欧洲鳗迟钝爱德华氏菌的分离鉴定

目的对欧洲鳗(Anguilla anguilla) 迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）菌株ET81126进行分离鉴定。方法采用形态特征观察、人工感染试验、API 20E细菌鉴定系统、16SrDNA测序以及属特异性PCR技术对菌株ET81126进行分析。结果人工感染试验表明菌株ET81126为致病菌,对欧洲鳗的半数致死量为4.55×104 cfu/g。按形态特征和API 20E细菌鉴定系统初步鉴定菌株ET81126为爱德华氏菌。通过16SrDNA测序,在GenBank上经同源性序列比对与迟钝爱德华氏菌（登录号EF467289）自然聚为一类,同源率达99％。属特异性PCR扩增图谱显示迟钝爱德华氏菌非典型菌株特有的230bp条带。结论综合生化指标和分子生物学鉴定结果,可确定菌株ET81126为欧洲鳗迟钝爱德华氏菌。     

鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定

目的对分离自发病欧洲鳗鲡的创伤弧菌疑似菌株进行准确的鉴定。方法首先尝试利用一对16SrRNA基因特异性通用引物PCR扩增一株鳗源创伤弧菌疑似株的基因组DNA，得到一个约500bp的DNA片段，将该DNA片段亚克隆至pMDl8-T载体，鉴定克隆化成功之后，送专业公司进行测序，得到一个502bp的DNA产物，NCBI上同源性比较表明，该片段与GeneBank上注册的创伤弧菌的16SrDNA序列同源性最高（100％），同时排除了哈维氏弧菌的可能。设计一对创伤弧菌溶血素特异性引物，实现了对鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定。结果建立一种简洁的鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定方法。结论国内首次自发病欧鳗分离到创伤弧菌，并给出分子鉴定证据。     

黄姑鱼创伤弧菌的分离和鉴定

目的从患病黄姑鱼体内分离出致病力较强的菌株L1,人工感染实验证实该菌株为黄姑鱼的病原菌。对该细菌进行了形态、生理生化特性测定和16SrRNA分子鉴定,测定16SrRNA基因序列,分析相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树。结果表明菌株L1与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的亲缘关系最近,具有98.7%的同源性。结合该菌株的生理生化特性,可鉴定菌株L1为创伤弧菌。     

我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析

目的 对17株来源于我国华东与华南地区的养殖鱼类迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)分离株进行多样性分析。方法 通过菌体血清凝集试验及16S rRNA与hsp60部分基因序列的聚类分析。结果 菌体血清凝集试验结果显示,鳗源迟缓爱德华氏菌ETY的抗O血清可凝集大部分鱼源迟缓爱德华氏菌;人源迟缓爱德华氏菌标准株ATCC15947的抗O血清仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY37有交叉凝集;鲶鱼爱德华氏菌EIV的抗O血清与鱼源迟缓爱德华氏菌无交叉凝集。2株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1和E29L与以上3种爱德华氏菌抗O血清不发生凝集反应。基于16S rRNA及hsp60部分基因序列构建的系统发育进化树显示,来源于不同地区的绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高,在基于16S rRNA构建的系统进化树中,山东地区分离自大菱鲆的迟缓爱德华氏菌聚为一支。3株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1、E29L、GK4与人源迟缓爱德华氏菌ATCC15947及人源鲶鱼爱德华氏菌EIV有一定亲缘关系。结论 我国华东、华南地区的鱼源迟缓爱德华氏菌分离株普遍具有相似的血清型和较高的进化同...     

草鱼肠炎嗜水气单胞菌分离株的主要特性及系统发育学分析

目的对分离于草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠炎的病原嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila),进行了主要理化特性方面较系统的表观分类学指征检验及系统发育学分析,为对该菌的有效鉴定提供依据。方法对死于肠炎病的鱼中分离到的5株病原嗜水气单胞菌(HC960715-1至HC960715-5),按常规方法进行形态特征、培养特性、主要生化及药物敏感性的检测。同时,择代表菌株(HC960715-1)进行16SrRNA基因的分子鉴定,测定16SrRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性,构建系统发生树。结果5株供试菌的主要生物学性状表现一致,代表菌株(HC960715-1)的16SrRNA基因序列长度为1429bp(GenBank登录号:AY966887),与GenBank数据库中的气单胞菌基因序列的相似性在98%和100%。结论根据表观分类学指征及系统发育分析结果,表明供试5株菌均为嗜水气单胞菌。对37种供试抗菌类药物的敏感性在株间无明显差异。     

布鲁氏菌和幽门螺杆菌等6种病原菌16S rRNA和cagA等基因的克隆与鉴定

目的克隆并鉴定布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因,为建立实时荧光定量PCR检测方法作准备。方法设计、合成布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌flaA、肝螺杆菌flaB和幽门螺杆菌的cagA基因的特异性引物;PCR扩增、克隆16SrRNA、flaA、flaB和cagA基因;对重组质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析。结果布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲杆菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的ca-gA基因PCR扩增产物分别在612bp、600bp、922bp、637bp、1545bp和1168bp处出现特异性目的条带,结果均与预期扩增的目的片段大小一致。将PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化感受态细菌大肠埃希菌JM109。对重组质粒pT-BC16SrRNA、pT-MP16SrRNA、pT-CP16SrRNA、pT-CJflaA、pT-HHflaB和pT-HPcagA分别进行酶切鉴定及PCR鉴定,结果均可见特异性目的条带。测序结果显示,布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因序列与GenBank中细菌相应序列同源性高达100%,说明上述6种致病菌的16SrRNA、flaA、flaB和cagA基因已成功克隆。结论成功克隆了布鲁氏菌16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因,为建立实时荧光定量PCR检测方法奠定了基础。     

43株甘肃临床分离非结核分枝杆菌分类鉴定

目的了解甘肃当前临床流行的非结核分枝杆菌(NTM)的病原谱特点及其主要NTM种类,为指导临床诊疗、有效防治NTM肺病提供参考依据。方法收集2012年~2014年来源于甘肃省不同地区的875株临床分离分枝杆菌菌株,经PNB/TCH方法初步鉴定为疑似NTM菌株,采用16SrRNA基因测序技术进行菌种鉴定。结果 875株分枝杆菌临床分离菌株中分离出疑似NTM菌株46株。经16SrRNA基因序列分析鉴定,43株为NTM,3株为诺卡氏菌。43株NTM菌株分别为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌、楚尔盖分枝杆菌、罕见分枝杆菌、偶然分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。其中,胞内分枝杆菌有31株,占总NTM菌株数的72.09%。结论甘肃省非结核分枝杆菌群以胞内分枝杆菌为主,应用16SrRNA基因序列分析鉴定方法能准确鉴定出NTM菌种,为临床诊治提供依据。     

新发现致病性产H_2S李斯特氏菌生物学特性研究

目的　对在畜间疫病流行区 ,新发现致病性产H2 S李斯特氏菌进行生物学特性研究 ,以确定其在微生物学中地位 ,为其命名提供依据。方法　从形态染色、培养特性、生化反应、抗原性方面鉴定 ,并利用分子生物学技术作DNAG Cmol%含量测定 ,PCR、16SrRNA序列检测同源性。结果　通过表型生物学特性鉴定 ,产H2 S李斯特氏菌与已知 7型李斯特菌不同 ,其G Cmol%为 3 0 .5 %、16SrRNA序列分析同源性与无害李斯特菌 (L .im)为 71.0 % ,灰色李斯特菌 (L .g)为 3 7.8% ,西氏李斯特菌 (L .s) 2 8.4 %。结论　经系统发育树分析 ,证实产H2 S李斯特氏菌为李斯特氏菌属 ,国际上首次报告的新种。     

一株鸭源大肠埃希菌的分离鉴定及毒力基因的检测

目的对从山东省枣庄市一鸭养殖场樱桃谷病死鸭中分离出的1株疑似大肠埃希菌进行鉴定,并进行其毒立基因的检测。方法采集山东省枣庄市一鸭养殖场病死鸭的脏器,进行病原菌的分离培养,革兰染色镜检,生化特征鉴定及药物敏感性试验;制作肝脾组织切片HE染色后观察组织病理学变化;通过PCR扩增16SrRNA进行分子鉴定、核苷酸同源性序列对比和系统进化树分析,对部分毒力基因进行PCR检测。结果该分离菌革兰染色阴性,菌落与菌体形态及生化鉴定结果均与大肠埃希菌相符。该菌对17种药物呈不同程度的耐药性,对4种药物中度敏感,4种药物敏感。病理切片观察病鸭心脏、肝脏、脾脏均出现不同程度的病变。PCR扩增16S rRNA序列长度为1 108bp,该序列与GenBank中公布的大肠埃希菌FJ949576.1、MH671483.1、JQ800462.1 16SrRNA核苷酸序列同源性99%,进化树显示该分离菌与大肠埃希菌FJ950548.1亲缘性较近。PCR检测该菌携带phoA、luxS、pfs、fimC、ompA、iss、tsh、ompT、iroN等9种毒力基因。结论樱桃谷病死鸭分离菌株为大肠埃希菌,携带多种毒力基因,具有高度耐药性。     

羊肺炎克雷伯氏菌感染症及病原菌检验与系统发育分析

目的对一起小尾寒羊病害进行发病情况、临床表现与病理变化、病原等方面的检验,旨在明确感染症的特征及相应的病原菌。方法在发病情况调查的基础上,对新鲜病死羊进行体表及剖检后的病变检验;同时以病变肝、肺、心血组织为材料做细菌分离与纯培养,对所分离的细菌进行形态特征、理化特性等方面的鉴定;选取经鉴定后的1个代表菌株(SKp-1株)进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列,构建了系统发育树;将代表菌株培养后制备成9×108CFU/ml的菌液,经接种感染健康小尾寒羊,测定其致病作用;对4株细菌以琼脂扩散法(K-B)做对抗菌类药物的敏感性测定。结果被检病死小尾寒羊无特征性临床表现,剖检可见肺肿胀,肠黏膜脱落、出血等。从肺、肝、心血组织均检出了纯一的同种细菌,经理化特性等鉴定表明为克雷伯氏菌属(KlebsiellaTrevisan 1885)的肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(K.pneumoniaesub-sp.pneumoniae)。所测代表菌株的16S rRNA基因序列长度为1415bp,在GenBank登录号为AY963633,与检索出的28种克雷伯氏菌属细菌16S rRNA基因序列同源性均在98~99%,在系统发育树中与肺炎克雷伯氏菌(登录号为AF453251)聚为一个分支。人工感染试验结果显示对小尾寒羊具有致病作用。用37种抗菌类药物所做的药敏试验结果显示在不同株间无明显的敏感与耐药性差异。结论所检小尾寒羊病例为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种感染。     

创伤弧菌FJ03-X2株培养条件的优化研究

目的探讨创伤弧菌毒株FJ03 X2的优化培养。方法以创伤弧菌毒株FJ03 X2进行实验,研究摇瓶培养温度、接种量、培养基、初始pH值、溶解氧等因素对菌株生长的影响,确定最适培养条件为：TSB培养基初始pH值为7.0,适宜接种量10%,培养温度28℃,装液量25mL/250mL,转速180r/min。培养菌数可达8×109cfu/mL,生物量为25mg/mL。以TSB为基础培养基,采用单因子和正交实验相结合的方法,确定最佳培养基主要成份为：葡萄糖0.2%、胰蛋白胨1.8%、大豆胨0.4%和玉米浆0.4%。以最佳培养基配方给菌体提供营养,在最适培养条件下培养,可以使培养液中的细菌生物量高达50mg/mL以上。结果得出创伤弧菌FJ03 X2的优化培养条件和培养基配方。结论国内首次优化鳗源创伤弧菌培养条件,并给出相关依据。     

绵羊附红细胞体部分16S rRNA基因序列测定和系统进化分析

从自然感染附红细胞体的石河子和杭州两地的绵羊无菌采集血液,分离附红细胞体并提取基因组,根据已公布的绵羊附红细胞体16S rRNA基因序列设计一对引物,进行PCR扩增。结果扩增出约1 100bp目的片段。测序结果表明:目的片段长1 080bp、1 079bp(GenBank收录号EU916726、FJ440328),同源性分析表明该序列与参考序列(AF338268)同源性达99.7%,证实该病原是绵羊附红细胞体。将该序列与5种支原体、14种血营养菌及立克次氏体等相应序列进行同源性比对,系统进化树表明,绵羊附红细胞体和其他血营养菌在进化关系上组成一个大的分支,与支原体科,支原体属病原最为接近,与立克次氏体科的病原较远。分析结果与Neimark等提出的观点一致,将这类血营养菌划归支原体科、支原体属。     

呼吸道感染致病菌16SrRNA基因V3、V6可变区序列分析及在液态芯片中应用的探索性研究

目的探讨呼吸道感染致病菌16SrRNA基因V3、V6可变区在液态芯片系统的应用价值。方法通过GenBank公布的呼吸道感染致病菌16SrRNA基因序列,设计并合成探针及引物,建立液态芯片检测系统,检测福建省立医院收集的52例呼吸道感染痰标本抽提的DNA,与测序结果比对,分析其灵敏度和特异度。结果呼吸道感染致病菌16SrRNA基因V3、V6区均存在差异,应用液态芯片可在3．5h得到检测结果,铜绿假单胞菌16SrRNAV6探针,可检测浓度大于10^2／μl标本,检测灵敏度为100．0％,特异度为100．0％;金黄色葡萄球菌16SrRNAV3探针灵敏度为66．7％,特异度为98．0％;金黄色葡萄球菌16SrRNAV6探针灵敏度为0．0％。结论呼吸道感染致病菌16SrRNA基因V3、V6可变区差异可应用于病原学诊断,但不适合检测所有的呼吸道感染致病菌。     

利用细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ分析青海藏区细粒棘球绦虫系统发育学

目的 囊型包虫病是一种广泛流行且危害严重的人兽共患寄生虫病。本文旨在分析流行于青南地区细粒棘球绦虫系统发育学及基因多态性。方法 本文利用线粒体 DNA细胞色素氧化酶亚单位 Ⅰ (COX Ⅰ )分子对收集到的流行于青海省的59例包虫病样本进行测序。总计71条序列(其中12条来自GenBank)碱基通过Clustal X软件比对,构建贝叶斯进化树。结果 流行于青海省包虫病样本大部分与细粒棘球绦虫G1型聚在一枝,还有三个样本与多房棘球绦虫(AB018440)聚在一枝。虽大部分棘球绦虫基因型属于G1型,但各自的基因型各不相同,具有丰富的多样性。结论 流行于青海省细粒棘球绦虫系统发育学比我们想象复杂。     

Identification of Vibrio vulnificus from patients with otitis media and septicemia by PCR method

Sucrose-negative colonies were isolated on TCBS agar plate from otorrhea specimens from otitis media patient in the Adult Diseases Examination Center, Hirosaki Medical Association. The isolate was identified as Vibrio vulnificus by nested PCR method which amplify V. vulnificus-specific sequences directed against 23S rRNA genes. The PCR method was applied to identify 6 strains originally isolated from septicemia patients in Kurashiki Central Hospital and formerly identified as V. vulnificus by phenotypic characteristics. When examined by the API20E system, the above PCR confirmed-V. vulnificus isolates were correctly identified as V. vulnificus with % ID 99.8, though this gave 3 different profiles. Cytotoxin-hemolysin gene was detected in otorrhea strain as well as septicemia strains by PCR method. The above results suggest that PCR method targeted cytotoxin-hemolysin gene is suitable for rapid and accurate identification of the isolate, because the result is obtained in less than 4 h. To our knowledge this is the first report on the V. vulnificus infection in Aomori Prefecture and the isolation from otorrhea.     

中华白蛉微卫星DNA序列的分离和多态位点筛选的初步研究

目的 分离中华白蛉的微卫星DNA序列,并筛选其中具有多态性的位点。 方法 应用中华白蛉基因组DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针（AAT）₁₇、（GA）₂₅、（CCT）₁₇和（TG）₁₈杂交,亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段,扩增放大后克隆并测序,构建中华白蛉微卫星DNA库。挑选合适的微卫星位点,建立PCR扩增体系。应用中华白蛉现场标本对不同的微卫星DNA进行扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的位点。 结果 本研究分离中华白蛉微卫星DNA的方法效率高,重组克隆阳性率为78.6%。构建的微卫星DNA库含有118条序列,GenBank登录号为FJ919812～FJ919932（登录号为FJ919833、FJ919836和FJ919869除外）,其中典型微卫星DNA序列72条（占61.0%）,非典型序列46条。在构建的中华白蛉微卫星DNA库中选择22个位点进行多态性筛选,电泳结果显示14个为多态位点,双核苷酸重复的位点比三核苷酸和多核苷酸重复位点的多态性高。 结论 首次构建了含有118条序列的中华白蛉微卫星DNA库,共获得14个新的多态微卫星位点。     

分支杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析

目的　建立鉴定分支杆菌分离株的 16S - 2 3SrDNA转录间隔区 (internaltranscribedspacer ,ITS)序列分析的方法 ,用该方法对临床分离株进行鉴定。方法　对从重庆某医院分离的 2 9株分支杆菌菌株分别进行了PCR扩增 ,得到它们的16S - 2 3SrDNAITS片段 ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行鉴定。结果　在ITS序列分析中 ,有 10株的序列分别与结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriumtuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌 ,脓肿分支杆菌的序列完全一致。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;4株 16SrDNA序列分析不能准确鉴定的分离株中其中 3株(M 4、M 5、M 12 )鉴定为戈登分支杆菌 ,1株 (M 2 3)鉴定为脓肿分支杆菌。部分分离株的的ITS序列在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列 ,这些不同的序列之间的相似程度为 2 7.1%～ 99.2 %。用临床分离株的ITS序列与其最相似的已知分支杆菌的ITS序列构建的系统发育树 ,菌株分群与 16SrDNA序列构建的系统发育树的分群基本一致。结论　分支杆菌的16S - 2 3SrDNAITS序列比 16SrDNA序列有更大的多样性 ,该序列分析可作为     

牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的 用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。 方法 改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。 结果 上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为（5.6±0.49）mm×（5.2±0.51）mm。扩增出的18S rRNA基因片段为812 bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与巴西的牛隐孢子虫（Cryptospridium bovis,GenＢank登录号为151935628）序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。 结论 上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C. bovis）。