去除痘苗病毒显性表位B8R对外源抗原免疫原性的增强

目的 去除B8R对外源抗原免疫原性的影响,为降低载体的免疫优势从而提高疫苗的有效性提供参考.方法 利用针对痘苗病毒的pSC11质粒,构建插入OVA的质粒pSC11-OVA,在CV-1细胞中与去除B8R的痘苗病毒重组,筛选纯化获得重组病毒.利用体外培养细胞,检测B8R缺失和外源抗原插入对病毒感染复制特性的影响;利用感染小鼠模型,检测重组病毒诱发的针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应;采用体征及神经行为学评分系统,检测重组病毒的毒力.结果 B8R缺失和OVA导入对痘苗病毒的生物学特性无明显影响;去除B8R后,外源性OVA成为显性表位,针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应明显增强;去除B8R还可显著降低痘苗病毒的毒力.结论 去除B8R可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应,增加外源性抗原的免疫原性.去除痘苗病毒本身的显性表位,可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体.     

痘苗病毒介导人癌胚抗原的免疫原性实验研究

痘苗病毒介导人癌胚抗原的免疫原性实验研究①杨洁江悦华②罗超权杨太成②伍新尧王晓怀③杨英浩（中山医科大学生化教研室，广州５１００８９）①本课题为广东省卫生厅“九五”五个一工程资助项目②广州军区总医院医学实验科，广州５１００６０③广州军区总医院放射肿瘤科...     

HIV复制型痘苗病毒载体疫苗免疫原性分析

目的 分析比较HIV复制型痘苗病毒载体疫苗在小鼠和家兔体内的免疫原性。方法 HIV痘苗病毒载体疫苗vTKgpe以肌内、皮下、皮内3种途径接种小鼠，每周采血检测HIV特异性抗体和针对痘苗病毒载体的抗体，4周时取脾细胞用流式细胞仪检测细胞免疫。此外vTKgpe皮内途径接种2只家兔，每周采血检测抗体。结果 肌内和皮下免疫的小鼠在2周时开始出现HIV特异性抗体，4周时开始消失；针对痘苗病毒载体的抗体滴度在4周时急剧升高；血清吸附实验表明痘苗病毒抗体的升高对HIV特异性抗体检测有一定的掩盖。细胞免疫仅在皮内免疫的小鼠中检测到。家兔的HIV特异性抗体在2周时出现，并能维持一段时间。结论 在小鼠体内，肌内和皮下注射2种途径倾向于诱导体液免疫，而皮内接种则以诱导细胞免疫为主。家兔对痘苗病毒的敏感性要高于小鼠。     

表达2型单纯疱疹病毒糖蛋白D的重组痘苗病毒对动物…

用表达２型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ的重组痘苗病毒免疫ＣＢＡ小鼠，通过间接免疫荧光和甲甲基偶氮唑蓝法动态观察细胞毒性Ｔ细胞活性，均见增高并检测了其产生的抗体和动物的保护作用。同时对Ｒ－ｇＤ－Ｖ和２型单纯疱疹病毒产生的二次ＣＴＬ活性进行了比较，结果表明，Ｒ－ｇＤ－Ｖ产生抗体３周达高峰，７周下降为１：３２０，抗体对病毒击动物有保护作用，其中和指数为６３ 。     

恶性疟原虫抗原—痘苗病毒重组活疫苗株的实验室评价

以恶性疟原虫保护性抗原复合基因—痘苗病毒重组活疫苗候选株为研究对象 ,探索其免疫血清及IgG的体外抗疟原虫能力、保护性细胞免疫反应及换人血猕猴模型动物抗攻击能力试验。结果表明 ,受检免疫血清及IgG具有一定的体外抑制恶性疟原虫增殖作用。家兔及大白鼠免疫后 4～ 6周血清中可产生明显的IL 2活性 ,免疫后 6周家兔、大白鼠及小白鼠血清IFN的活性水平比免疫前明显升高。免疫后 1个月攻虫 ,免疫猴从第 3天一直到第 12天血检中均未发现疟原虫 ;而非重组痘苗病毒免疫猴第 3天后原虫感染率上升 ,第 6天原虫感染率最高达到 6 0 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,持续 13d ;空白对照猴第 3天后原虫感染率也上升 ,第 8天原虫感染率最高达到 2 5 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,持续 12d。结果初步表明该候选疫苗株具有一定的诱发体液免疫、细胞免疫反应及抗虫体攻击能力 ,值得做进一步的研究。     

表达HPV-16结构蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫效果研究

目的研究表达HPV—16结构蛋白L1和12的重组痘苗病毒（rVVL1L2）的免疫效果。方法以重组痘苗病毒rVVL1L2免疫C57BIJ6小鼠，用酶联免疫（ELISA）和酶联免疫斑点（ELISPOT）方法检测重组痘苗病毒诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平；利用C3肿瘤细胞在C57BIJ6小鼠中的成瘤模型，观察重组痘苗病毒在抗肿瘤移植实验和肿瘤生长抑制实验中对小鼠的免疫保护效果。结果重组痘苗病毒rVVL1L2免疫的小鼠，可以检测到针对L1和12特异的抗体、L1165-175肽特异性的、分泌IFN-的T细胞；同时可以观察到免疫后的C57BI/6小鼠，可以有效预防HPV．16相关肿瘤细胞（1．5×10^5C3细胞）的攻击；对已产生的肿瘤，可以延缓肿瘤细胞的生长速度。结论重组痘苗病毒rVVL1L2可以有效诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，为研究预防和治疗HPV-16感染的疫苗提供了实验资料。     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗…

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白的重组痘苗病毒能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株，首先将经聚合酶链反应修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７．５Ｋ早／晚期启动子控制下，将同位重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＾＋痘苗病毒天     

表达HPV16 L1、L2和E7蛋白的非复制重组痘苗病毒诱发的抗肿瘤免疫反应

目的:评价表达HPV16 L1、L2E7的非复制重组痘苗病毒疫苗的抗肿瘤免疫反应.方法:采用肿瘤预防、肿瘤治疗和肿瘤切除等方法,观察疫苗NTVJL1/L2E7的抗肿瘤效果,用酶联免疫斑点(ELISPOT)和CTL检测该疫苗在小鼠体内诱发的细胞免疫应答.结果:在肿瘤预防和肿瘤治疗试验中,疫苗可以分别使60%和50%的小鼠免受HPV16阳性的治疗细胞攻击,肿瘤切除试验中,疫苗可以使70%的小鼠免于肿瘤复发,与对照组之间的差异具有显著性.ELISPOT和CTL均检测出强的特异性细胞免疫水平.结论:NTVJL1/L2E7能够在小鼠体内诱发出理想的抗肿瘤免疫反应,可以作为防治宫颈癌的候选疫苗.     

结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立

目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性;应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析;采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证;采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差;经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.     

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。     

Identification from diverse mammalian poxviruses of host-range regulatory genes functioning equivalently to vaccinia virus C7L

Vaccinia virus (VACV) C7L is a host-range gene that regulates cellular tropism of VACV. Distantly related C7L homologues are encoded by nearly all mammalian poxviruses, but whether they are host-range genes functioning similar to VACV C7L has not been determined. Here, we used VACV as a model system to analyze five different C7L homologues from diverse mammalian poxviruses for their abilities to regulate poxvirus cellular tropism. Three C7L homologues (myxoma virus M63R, M64R and cowpox virus 020), when expressed with an epitope tag and from a VACV mutant lacking the host-range genes K1L and C7L (vK1L-C7L-), failed to support productive viral replication in human and murine cells. In nonpermissive cells, these viruses did not synthesize viral late proteins, expressed a reduced level of the early protein E3L, and were defective at suppressing cellular PKR activation. In contrast, two other C7L homologues, myxoma virus (MYXV) M62R and yaba-like disease virus (YLDV) 67R, when expressed with an epitope tag and from vK1L(-)C7L(-), supported normal viral replication in human and murine cells and restored the ability of the virus to suppress PKR activation. Furthermore, M62R rescued the defect of vK1L(-)C7L(-) at replicating and disseminating in mice following intranasal inoculation. These results show that MYXV M62R and YLDV 67R function equivalently to C7L at supporting VACV replication in mammalian hosts and suggest that a C7L-like host-range gene is essential for the replication of many mammalian poxviruses in mammalian hosts.     

Induction of protective immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) infection using highly attenuated recombinant vaccinia virus DIs

SARS-coronavirus (SARS-CoV) has recently been identified as the causative agent of SARS. We constructed a series of recombinant DIs (rDIs), a highly attenuated vaccinia strain, expressing a gene encoding four structural proteins (E, M, N and S) of SARS-CoV individually or simultaneously. These rDIs elicited SARS-CoV-specific serum IgG antibody and T-cell responses in vaccinated mice following intranasal or subcutaneous administration. Mice that were subcutaneously vaccinated with rDIs expressing S protein with or without other structural proteins induced a high level of serum neutralizing IgG antibodies and demonstrated marked protective immunity against SARS-CoV challenge in the absence of a mucosal IgA response. These results indicate that the potent immune response elicited by subcutaneous injection of rDIs containing S is able to control mucosal infection by SARS-CoV. Thus, replication-deficient DIs constructs hold promise for the development of a safe and potent SARS vaccine.     

The Orf virus E3L homologue is able to complement deletion of the vaccinia virus E3L gene in vitro but not in vivo

Orf virus (OV), the prototypic parapoxvirus, is resistant to the effects of interferon (IFN) and this function of OV has been mapped to the OV20.0L gene. The protein product of this gene shares 31% amino acid identity to the E3L-encoded protein of vaccinia virus (VV) that is required for the broad host range and IFN-resistant phenotype of VV in cells in culture and for virulence of the virus in vivo. In this study we investigated whether the distantly related OV E3L homologue could complement the deletion of E3L in VV. The recombinant VV (VV/ORF-E3L) expressing the OV E3L homologue in place of VV E3L was indistinguishable from wt VV in its cell-culture phenotype. But VV/ORF-E3L was over a 1000-fold less pathogenic than wt VV (LD(50) > 5 x 10(6) PFU, compared to LD(50) of wtVV = 4 x 10(3) PFU) following intranasal infection of mice. While wt VV spread to the lungs and brain and replicated to high titers in the brain of infected mice, VV/ORF-E3L could not be detected in the lungs or brain following intranasal infection. VV/ORF-E3L was at least 100,000-fold less pathogenic than wt VV on intracranial injection. Domain swap experiments demonstrate that the difference in pathogenesis maps to the C-terminal domain of these proteins. This domain has been shown to be required for the dsRNA binding function of the VV E3L.     

人癌胚抗原重组痘苗病毒转染树突状细胞体外诱导的抗肿瘤免疫

目的：研究人癌胚抗原重组痘苗病毒（rV-CEA)转染外周血树突状细胞（DC）后在外体诱导的抗CEA分泌性肿瘤免疫。方法：分离晚期结肠癌患者的外周血单核细胞，在体外用人重组粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）及白细胞介素4（IL－4）培养成DC，再用rV-CEA转染DC后激发自体T细胞，观察其体外激发自体T细胞的增殖能力及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对自体CEA分泌性肿瘤细胞的杀伤活性，并与野生型痘苗病毒（W－VV）及无病毒转染的DC所激发的T细胞进行比较。结果：经rV-CEA转染的DC能显著刺激自体T细胞的增殖，其激活的T细胞对CEA分泌性自体肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。结论：rV-CEA转染的DC可以诱导体CEA分泌性肿瘤免疫。     

The N-terminal domain of the vaccinia virus E3L-protein is required for neurovirulence, but not induction of a protective immune response

Encephalitis is a rare, but serious complication from vaccination against smallpox using replication competent strains of vaccinia virus. In this report we describe mutants of vaccinia virus, containing N-terminal deletions of the vaccinia virus interferon resistance gene, E3L, that are attenuated for neuropathogenesis in a mouse model system. These recombinant viruses replicated to high titers in the nasal mucosa after intra-nasal infection of C57BL/6 mice but failed to spread to the lungs or brain. These viruses demonstrated reduced pathogenicity after intra-cranial infection as well, indicating a decrease in neurovirulence. Intra-nasal inoculation or inoculation by scarification with a low dose of recombinant virus containing a deletion of the entire N-terminal domain of E3L protected against challenge with a high dose of wild-type vaccinia virus, suggesting that this replication competent, but attenuated strain of vaccinia virus may have promise as an improved vaccine for protecting against smallpox, and as a vector for inducing mucosal immunity to heterologous pathogenic organisms.     

免疫酶技术在修饰的安卡拉痘苗病毒感染性滴度检测中的应用

 修饰的安卡拉痘苗（modified vaccinia Ankara，MVA）是MVA病毒在原代鸡胚成纤维细胞（CEF）中经过一系列的传代得到^[1]，在人体内可以表达 MVA 病毒蛋白及其携带的外源基因蛋白，但却不形成完整的病毒颗粒，为人体内复制缺陷性病毒^[2]，安全性好，即使在免疫功能缺陷病人和免疫抑制的恒河猴体内也未显示出明显的副作用^[3]。近年来，重组 MVA 病毒广泛地用于预防性疫苗和感染性疾病、癌症治疗的基础与临床研究^[4]，其中以 MVA 病毒作为载体的疫苗是最有希望用于预防人类艾滋病的活载体疫苗之一^[5]。由于 MVA 病毒本身的繁殖特点，其滴度的检测不适合采用常规的蚀斑法进行^[6]；而常规微量细胞病变（cytopathic effect，CPE）法相对耗时，对细胞培养要求高，往往受到主观因素的影响，因而不稳定且精确度降低^[7]，给检测工作带来不便。上世纪 90 年代初 Usuba 等^[8]建立了免疫酶技术测定流感病毒感染性滴度的方法，较常规方法省时、结果准确﹑重复性好。我们就免疫酶技术在 MVA 病毒感染性滴度检测中的适用性进行了探讨，旨在建立一种准确、快速的 MVA 病毒感染性滴度检测方法。......     

灭活与减毒两种甲肝疫苗免疫后诱导细胞免疫应答初探

目的 对国内普遍应用的减毒和灭活甲肝疫苗诱导的细胞免疫水平(产生时间、应答水平)进行检测和比较.方法 筛选健康志愿者18人,随机分组后分别接种甲肝减毒活疫苗和甲肝灭活疫苗.按实验程序以周次为时间点采血,用化学发光法对特异性甲肝抗体(HAY-IgG)进行检测;同时收集外周血单个核细胞(PBMC),用特异性甲肝抗原刺激后,以酶联免疫斑点试验(ELISPOT)法检测效应T细胞分泌TH1型细胞因子IFN-γ的情况;用胞内细胞因子染色法测定CD+ T和CD8+T淋巴细胞中分泌IFN-γ的阳性细胞百分比,Lumlnex法检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4等多种细胞因子水平.结果 两种疫苗均可诱导产生特异性抗HAV抗体,且观测期间抗体水平差异无统计学意义.两种疫苗接种初期即可诱导产生病毒特异性T细胞免疫应答反应,同时伴随高水平的效应细胞因子IFN-γ产生.在免疫接种后1-3周,灭活疫苗诱导的细胞免疫应答水平高于减毒疫苗;而在4-6周,减毒疫苗诱导的细胞免疫应答水平明显增高,超过灭活疫苗.灭活疫苗所诱导的细胞免疫应答在加强免疫后明显增强.结论 两种疫苗接种初期均可诱导体液和细胞免疫应答;灭活疫苗加强免疫后可激发记忆性免疫应答.