比色法测定.将大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组（NC组）、高糖模型组（HG组）、罗格列酮对照组（ROZ组）及金钗石斛总碱低（LD组）、中（MD组）、高（HD组）剂量组,采用RT PCR和Westem blot分别检测各组PPAR-γ mRNA和蛋白的表达情况.结果 金钗石斛总碱提取物经气相色谱检测分析,确定为金钗石斛生物碱成分,经酸性染料比色法测定总碱含量约为69％.与NC组比较,HG组PPAR-γ mRNA和蛋白表达明显减少（P＜0.05）;与HG组比较,金钗石斛总碱各剂量组PPAR-γmRNA和蛋白表达减少,PPAR-γmRNA及蛋白随金钗石斛总碱用药量的增加而表达减少,但各组间差异无统计学意义（P均＞0.05）.结论 金钗石斛总碱对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞PPAR-γ并无激活作用.     

高胰岛素对人类肾小球系膜细胞的影响

有报道胰岛素可以导致大鼠肾小球系膜中纤维连接蛋白 (Ｆｎ)堆积[1] ,提示高胰岛素血症可能在糖尿病肾病 (ＤＮ)发生发展中有其作用。本研究拟建立人类肾小球系膜细胞 (ＧＭＣ)培养 ,观察高胰岛素对人类ＧＭＣ增生及Ｆｎ生成 ,ＧＭＣ内游离Ｃａ2 ([Ｃａ2 ]ｉ)水平的影响 ,以探讨ＤＮ发病机制及其防治的实验依据。1　材料和方法[2 ]1.1　ＧＭＣ培养及鉴定　取人类肾移植废弃肾的肾皮质 ,筛网法分离肾小球 ;含 10 %灭活小牛血清的ＲＰＭＩ 16 4 0培养 ,消化传代及细胞鉴定。实验中使用第 4～ 8代细胞。1.2　实验分组　按培养液中胰岛素浓度…     

细胞间粘附分子对巨噬细胞促进肾小球系膜细胞增殖的影响

目的：探讨细胞间粘附分子－１对巨噬细胞促进系膜细胞增殖作用的影响。方法：利用体外系膜细胞与巨噬细胞共同培养的方法，通过加入不同剂量的有关抗体，采用Ｏｌｉｖｅｒ法观察细胞增殖的变化。结果：随着抗细胞间粘附分子－１抗体剂量的增加，巨噬细胞促进系膜细胞增殖的作用逐渐减弱，与正常对照组相比差异非常显著（Ｐ〈０．０１）。结论：细胞间粘附分子促进系膜细胞与巨噬细胞之间粘附加强，可能是肾小球系膜增生性炎症改变的     

1-脱氧野尻霉素对高糖刺激大鼠系膜细胞增殖的影响

观察1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)对大鼠系膜细胞增殖的影响及进行机制探讨.结果 显示,DNJ抑制高糖刺激的系膜细胞增殖呈剂量和时间依赖性.DNJ可降低高糖刺激的系膜细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、整合素β1 mRNA、蛋白及黏着斑激酶(FAK)的蛋白表达(P＜0.05或P＜0.01),抗整合素β1抗体、FAK抑制剂genistein也可抑制高糖刺激系膜细胞α-SMA的蛋白表达(均P＜0.01).     

法舒地尔通过Rho/ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响

目的 体外实验研究法舒地尔(fasudil)通过抑制Rho/ROCK信号通路对高糖培养下的人肾小球系膜细胞(HMCs)炎症反应及其纤维化的影响.方法 传代培养的HMCs同步化后分组:(1)正常糖浓度对照组(NG,含葡萄糖5.5 mmol/L);(2)高糖组(HG,含葡萄糖30.0 mmol/L);(3)甘露醇渗透压对照组(Man,含5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);(4)高糖+法舒地尔处理组(HG+F组,法舒地尔浓度分别为25、50、100 μmol/L).培养12、24、36、48、72 h收集上清及细胞,用实时PCR检测细胞中小G蛋白(RhoA)、小G蛋白激酶-Ⅰ(ROCK-Ⅰ)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)mRNA浓度的变化,用ELISA方法检测上清中纤维连接蛋白(FN)、CTGF、TNFα的蛋白含量.结果 (1)高糖培养下的HMCs中RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF mRNA的表达较NG组明显升高(P＜0.05),并有一定的时间依赖性,Man组与NG组相比差异无统计学意义(P＞0.05).(2)正常培养的HMCs经不同浓度法舒地尔预处理后,高糖继续培养24 h或48 h,HG+F组与HG组对比,RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF mRNA的表达明显下降(P＜0.05),并有一定的浓度依赖性.(3)高糖呈时间依赖方式增加HMCs对FN、CTGF、TNFα蛋白的分泌(P＜0.05),而NG组和Man组无此作用(P＞0.05).(4)经不同浓度法舒地尔预处理后,高糖继续培养12、24、36、48、72 h后FN、CTGF、TNFα蛋白的分泌较HG组明显降低(P＜0.05).结论 法舒地尔通过抑制高糖激活的HMCs的Rho/ROCK信号转导通路,从而降低下游的炎性因子和细胞因子的分泌,减少HMCs的炎症反应及纤维化,为糖尿病肾病的治疗提供新的依据.

Abstract：

Objective To study the effect of fasudil on inhibiting the Rho/ROCK signaling pathway under high glucose in human mesangial cells (HMCs) inflammation and fibrosis. Methods Synchronized HMCs were divided into following groups: (1) Normal glucose control group ( NG, 5. 5 mmol/L glucose) ;(2) High glucose group (HG, 30 mmol/L glucose) ; (3) Mannitol group (Man, 5.5 mmol/L glucose + 24. 5 mmol/L mannitol) ; (4) High glucose + fasudil group ( HG + F, the concentrations of fasudil were 25 ,50 and 100 μmol/L, respectively). Collect the supernatant and cells at 0, 12, 24, 36, 48 and 72 h respectively, and determine the concentration changes of the RhoA, ROCK- Ⅰ, connective tissue growth factor (CTGF)mRNA with real-time PCR method in the cells, then used the ELISA method to check the protein content of the fibronectin ( FN) , CTGF, TNFα in the supernatant. Results ( 1) RhoA, ROCK- Ⅰand CTGF mRNA of the HMCs cultured under the high glucose expressed significantly higher than those in the normal group, and there was certain time-dependence. Besides, there was no statistic significance by comparing Man and NG. (2) Under the high glucose situation, after the fasudil pretreatment with different concentrations and 24 h or 48 h culture with high glucose, RhoA, ROCK- Ⅰ , CTGF mRNA expression was significantly decreased in HG + F, compared with HG, and there was certain concentration-dependence. (3) High glucose increased the FN, CTGF, TNFα protein secretion of HMCs in a time-dependent manner, but normal glucose and mannitol had no such effect. (4) After the fasudil pretreatment with different concentrations and culture with high glucose for 12, 24, 36, 48, 72 h, the FN, CTGF, TNFα protein secretion was significantly reduced compared with HG. Conclusion Fasudil can reduce the secretion of downstream inflammatory factors and cytokines by inhibiting high glucose-activated HMCs Rho/ROCK signaling pathway, and reduce the inflammation and fibrosis of HMCs. This provides a new basis for the therapeutic target in the treatment of diabetic nephropathy.     

高糖对人肾小球系膜细胞p38MAPK／CREB通路与纤维化的影响

目的探讨高糖环境下人肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶／cAMP反应元件结合蛋白（p38MAPK／CREB）通路的活性及细胞外基质成分纤维黏连蛋白（FN）的变化。方法以5．6mmol／L葡萄糖培养基培养肾小球系膜细胞为对照组,观察高糖（30mmol／L）培养12、24、48小时。肾小球系膜细胞p38MAPK／CREB活性和FNmRNA、FN的变化。结果与对照组比较,高糖组各时间p-p38MAPK、P—CREB的表达均上升,并随着时间的延长,其表达逐渐升高;FN的表达升高,并且随着时间的延长,其表达进一步升高。结论高糖环境下p38MAPK／CREB通路被激活,FN表达增加,p38MAPK／CREB通路参与了细胞外基质重构的过程。     

高糖状态下肾脏系膜细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及氟伐他汀的干预研究

目的观察高糖环境中大鼠肾脏系膜细胞（MC）葡萄糖转运蛋白1（GluT-1）及转化生长因子1（TGF-β1）mRNA表达变化以及氟伐他汀（Flu）的干预作用，探讨其保护肾脏的可能机制。方法原代培养MC分为正常对照（NG）组、甘露醇（MG）组、高糖（HG）组及HG＋Flu组，RT-PCR法检测细胞中GluT-1mRNA和TGF-β1 mRNA的表达，放免法测定各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原含量。结果HG组各时相点GluT-1mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均高于NC组（P〈0．01），从48h开始HG组细胞上清液Ⅳ型胶原的含量较NC组增高（P〈0．05），而HG＋Flu组GluT-1 mRNA表达量、TGF-β1 mRNA的表达、细胞上清液Ⅳ型胶原含量均较同时点HG组明显降低（P〈0．01）。结论高糖刺激使MC内GluT-1 mRNA表达增高，TGF-β1 mRNA表达上调，Ⅳ型胶原分泌增多。高糖状态下，Flu抑制细胞外基质积聚的作用可能与其抑制高糖引起MC GluT-1过表达、减少TGF-β1的合成有关。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对白介素18诱导肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

目的观察吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对白介素18（IL-18）诱导肾小球系膜细胞（MC）增殖及细胞外基质（ECM）分泌的影响及机制。方法MTT法检测MC的增殖情况,ELISA检测Ⅳ型胶原蛋白（CO-Ⅳ）和层黏连蛋白（LN）,免疫细胞化学检测核转录因子-κB（NF-κB）P65的核易位。结果高糖环境下,25μg／L、50μg／L的IL-18作用48h能明显促进MC增殖、CO-Ⅳ和LN的分泌（P〈0．01）,使NF-κBP65激活,50κg／L组更为显著（P〈0．01）。100κmol／L的PDTC能显著抑制IL-18诱导MC增殖作用（P〈0．01）,CO-Ⅳ和LN的分泌以及P65核易位。结论PDTC可能通过NF-κBP65途径抑制IL-18诱导的MC增殖和细胞外基质分泌。     

大黄酸对葡萄糖转运蛋白1基因转染系膜细胞功能的影响

目的通过观察大黄酸对葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因转染系膜细胞(MCGT1)功能的影响,探讨大黄酸治疗糖尿病肾病(DN)的作用机制.方法利用逆转录病毒载体建立GLUT1基因转染的大鼠系膜细胞,以β-半乳糖苷酶转染细胞(MCLacZ)为对照.用2-脱氧-3H-葡萄糖(2-DG)测定细胞葡萄糖摄入,流式细胞仪分析细胞表型,3H-脯氨酸掺入和流式细胞仪分别检测细胞胶原和纤维连接蛋白(FN)的合成,采用比色法测定谷氨酰胺6-磷酸果糖转氨酶(GFAT)的活性,RT-PCR检测细胞胶原Ⅳ、FN和GFAT的表达.结果MCGT1的2-DG摄入率明显高于MCLacZ[(741±60.5)dpm*μgprot-1比(92.2±9)dpm*μgprot-1],同时表现出细胞大小、RNA/DNA和蛋白/DNA明显增加的细胞肥大表型,细胞外基质合成增加,MCGT1的3H-脯氨酸掺入量明显高于MCLacZ[(7.0±0.4)dpm*cell-1比(4.6±0.6)dpm*cell-1],GFAT活性明显增强(约增加1.8倍).大黄酸能够减少MCGT1的糖摄取[(560±64)dpm*μgprot-1比(741±60.5)dpm*μgprot-1),纠正MCGT1的肥大状态,并抑制MCGT1细胞外基质的合成和表达,降低MCGT1的GFAT活性.结论GLUT1的过度表达会明显改变系膜细胞的功能,大黄酸能逆转GLUT1基因转染所致系膜细胞功能的改变.     

Phenotype-specific inhibition of the vascular smooth muscle cell cycle by high glucose treatment

Aims/hypothesis Diabetes accelerates the development of atherosclerosis, which critically involves the proliferation of vascular smooth muscle cells (SMCs). However, how high glucose treatment regulates SMC proliferation is controversial. Considering the established SMC heterogeneity, we hypothesised that glucose treatment may have distinct effects on proliferation of the various phenotypic SMCs. Materials and methods We tested this possibility using cloned spindle-shaped and epithelioid SMCs and laser scanning cytometry. Results Our results showed that glucose treatment significantly inhibited the serum-independent proliferation of epithelioid SMCs, but had no effect on the proliferation of spindle-shaped cells either with or without serum stimulation. Furthermore, glucose treatment inhibited DNA synthesis, as detected by bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, and increased the production of reactive oxygen species in epithelioid SMCs. The inhibition of BrdU incorporation by glucose treatment was mimicked by glucosamine and phorbol 2,13-dibutyrate, a protein kinase C (PKC) activator, and reversed by azaserine, an inhibitor of the hexosamine pathway. In addition, the inhibitory effects of glucose treatment were blocked by GF 109203X (a PKC inhibitor) and PD98058 (a MAPK/ERK kinase, MEK inhibitor), and by knockdown of MEK1 by small interfering RNA (siRNA). The addition of either GF 109203X or PD98058 also reduced the phosphorylation of MAP kinase induced by glucose treatment. Conclusions/interpretation Glucose treatment inhibits the proliferation of epithelioid, but not spindle-shaped, vascular SMCs through the activation of PKC and the MAP kinase pathway, suggesting that the effects of hyperglycaemia on vascular disease depend on the phenotype of SMCs involved.     

阿霉素肾病大鼠肾小球系膜细胞部分生物活性的改变

本文应用肾小球细胞体外培养方法和双同位素标记技术,观察了阿霉素肾病大鼠肾小球系膜细胞(GMC)对白细胞介素6的反应、肾病大鼠GMC条件培养液(GMC-CM)对正常大鼠GEC掺人~(35)S和~3H-亮氨酸的影响以及GMC-CM对小鼠骨髓瘤杂交瘤细胞增殖的作用。结果显示:①肾病大鼠GMC对不同浓度IL-6的反应曲线与正常GMC明显不同;②肾病极期GMC-CM明显促进正常大鼠GEC合成含硫化合物;③肾病大鼠GMC-CM中含有骨髓瘤细胞的杀伤物质。以上结果提示,阿霉素肾病大鼠GMC的部分生物活性发生了改变。     

葡萄糖转运蛋白对大鼠肾小球系膜细胞己糖胺通路的影响

目的探讨己糖胺通路(HBP)在葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因转染系膜细胞功能改变中的作用.方法利用逆转录病毒载体建立GLUT1基因转染的大鼠系膜细胞,以β-半乳糖苷酶转染细胞(MCLacZ)为对照.用2-脱氧-3H-葡萄糖(2-DG)测定细胞葡萄糖摄入,流式细胞仪分析细胞表型和纤维连接蛋白(FN)的合成,采用比色法测定HBP限速酶--谷氨酰胺6-磷酸果糖转氨酶(GFAT)的活性,RT-PCR检测细胞GFAT基因的表达.结果 MCGT1的2-DG摄入率明显高于MCLacZ[(741.0±60.5)dpm/μg蛋白质 vs (92.2±9.0)dpm/μg 蛋白质,P＜0.01],动力学分析发现MCGT1的Vmax是MCLacZ的3.7倍,而两者Km值无明显差别.MCGT1的GFAT活性明显高于MCLacZ[(3.25±0.25)OD365·μg蛋白质-1·30 min-1·10 vs (1.15±0.16)OD365·μg蛋白质-1·30 min-1·