大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及初步鉴定

目的 探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,分析其部分表型特点,为细胞移植治疗中枢神经系统疾病奠定基础.方法 采用贴壁筛选法分离纯化大鼠MSCs,进行培养,传代扩增,免疫组化鉴定细胞是否表达具有干细胞特性的标记抗原-神经巢蛋白(nestin),并用流式细胞仪进行荧光检测初步鉴定.结果 分离后的MSCs出现增殖性生长,免疫组化显示巢蛋白(nestin)表达阳性,经流式细胞仪检测显示CD44,CD90阳性,CD45阴性.结论 在体外可培养出较大丰度大鼠骨髓间充质干细胞,而且此方法简单易行.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 体外观察大鼠骨髓间充质干细胞的基本生物学特性,建立rMSCs的分离培养方法,为诱导分化成肌研究打下基础.方法 采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs.观察细胞的形态和生长特性,倍增时间,生长曲线,用流式细胞仪分析rMSCs的表面抗原.结果 体外培养的rMSCs很快贴壁.4～8d即贴壁80%,细胞增殖迅速,7d左右即可达到80%融合.流式细胞仪分析CD90、CD13、CD44表达强阳性,CD14、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性,符合MSCs的表面抗原特征.结论 经Percoll密度梯度离心法获得的rMSCs细胞株较纯,可作为组织工程中的种子细胞来源,但大鼠MSCs在体外培养过程中易于衰老.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行内皮细胞特异性标志物鉴定,测定内皮细胞NO的释放量,电镜观测W-P小体.结果:MSCs在体外传代扩增后流式细胞仪检测结果显示CD29表达阳性,CD34、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征并具特异性W-P小体,可表达CD34,而不表达CD45,能释放NO.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法骨髓穿刺法抽取新西兰白兔髂骨骨髓5ml，应用密度梯度离心法分离纯化MSC并进行体外扩增，倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况，计数细胞数目，绘制细胞乍长曲线。HE染色光镜观察细胞形态，采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。结果成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法。生长动力学分析发现，传代细胞随传代次数的增加其增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强，生长旺盛。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞，第3～5代细胞增殖能力强，可用于进一步的研究工作。     

骨折后外周血间充质干细胞浓度变化的实验研究

[目的]观察骨折后不同时间点外周血间充质干细胞(MSCs)浓度变化,并比较其与骨髓间充质干细胞生物学特性的异同.[方法]根据不同处理条件将SD大鼠分为:对照组和骨折组(骨折后1、3、7d共3组),每组20只.分别于骨折后1、3、7d抽取外周血,密度梯度离心法分离培养外周血MSCs,计数成纤维细胞集落形成单位(CFU-Fs)数.流式细胞仪检测细胞表面标记(CD44、CD90、CD34、CD45).成骨、成脂诱导,碱性磷酸酶、茜素红和油红染色检测其分化特性.[结果]原代外周血MSCs呈集落生长,骨折组集落数明显多于对照组,其中以骨折后3d组形成的集落数最多,具有显著差异(27.25±11.52 CFU-Fs/cuhure vs 2.80±3.96 CFU-Fs/culture,P＜0.01).外周血MSCs高表达CD44、CD90,低表达CD34、CD45,不同的是CD34小部分呈阳性(＜20％).与对照组骨髓MSCs的诱导结果相同,外周血MSCs成骨诱导后28 d出现钙结节,茜素红染色阳性;成脂诱导后21 d有大量脂滴出现,油红染色阳性.[结论]外周血体外密度梯度离心法分离培养的细胞具有多潜能分化的MSCs表面标记且可以向成骨、成脂分化.骨折后外周循环中MSCs数量明显增多,呈一定的时序性变化,可能参与骨折修复.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,并研究其生物学特性.方法 取大鼠股骨和胫骨,以Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,MTT法测定细胞的生长曲线,流式细胞仪细胞表面抗原.结果 原代分离的BMSCs,培养48 h开始贴壁,胞体由圆形变为椭圆形、多角形或短梭型;培养第12天,见胞体渐变为长梭型,并达90%单层融合;经传代扩增,细胞进一步纯化.7代以前,细胞在2 d内处于潜伏期,第3天进入对数生长期,第7天进入平台期;10代后增殖速度变慢;流式细胞仪鉴定BMSCs表而抗原,CD44、CD90、CD34阳性率分别为99.62%、95.13%、2.06%.结论 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法有效分离纯化大鼠BMSCs,且细胞生长稳定,增值能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性.     

小鼠胎肝间充质干细胞的体外成骨诱导及复合陶瓷化骨的实验研究

目的探讨小鼠胚胎肝脏间充质干细胞的体外分离培养方法，并观察其成骨分化潜能及与陶瓷化骨支架材料的复合能力。方法将小鼠胎肝组织制成单细胞悬液行原代和传代培养，流式细胞仪检测其表面标志。用化学成骨诱导体系对纯化的胎肝间充质干细胞行成骨诱导，并进行成骨功能检测。将其与经过Ⅰ型胶原表面改性的陶瓷化骨复合培养，观察细胞在其上的黏附生长情况。结果原代培养的胎肝间充质干细胞，具有集落形成能力，为梭形或多角形。易于传代，传代细胞与原代细胞大小、形态相似。流式细胞仪检测表明，传代后的细胞CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性，表达间充质干细胞的特征标志。成骨诱导7d后碱性磷酸酶染色可见有较多阳性细胞，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性；14d后，细胞碱性磷酸酶活性定量检测明显增高；28d后，矿化结节染色呈阳性。将细胞与经胶原表面改性后的煅烧陶瓷化骨复合培养。扫描电镜见载体上有大量细胞黏附于材料表面。结论小鼠胎肝间充质干细胞易于获取及传代；体外成骨诱导后可向成骨细胞方向分化；能在陶瓷化骨支架材料上黏附生长。     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

体外培养的人脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的:了解体外培养的人脂肪间充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力.方法:体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数,行成骨和成脂诱导,流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子.结果:人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CD106,而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G 2/M所占比例分别为79.1%、19.7%和1.3%.分离细胞在诱导体系下可以向成骨和成脂方向分化.结论:脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点,体外能够向成骨和成脂方向分化.     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

冠心病病人骨髓间充质干细胞的生物学特征评价

目的　确立胸骨骨髓间充质干细胞分离和培养的方法 ,评价其生物学特征。方法　骨髓取自行冠状动脉旁路移植术的冠心病病人胸骨切口 ,用Percoll液分离骨髓MSCs,体外培养扩增 ,观察细胞生长特性 ,流式细胞仪检测骨髓MSCs表型特征、细胞周期。结果　贴壁的骨髓MSCs多数呈梭形。骨髓MSCs能连续传 15代以上 ,但是第 5代以后或老年病人的细胞增殖速度减慢。骨髓MSCs的表型特征为CD2 9、CD4 4阳性 ,CD34、CD4 5阴性。多数骨髓MSCs在细胞周期的G0 /G1期。结论　冠心病病人手术时从胸骨切口取骨髓并分离培养骨髓MSCs的方法可行 ,骨髓MSCs具有较好的增殖更新潜能 ,是细胞心肌成形术中理想的细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞的实验观察

目的:研究表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)加条件培养基体外诱导大鼠 MSCs 向表皮细胞定向分化的可行性。方法:采用 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液分离扩增大鼠骨髓 MSCs,免疫细胞化学染色及流式细胞仪进行鉴定。传至第3代的大鼠 MSCs 用表皮生长因子(EGF)、条件培养基等定向诱导 MSCs 分化为表皮细胞;免疫细胞化学对细胞角蛋白 CK5/8、19(Cytokeratin5/8、19)阳性表达细胞进行检测。结果:从大鼠骨髓中分离培养的 MSCs 增殖能力强,细胞表面标志 CD34、CD45阴性,CD29、CD44阳性,流式细胞仪检测显示细胞纯度高,诱导后7d 细胞免疫化学显示角蛋白5/8、19染色阳性,具有表皮细胞特征。结论:从大鼠骨髓中分离培养出的问充质干细胞,具有自我更新和增殖能力强的特点,经诱导可定向分化表达角蛋白。     

成人间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值.方法 抽取健康成年骨髓,Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法经连续传代后改用含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的条件培养基培养,在相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪细胞表面分子标志鉴定,免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋门的表达,同时测定细胞内碱件磷酸酶的含量.结果 BMSCs原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、糖原染色鉴定为成骨细胞.结论 BMSCs经合理的体外诱导培养后符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源.     

人脐血源和骨髓源间充质干细胞神经前体细胞分化的研究

目的 对比研究人脐血和骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外的分离、培养和生物学特性,并观察其分化潜能和形态学变化,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法分别分离纯化成人骨髓和脐血源MSCs,体外培养和连续传代,并在含有2%B27的Neurobasal培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子,将获得的MSCs向神经干细胞定向诱导,利用倒置显微镜连续观察细胞培养、传代和向神经细胞表型转化过程的形态学变化;采用免疫组化和荧光免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定.结果 原代分离的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在接种后48 h贴壁,7 d细胞呈长梭形,有一定的方向性,并达到90%融合;而脐血间充质干细胞(UMSCs)48 h后贴壁,似乎贴的不牢,持续14d才能形成小丛、小簇、小集落,21 d排列才有一定的方向性.培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经前体细胞样表型,免疫组化和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志β微管蛋白(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质相关蛋白(GFAP).结论 人脐血和骨髓中含MSCs,且具备其基本恃征,体外培养UMSCs生长速度比BMSCs缓慢10 d～15 d左右,传代以后的各组细胞生长速度与形态无明显差异.骨髓和脐血来源的MSCs在体外可定向诱导分化为神经细胞.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化

目的 观察不同条件下骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导分化为肾小管上皮样细胞的差异。 方法 抽取SD大鼠的骨髓,经密度梯度离心分离,联合贴壁筛选法获取纯化的MSC。以流式细胞仪鉴定间充质干细胞表面标志。取扩增3代的MSC分组培养：（1）对照组：用含胎牛血清培养基;（2）全反式维甲酸（ATRA）组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA;（3）联合诱导组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA+表皮生长因子（EGF）+骨形成蛋白（BMP-7）。诱导7 d后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;化学染色检测细胞碱性磷酸酶表达;免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18（cytokeratin-18）、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。 结果 流式细胞仪显示,体外分离培养的第3代MSC,CD44阳性细胞表达率为97.8%±0.9%;CD90阳性细胞表达率为96.8%±1.4%;CD29阳性细胞表达率为97.6%±2.4%;而CD11b/c阳性细胞表达率为13.2%±0.6%; CD34阳性细胞表达率为1.2%±0.5%。诱导7 d后,与对照组长梭形细胞相比,ATRA组部分细胞为圆形、短梭形单层排列;联合诱导组的大部分细胞为圆形、短梭形,细胞密集处呈鹅卵石样排列。碱性磷酸酶染色显示,对照组细胞为阴性;ATRA组部分细胞阳性;联合诱导组阳性细胞数明显增多。免疫细胞化学显示,ATRA组和联合诱导组细胞cytokeratin-18阳性表达率分别为29.47%±1.08%和47.52%±2.13%,显著高于对照组（P ＜ 0.05）;E-cadherin阳性表达率分别为14.88%±2.46%和36.15%±1.13%,也显著高于对照组（P ＜ 0.05）。 结论 在体外模拟的急性肾衰竭微环境中加入ATRA可诱导MSC部分分化为肾小管上皮样细胞。联合EGF、BMP-7共同诱导能进一步促进MSC向肾小管上皮样细胞分化。