改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0.02%胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞,光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态,自动生化仪定期检测培养肝细胞功能,RT-PCR半定量方法检测白蛋白mRNA,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数(2～3)×108cells/整肝,活力和纯度大于95%,生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降,加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平,白蛋白合成在第3～4天达到高峰,培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Percoll分离液纯化以及HepatoZYME-SFM无血清培养基培养,肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响

目的观察大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞体外共同培养时对两者生长、形态及功能的影响。方法采用原位二步Ⅳ型胶原灌注法、Percoll液密度梯度离心法分离Wistar大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞;体外将肝实质细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养。观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,每隔24 h检测培养上清液中清蛋白和谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平,并在培养36 h用放免法检测上清液中白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至15 d;共同培养组肝细胞生长增殖缓慢,细胞可培养存活至10 d。共同培养组上清液中清蛋白水平在24、36、48、60 h比单独培养组低(t=2.551~3.139,P<0.05);ALT、AST水平在24、36、48、60 h比单独培养组高(t=2.446~3.108,P<0.05);共同培养组Kupffer细胞保持IL-1I、L-6、TNF-α分泌功能,而单独培养组未检测到IL-1I、L-6、TNF-α。结论大鼠Kupffer细胞和肝实质细胞在适宜的培养条件下可进行共同培养,二者可以保持良好的分泌功能,可用于实验研究。     

应用微载体Cytodex 3高密度培养L-02人肝细胞系

目的　探讨用微载体进行 L - 0 2人肝细胞系高密度培养的方法 ,以期为生物人工肝提供有应用价值的生物材料。　方法　在限制贴壁的条件下 ,采用 Cytodex3为材料进行 L- 0 2人肝细胞的微载体培养 ,诱导肝细胞聚集体的形成 ,定期进行细胞计数及培养上清白蛋白、尿素、谷草转氨酶 (AST)、乳酸脱氢酶 (L DH )等生化指标的检测 ,并在光镜和透射电镜下观察生长情况。　结果　培养至第 6天时 ,所有的微载体均包满细胞 ,并形成微载体诱导的肝细胞聚集体 ,细胞数量达最高峰为 (17.1± 0 .76 )× 10 7/瓶 ,同时白蛋白和尿素的合成亦最高 ,浓度分别为5 3.81± 1.6 4m g/ L 和 5 .35± 0 .13m mol/ L。　结论　 Cytodex3培养的 L- 0 2人肝细胞可形成高密度的肝细胞聚集体 ,具有一定的生物合成和代谢功能。     

利多卡因对缺氧/复氧后肝细胞钙超载和细胞凋亡的影响

目的:探讨利多卡因预处理对L02肝细胞缺氧/复氧后肝细胞内钙离子变化和细胞凋亡的影响.方法:选用L02肝细胞缺氧/复氧损伤模型,随机分为缺氧/复氧组(Ⅰ 组)、利多卡因预处理组(Ⅱ组)和正常对照组(Ⅲ组);检测肝细胞缺氧4 h,复氧后10 h 细胞培养基中谷丙转氨酶(ALT)浓度、谷草转氨酶(AST)浓度、肝细胞内钙离子浓度、肝细胞凋亡率以及细胞形态结构变化.结果:缺氧/复氧后肝细胞内钙离子浓度升高,且与细胞凋亡率呈正相关(P＜0.05);Ⅰ,Ⅱ组细胞复氧10 h后肝细胞培养液中ALT浓度、AST 浓度、肝细胞内钙离子浓度、细胞凋亡率较Ⅲ组均升高(P＜0.05),倒置显微镜和电子显微镜示肝细胞损伤,可见凋亡细胞;Ⅱ组细胞复氧10 h后肝细胞培养液中ALT浓度、AST浓度、肝细胞内钙离子浓度、细胞凋亡率均低于Ⅰ组(P＜0.05),倒置显微镜和电子显微镜结果也显示Ⅲ组肝细胞比Ⅰ组损伤轻微.结论:利多卡因预处理可以缓解缺氧/复氧损伤后肝细胞内钙超载,降低细胞凋亡率.     

不同浓度的高锶矿泉水对人肝细胞增殖及功能的影响

目的:观察不同浓度的高锶矿泉水对LO2细胞(入肝细胞株)增殖和功能的影响.方法:LO2细胞分为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L锶矿泉水组(SMW)和双蒸水组(DDW),以5× 104/ml的浓度接种于培养板中,24h后,换成条件培养基培养至7d.分别于2d、3d、5d和7d后行MTT法观察细胞的增殖情况.培养5d的细胞分别用比色法测培养基中总胆红素(TB)的含量,和用赖氏法测细胞内谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性.结果:2mg/L SMW细胞增殖、胆红素摄取量和转氨酶活性无显著变化(P＞0.05);4mg/L和6mg/L SMW组细胞提前出现增殖峰,并较长时间地保持旺盛的增殖状态(P＜0.05);细胞摄取胆红素的能力增强(P＜0.05),AST活性无显著变化(P＞0.05),但ALT的活性降低(P＜0.05);8mg/L SMW组细胞增殖速度减慢、摄取胆红素量增多(P＜0.05),但细胞内ALT和AST的活性均降低(P＜0.05).结论:4～6mg/L浓度范围的天然高锶矿泉水对肝细胞的增殖和胆红素代谢有益,能降低转氨酶活性;但超过8mg/L浓度时可对肝细胞造成一定损害.     

剑尾鱼肝细胞原代培养

目的探讨剑尾鱼肝细胞原代培养的方法。方法分别用机械分散法、酶消化法对肝细胞进行分离,并比较在William’s E(Williams’Medium E)、DMEM、DMEM/F12无血清培养基中肝细胞的生长效果。结果⑴组织块培养法(机械分散法)的肝细胞在William’s E、DMEM、DMEM/F12无血清培养基中,温度25℃~28℃,pH 7.3左右时都可以短期正常生长,而生长效果好依次是William’s E、DMEM、DMEM/F12无血清培养基。⑵酶消化法分离的肝细胞的产量为(6.4±1.7)×106 cell/g肝组织,即时存活率为(85±6)%。24 h贴壁率不足20%。结论酶消化法培养肝细胞产量、即时存活率及贴壁率偏低。组织块培养法肝细胞生长良好,而不需要苛刻的条件,可以满足毒理学实验要求。培养肝细胞首选William’s E培养基。     

Construction of oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury model in the cultured neonatal rat myocytes

目的 为体外研究心肌缺血再灌注损伤,构建体外培养乳鼠心肌细胞氧糖剥夺/复氧损伤(H/R)细胞模型.方法 原代培养新生SD大鼠心肌细胞,细胞培养至第5 d,更换无糖培养基,同时将细胞置入三气培养箱(0.5% O2,5% CO2,94.5% N2)中氧糖剥夺培养,模拟体内心肌缺血损伤.实验分组依据氧糖剥夺时间分1、2、3 h组和正常对照组(C组).观察C组和氧糖剥夺各组复氧复糖6 h心肌细胞形态和超微结构,台盼蓝染色法测定心肌细胞存活率,应用全自动生化分析仪测定细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果 随氧糖剥夺时间延长,心肌细胞形态损伤渐加重,从仅表面颗粒增多至细胞皱缩,间隙增大,细胞超微结构表现线粒体肿胀加重;氧糖剥夺3 h组部分心肌细胞胞膜破裂,脱离贴壁生长,线粒体高度肿胀,部分膜破裂,肌丝溶解.同时随氧糖剥夺时间延长细胞存活率下降,细胞培养液LDH活性升高(P＜0.05).结论 成功建立体外培养乳鼠H/R模型,氧糖剥夺2 h为较适宜的模拟体内心肌缺血损伤时间.     

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

目的研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时肝实质细胞生长、形态及功能状况.方法原位二步IV型胶原灌注法联合Percoll液密度梯度离心法分离肝实质细胞与Kupffer细胞;体外进行两种细胞单独培养、肝细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养,观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,检测培养上清中白蛋白和糖的水平.结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至21 d;共同培养组肝细胞于48 h即开始出现少量的死亡细胞,细胞生长增值缓慢,细胞可培养存活至10 d.单独培养组上清白蛋白水平在48、96、120、144、168 h比混合培养组高(P<0.05);单独培养组上清糖水平在96、144、168 h高于混合培养组(P<0.05).结论肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;但共培养时肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,肝细胞存活时间缩短,提示在共培养体系要实现肝实质细胞和Kupffer细胞两者良好生长和功能的协调,体外共培养条件需进一步优化.     

乳鼠心肌细胞体外氧糖剥夺/复氧损伤模型的构建

目的为体外研究心肌缺血再灌注损伤,构建体外培养乳鼠心肌细胞氧糖剥夺/复氧损伤(H/R)细胞模型。方法原代培养新生SD大鼠心肌细胞,细胞培养至第5 d,更换无糖培养基,同时将细胞置入三气培养箱(0.5%O2,5%CO2,94.5%N2)中氧糖剥夺培养,模拟体内心肌缺血损伤。实验分组依据氧糖剥夺时间分1、2、3 h组和正常对照组(C组)。观察C组和氧糖剥夺各组复氧复糖6 h心肌细胞形态和超微结构,台盼蓝染色法测定心肌细胞存活率,应用全自动生化分析仪测定细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果随氧糖剥夺时间延长,心肌细胞形态损伤渐加重,从仅表面颗粒增多至细胞皱缩,间隙增大,细胞超微结构表现线粒体肿胀加重;氧糖剥夺3h组部分心肌细胞胞膜破裂,脱离贴壁生长,线粒体高度肿胀,部分膜破裂,肌丝溶解。同时随氧糖剥夺时间延长细胞存活率下降,细胞培养液LDH活性升高(P<0.05)。结论成功建立体外培养乳鼠H/R模型,氧糖剥夺2 h为较适宜的模拟体内心肌缺血损伤时间。     

SD大鼠肝细胞、Kupffer分离与培养/共同培养的实验研究

目的 建立稳定高效分离SD大鼠肝细胞与Kupffer细胞的实验流程,研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞共同培养Kupffer细胞对肝实质细胞生长、形态功能的影响,为体外原代培养肝细胞的应用及进行相关研究提供参考数据.方法 (1)原位2步Ⅳ型胶原灌注法消化SD大鼠的肝脏;(2)低速离心法分离肝实质细胞;(3)Percoll液密度梯度离心法分离肝Kupffer细胞;(4)单独培养肝实质细胞;以61比例贴壁共培养肝实质细胞与Kupffer细胞;(5)光镜分别观察单独培养与共同培养情况下肝实质细胞的生存和形态;(6)全自动生化仪检测单独与共同培养情况下培养上清白蛋白和糖水平并进行比较.结果 每只大鼠可分离的肝细胞产量平均为(2.03±0.26)×108,细胞活力为88%～95%,平均(91.7±2.11)%.Kupffer细胞产量平均为(3.19±0.20)×107,纯度为85%～92%.平均(88.5±1.83)%.192 h原代贴壁培养观察,单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变.2周后细胞开始死亡,培养至21 d时细胞全部死亡.结论 (1)通过本实验研究成功地建立了以肝下腔静脉为流人道的Ⅳ型胶原酶二步灌流法分离肝实质细胞以及联合Pereoll液密度梯度离心法分离Kupffer细胞的实验室操作程序.该操作程序稳定高效实用.(2)按61的比例在体外进行肝实质细胞与Kupffer细胞192 h贴壁共同培养实验,实验结果提示,肝实质细胞和Kuffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;这两种细胞简单的同步贴壁共同培养,肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,提示在共培养体系中,要实现肝实质细胞租Kupffer细胞良好生长和两者功能的协调发挥,尚需进一步建立更适宜的共同培养系统.     

大量分离乳猪肝细胞方法的实验观察

目的:通过两种不同方法大量分离乳猪肝细胞,观察分离肝细胞的活性和功能,探讨猪肝细胞的分离方法。方法:本实验以肝上下腔静脉作为体外乳肝细胞分离的灌注口,用倒置相差显微镜、血细胞计数板计数,台盼蓝拒染试验判断细胞活力,并用自动生化仪进行肝细胞功能的检测。结果:实验组分离的每克肝肝细胞数和肝细胞活性明显高于对照组,两者差异有统计学意义(P<0.05);实验组AST、ALT、LDH以及TBIL浓度低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验改进了胶原酶体外两步灌流法分离乳猪肝细胞,为肝细胞的大量分离提供了一定的理论和实验依据。     

重组热休克蛋白72对体外培养大鼠肝细胞脂肪变性的影响

目的探讨重组热休克蛋白72（HSP72）对体外50％胎牛血清培养的大鼠肝细胞脂肪变性及肝细胞损伤的影响。方法sD大鼠肝细胞分4组培养。①对照组：DMEM培养液（不含血清）与多粘菌素B;②实验组1：对照组培养液中加50％胎牛血清;③实验组2：对照组培养液中加50％胎牛血清与重组HSP72;④实验组3：对照组培养液中加重组HSP72。动态检测各组肝细胞内甘油三酯（TG）含量、脂肪变性率及悬液中ALT、AST含量。SPSS11．5软件统计分析实验结果。结果对照组肝细胞内TG含量及悬液中AIJT、AST含量无显著变化（均P〉0．05）,肝细胞脂肪变性率为0。实验组1、2肝细胞脂肪变性明显,肝细胞内TG及悬液中ALT、AST含量较对照组均显著升高（均P〈0．01）,且与其它组比较实验组2变化更为显著（P〈0．01）;实验组3肝细胞内TG无明显变化（P〉0．05）,肝细胞脂肪变性率为0,但悬液中A¨、AST含量却较对照组有显著升高（均P〈0．01）。结论重组HSP72能导致肝细胞损伤,但不能诱导肝细胞脂肪变性;重组HSP72能加重50％胎牛血清所诱导的肝细胞脂肪变性及肝细胞损伤。     

微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

标本溶血对生化检验结果的影响分析

目的探讨标本溶血对生化检验结果的影响。方法采用日立7600生化分析仪检测50例正常人血液标本溶血前后血清中的肝功能6项（ALT、AST、TP、ALB、TBiL、DBiL）,肾功能3项（BUN、Cr、UA）、心肌酶谱（LDH、CK、CK-MB、α-HBDH）以及血脂4项（TG、TC、HDL-C、LDL-C）的值。结果发现溶血标本对肝功能6项、心肌酶谱以及TC影响较大,差异显著（P〈0.05）;而对肾功能的指标几乎没有影响,对TG、HDL-C、LDL-C的影响也较小（P〉0.05）。结论标本溶血对一些常用生化检测项目有明显的干扰作用。     

复制型HBV-Tg小鼠原代肝细胞的培养

目的 建立复制型HBV-Tg原代肝细胞体外培养方法,观察HBV-Tg小鼠原代肝细胞的氧化应激敏感性.方法 改良的两步灌注法分离、纯化、培养HBV-Tg小鼠原代肝细胞,24孔板培养7天,每天换液,收集上清,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙氨酸转移酶(alanine transami...     

溶血对检测标本生化项目结果的影响

目的:研究标本溶血对生化检验结果的影响。方法:抽取并对照40例来自西山煤电职工总院的健康体检者溶血前、后的血液标本,比较血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、血尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、K+、Na+、Cl-、GLU、总蛋白(TP)等11项指标的差异。结果:溶血血清中的ALT、AST、LDH、K+、TBIL、TP结果明显高于未溶血血清中的水平,差异有统计学意义(均P<0.05)。而BUN、Na+、Cl–、GLU、UA溶血前后无显著差异(均P>0.05)。结论:溶血对部分生化检验结果有明显的干扰和影响,检验工作人员应严格把握环节,以确保结果准确,无误。     

标本溶血在生化检验中对结果的影响及对策

目的:探讨标本溶血对生化检验结果的影响。方法:选择进行体检的50例正常人的血液标本作为研究对象,采用全自动生化分析仪检测血液标本中的各项生化指标(包括TP、TBIL、AST、DBIL、ALT、CK、γ-GT、ALB、LDH、TC、HDL、TG、LDL)测定值的变化,并对溶血前后的各项生化指标进行对比分析。结果:经对试验结果对照分析,与正常标本相比,溶血后标本的DBIL、ALB、TC、TG、HDL、TBIL、LDL的值没有发生明显的改变,差异无统计学意义(P>0.05),而CK、TP、AST、LDH、ALT、γ-GT均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:临床检查中,溶血对血清中的AST、ALT、CK、TP、γ-GT、LDH等生化指标具有明显的干扰,在对测定结果进行分析,一定要注意是否溶血,并且采取一切可行的措施和方法,控制溶血的发生,必要可以重新采血,确保测定结果的准确性。     

不同剂量乌司他丁对大范围肝切除患者术后肝肾功能的影响

目的 评价不同剂量乌司他丁对大范围肝切除术患者术后肝肾功能的影响.方法 选择行大范围肝叶切除术患者144例,分为4组（n=36）,分别于术后第1、2、3天分别持续静脉输注1.0×10^5 U·h-1（Ⅰ组）、2.0×10^5 U·h-1（Ⅱ组）、3.0×10^ 5U·h-1（Ⅲ组）乌司他丁,C组给予等量生理盐水.分别观察4组患者术前、术后第1、2、3天血丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）含量的变化.结果 与C组比较,Ⅰ组ALT在术后T3时,AST、CRE在术后T2和T3时,BUN在术后T1-T3时活性有统计学意义（P＜0.05）.Ⅱ组、Ⅲ组ALT、AST、BUN、CRE在术后活性均显著降低（P＜0.01）,而TBIL在治疗组与对照组中均未有统计学差异（P＞0.05）.结论 大范围肝切除术后早期应用乌司他丁2 X105-3X105 U.h-1能够抑制ALT、AST、BUN、CRE活性的升高,且与用药剂量有关.     

复方甘草酸苷在猪肝细胞悬浮培养中的应用

目的探讨复方甘草酸苷对体外悬浮培养肝细胞的保护作用。方法原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞,将分离所得猪肝细胞分为2组,复方甘草酸苷组培养基中含有800ug/mL的复方甘草酸苷,对照组为普通培养组,悬浮培养1周,观察形态和功能的变化。结果2组肝细胞培养12h后均形成多细胞球样聚集体,复方甘草酸酐培养组肝细胞成团更为明显;复方甘草酸苷培养组上清液ALB在培养后24h、3d、5d高于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）,在培养24h后,与培养后12h相比,复方甘草酸苷组ALB开始升高,普通培养组ALB开始降低,其后2组都开始升高,至7d时下降（P〈0.05）;2组肝细胞培养上清液BUN含量随培养时间延长逐渐升高,但2组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;2组肝细胞上清液中ALT含量逐渐下降,第3～7天复方甘草酸苷培养组组ALT含量低于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）。结论复方甘草酸苷对体外悬浮培养的肝细胞具有保护作用。     

甘草减轻黄药子肝毒性的研究

目的探讨甘草减轻黄药子的肝毒性作用。方法采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法),观察不同剂量组、不同培养时间的肝细胞存活率,比较黄药子与甘草含药血清对体外培养的肝细胞存活率影响;用比色法检测细胞培养上清液ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH),分析黄药子与甘草配伍后肝细胞毒性的差异。结果黄药子高、中、低剂量组均可引起肝细胞存活率下降,存活率随着培养时间的延长及给药剂量的增高而降低;黄药子与甘草配伍组(配伍组)肝细胞的存活率显著提高,与黄药子高、中、低剂量组比较有显著差异,甘草配伍组ALT、AST、LDH活性受到抑制,与黄药子组比较有显著差异。结论黄药子含药血清对肝细胞有毒性作用,与动物给药剂量及细胞培养时间有关;黄药子与甘草配伍后,对肝细胞的毒性显著降低,甘草具有保护肝细胞的作用。