鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定

目的对分离自发病欧洲鳗鲡的创伤弧菌疑似菌株进行准确的鉴定。方法首先尝试利用一对16SrRNA基因特异性通用引物PCR扩增一株鳗源创伤弧菌疑似株的基因组DNA，得到一个约500bp的DNA片段，将该DNA片段亚克隆至pMDl8-T载体，鉴定克隆化成功之后，送专业公司进行测序，得到一个502bp的DNA产物，NCBI上同源性比较表明，该片段与GeneBank上注册的创伤弧菌的16SrDNA序列同源性最高（100％），同时排除了哈维氏弧菌的可能。设计一对创伤弧菌溶血素特异性引物，实现了对鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定。结果建立一种简洁的鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定方法。结论国内首次自发病欧鳗分离到创伤弧菌，并给出分子鉴定证据。     

在羊的血培养中发现一株与布鲁氏菌交叉反应的迟缓爱德华氏菌

在羊的血培养中发现一株与布鲁氏菌交叉反应的迟缓爱德华氏菌山东淄博市淄川区防疫站曹温年，常承忠中国预防医科院流行病学微生物学研究所李元凯，邱海燕１９９０年７月，在做羊群布鲁氏菌病检疫时，从一只山羊的血培养物中分离到一株与布氏菌诊断血清凝集的非布鲁氏菌属...     

迟缓爱德华氏菌溶血相关基因的克隆

目的 研究迟缓爱德华菌（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅｔ．）重要毒力因子的溶血素。方法 用鸟枪法将Ｅｔ－１２株的染色体经Ｓａｕ３Ａ酶切后,连接在质粒ｐＡＣＹＣ１８４上。结果 在抗性绵羊红细胞平板上,筛选出７株溶血相关克隆子,其中２株能稳定表达,并将１株重组质粒经酶切后,发现其酶谱和大小和国外报告的不同。经斑点杂交,证实该溶血相关基因在Ｅｔ－１２染色体上,结论 可能克隆到新的Ｅｔ－１２溶血     

欧洲鳗迟钝爱德华氏菌的分离鉴定

目的对欧洲鳗(Anguilla anguilla) 迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）菌株ET81126进行分离鉴定。方法采用形态特征观察、人工感染试验、API 20E细菌鉴定系统、16SrDNA测序以及属特异性PCR技术对菌株ET81126进行分析。结果人工感染试验表明菌株ET81126为致病菌,对欧洲鳗的半数致死量为4.55×104 cfu/g。按形态特征和API 20E细菌鉴定系统初步鉴定菌株ET81126为爱德华氏菌。通过16SrDNA测序,在GenBank上经同源性序列比对与迟钝爱德华氏菌（登录号EF467289）自然聚为一类,同源率达99％。属特异性PCR扩增图谱显示迟钝爱德华氏菌非典型菌株特有的230bp条带。结论综合生化指标和分子生物学鉴定结果,可确定菌株ET81126为欧洲鳗迟钝爱德华氏菌。     

我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析

目的 对17株来源于我国华东与华南地区的养殖鱼类迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)分离株进行多样性分析。方法 通过菌体血清凝集试验及16S rRNA与hsp60部分基因序列的聚类分析。结果 菌体血清凝集试验结果显示,鳗源迟缓爱德华氏菌ETY的抗O血清可凝集大部分鱼源迟缓爱德华氏菌;人源迟缓爱德华氏菌标准株ATCC15947的抗O血清仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY37有交叉凝集;鲶鱼爱德华氏菌EIV的抗O血清与鱼源迟缓爱德华氏菌无交叉凝集。2株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1和E29L与以上3种爱德华氏菌抗O血清不发生凝集反应。基于16S rRNA及hsp60部分基因序列构建的系统发育进化树显示,来源于不同地区的绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高,在基于16S rRNA构建的系统进化树中,山东地区分离自大菱鲆的迟缓爱德华氏菌聚为一支。3株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1、E29L、GK4与人源迟缓爱德华氏菌ATCC15947及人源鲶鱼爱德华氏菌EIV有一定亲缘关系。结论 我国华东、华南地区的鱼源迟缓爱德华氏菌分离株普遍具有相似的血清型和较高的进化同...     

迟缓爱德华氏菌新的溶血活化基因功能的研究

目的 探讨新的迟缓爱德华氏菌溶血活化基因（eha）的功能。方法 PCR扩增部分溶血活化基因,制成地高辛探针和26株Et菌进行斑点杂交和Southern blot。结果 新的迟缓爱德华氏菌（Et)溶血活化基因以单拷贝形式存在于一部分Et菌染色体上,且pED102菌的Vero细胞毒和溶血活性作用主要位于胞浆蛋白和胞隙蛋白中。将有溶血活化基因的pED102重组质粒电击入水溶血的Et菌和大肠杆菌（LE392、JM109）,Et菌仍无溶血现象,大肠杆菌有溶血现象。结论 eha基因不是溶血素结构基因,而是溶血活化基因。     

迟缓爱德华菌溶血特性

目的　研究迟缓爱德华菌溶血素的特征。方法　平板检测法 ,接触溶血法 ,上清检测法。结果　讨论了迟缓爱德华菌溶血特性及检测的影响因素。结论　迟缓爱德华菌至少存在两种溶血素 ,其溶血活性受环境影响表现不同     

转录因子Eha直接调控迟缓爱德华菌的靶基因

目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌(Et)的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制。方法 构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot 检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们釆用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha-DNA 片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRT-PCR; PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P_靶lac Z重组质粒,电击分别导入ET-13野生株和eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异。结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag 融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接结合的基因; 通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异,证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用。结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响。     

迟缓爱德华菌eha基因对大肠埃希氏菌溶血基因clyA转录的调控

目的研究迟缓爱德华菌溶血活化基因eha是否能影响大肠埃希氏菌DH5α溶血素基因clyA的转录。方法将重组eha表达质粒pED101转入DH5α中,以载体质粒pACYC184为对照,观察其溶血情况。并用RT-PCR分别检测受体菌DH5α,含pED101的DH5α菌以及含载体的DH5α菌中clyA基因的转录情况。结果eha基因表达质粒的转入,可以使DH5α出现clyA基因阳性条带,且和载体无关。结论迟缓爱德华菌eha基因能正性调控DH5αclyA基因的转录,从而使其表现为溶血。     

eha,迟缓爱德华菌一个毒力调控基因

目的探讨迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)溶血相关基因(E.tardahaemolysin activator gene,eha)基因调控该菌毒力基因的作用。方法利用自杀质粒pHM5,缺失E.tarda的eha基因,得到△eha缺失菌株,再构建△eha株的互补菌株。通过平板溶血性法、接触溶血法、上清溶血法,观察野生株、△eha缺失株与及互补株溶血性的差异。利用MTT法比较三种细菌培养物的过滤液对Vero细胞的毒性的差别。利用H2O2抗性纸片扩散法,比较三种菌对过氧化氢抵抗力的差异。利用RT-PCR和SDD-PAGE电泳超速酸化离心法提取的鞭毛蛋白,比较三种细菌鞭毛基因的转录和表达的差异。结果△eha缺失株和互补株不溶血,而野生株溶血。eha基因的缺失降低E.tarda菌对过氧化氢的抵抗力,△eha缺失株较野生株的细胞毒性明显减弱,eha基因可以调控迟缓爱德菌鞭毛基因的转录和表达。结论 eha基因可以调控迟缓爱德华菌毒力基因的表达,是一个毒力调控基因。     

黄姑鱼创伤弧菌的分离和鉴定

目的从患病黄姑鱼体内分离出致病力较强的菌株L1,人工感染实验证实该菌株为黄姑鱼的病原菌。对该细菌进行了形态、生理生化特性测定和16SrRNA分子鉴定,测定16SrRNA基因序列,分析相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树。结果表明菌株L1与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的亲缘关系最近,具有98.7%的同源性。结合该菌株的生理生化特性,可鉴定菌株L1为创伤弧菌。     

创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定

目的制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0.5mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1∶4000~1∶8000、免疫双扩散效价为1∶4~1∶8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。     

基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法用ATPase抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化,菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响;比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-P_(eha)LacZ质粒,采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性;选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株,阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2h,RNA-Sequencing结果表明:eha基因缺失株转录水平和野生株相比,147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2Ratio|≥1),其中113个上调,34个基因下调,qRT-PCR随机抽样,和RNA-Sequencing表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份;基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中,包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径,涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论在酸性生存环境,Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。     

创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定

目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,并对其溶血活性进行评价。为今后的免疫学活性研究和单克隆检测试剂盒的研发奠定基础。方法构建pET28a( )-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲合层析(HisTag)纯化重组蛋白,并用溶血试验验证重组蛋白活性。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)重组蛋白VVC。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论成功用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素并对其纯化、复性条件进行优化。     

迟缓爱德华菌溶血活化蛋白EHA的原核表达及生物学活性

目的研究迟缓爱德华菌(Et)溶血活化基因(eha)原核表达蛋白EHA的生物学特性。方法构建重组载体pET28a+-eha,转入大肠埃希菌BL21,得到克隆子pEHA1。克隆子pEHA1超声破碎后离心,上清用SDS-PAGE电泳分析。在不同条件下,IPTG诱导pEHA1菌表达EHA蛋白,该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,检测其溶血活性及Vero细胞毒性。结果测序结果表明,pET28a+-eha重组质粒的eha序列完全正确。SDS-PAGE电泳显示表达出一条17kDa左右的条带。在30℃,IPTG浓度为0.5mmol/L的情况下,克隆子pEHA1被诱导6h产生的蛋白量最多。纯化的EHA蛋白无溶血活性及Vero细胞毒性。结论eha基因不是溶血素结构基因,可能是一个调控基因。     

创伤弧菌的药物敏感性

目的创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是"人鱼共患病"的重要致病菌,从患"腐皮病"卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)鱼中分离到创伤弧菌TO-3,以阿莫西林等44种药物进行敏感性试验。结果对青霉素类抗菌药物不敏感,对头孢菌素类等抗菌药物很强的耐药性,而对氟哌酸、头孢氯氨苄、氟嗪酸、米诺环素、呋喃妥因、复达欣、萘啶酸、四环素、庆大霉素等抗菌药物高度敏感。在17味中草药中对五倍子、诃子、黄连、石榴皮等中草药极为敏感。