应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病

本研究旨在应用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD),采用B系ALL18对引物、T系ALL8对引物进行PCR反应扩增Ig/TCR基因重排,以Ig/TCR基因重排作为追踪的分子标记,应用SYBR Green I染料法对儿童ALL-MRD水平进行定量。研究结果表明:9例B-ALL患儿中有8例重排,找到患儿重排标记(marker)的机率为88.8%;并对诱导化疗后(第33天)骨髓MRD检测发现,其MRD水平明显下降。结论:本研究证实Ig/TCR基因重排可作为检测儿童ALL MRD标记,SYBR green I实时荧光定量PCR是一种可靠的、相对敏感的、并且比较容易的作为常规检测。     

实时定量PCR检测血液恶性肿瘤的微小残留病

实时定量PCR(RQ-PCR)是近年出现的一种新的核酸定量技术,将常规PCR与探针杂交技术融为一体.在PCR反应体系中加入荧光探针,该探针与靶DNA/cDNA特异性结合.PCR反应延伸阶段,Taq酶发挥其5'→3'外切酶活性将荧光探针切断,荧光信号得以释放,荧光信号强度与PCR产物成正比.因此,通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化,可以在一个密闭体系中对待测标本进行精确定量分析.RQ-PCR成功地解决了常规PCR不能定量、扩增产物污染而导致假阳性、需进行PCR后处理等问题,为检测血液系肿瘤微小残留病提供了快速、简便、精确、敏感、可靠的工具.本文阐述了RQ-PCR的基本原理以及在血液系统恶性肿瘤,如急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和恶性淋巴瘤微小残留病检测中的应用.     

急性髓系白血病微小残留病监测的研究进展

急性髓系白血病(AML)是常见的血液系统恶性肿瘤.近年来随着新的化疗药物的出现以及化疗方案的不断完善,急性髓系白血病的无病生存率及总体生存率不断提高,但是仍然要面对缓解后复发这一难题.目前认为复发的主要原因是微小残留病(MRD)的存在,AML的MRD监测对于AML疗效评价,预后预测和指导个体化治疗具有重要意义.近年来M...     

急性髓系白血病微小残留病检测的临床意义

目的探讨微小残留病（MRD）检测在急性髓系白血病预测复发及指导治疗的临床意义。方法选择32例初治急性髓系白血病（除外M3）患者128份标本,利用多参数流式细胞术（FCM）进行微小残留病检测,CD45/SSC设门,选择2-4组四色抗体组合,从诱导化疗后第21天开始,每1-3个月监测一次。结果按照首次诱导治疗后第21天MRD水平将32例AML分为高（MRD〉1×10-2）、中（1×10-2〉MRD〉1×10-4）、低（MRD〈1×10-4）三组。高、中、低三组的2年复发率依次为83.3%、11.1%、0。其中MRD〉1×10-2组2年复发率最高,MRD〈1×10-4组预后好,两组的复发概率差异有统计学意义（P〈0.05）。形态学与MRD动态监测两年结果显示,其中26例缓解,6例复发。6例形态学复发者均在MRD持续阳性4-6个月出现。形态学完全缓解时MRD阳性组与阴性组的复发率有显著性差异（P〈0.05）。结论 MRD〉1×10-2高度提示复发,MRD阳性比形态学复发出现早,连续监测MRD对个体化治疗和预测复发有重要意义。     

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病患者MLL-AF9融合基因表达的预后意义

本研究旨在探讨急性髓系白血病（AML）患者治疗过程中,应用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）检测混合谱系白血病（MLL）的相关融合基因MLL-AF9的基因表达水平及其对监测微小残留病（MRD）的价值。应用RQ-PCR精确地定量检测433例初治AML患者中11例舭L-AF9融合基因阳性患者的表达水平,分析该基因表达水平的变化与临床表现的关系。结果显示：患者MLL-AF9融合基因表达水平初诊时为（1．3-55．28）％;5例单纯化疗患者之中有2例在第1个疗程结束后至第2疗程开始前,该融合基因表达水平〈0．1％,2例全部获得血液学完全缓解且存活;3例MLL-AF9融合基因≥0．1％,均未获得血液学完全缓解且仅1例存活。6例造血干细胞移植患者中,有4例在移植前1个月内该融合基因表达水平〈0．1％,全部患者存活且无复发;2例≥0．1％,均在移植后复发、死亡,且在骨髓细胞形态学复发前1个月内该基因表达水平均≥0．1％。结论：RQ-PCR检测MLL-AF9融合基因可以反映患者MRD的动态变化,与患者的临床预后存在内在相关性,是检测预后的良好指标。此外,RQ-PCR可能有早期检测分子生物学复发的潜力。     

应用荧光定量PCR检测急性白血病微小残留病的临床意义

对于完全缓解的白血病患者,体内存在的微小残留病（MRD）是复发的主要根源？本实验是通过双链DNA结合SYBR GreenI的实时PCR方法应用免疫球蛋白重链（IgH）和T细胞受体（TCR）基因重排作为ALL微小残留病的检测靶基因,实验证明：MRD可以     

急性髓系白血病微小残留病的多色流式细胞术检测

目的:建立本实验室急性髓系白血病微小残留病检测的十色抗体组合方案,探讨其临床应用价值.方法:根据初发急性髓系白血病患者白血病细胞的抗原表达特征,采用多参数流式细胞术检测骨髓微小残留病,并将检测结果与骨髓细胞形态学和PCR结果进行比较,确定本实验室微小残留病检测的十色抗体组合方案.结果:分析郑州大学第一附属医院392例初...     

流式细胞术在急性髓系白血病微小残留病中的应用

目的研究多参数流式细胞术(FCM)监测微小残留(MRD)水平对急性髓系白血病(AML)的复发预测及治疗指导方面的临床意义。方法选取37例诱导化疗后形态学完全缓解的AML患者,在诱导化疗后和巩固治疗后,用FCM监测MRD水平。结果 17例MRD阳性的患者最终发生复发,其MRD阳性检测时间比形态学诊断时间平均提前5个月。诱导化疗后、巩固治疗后的MRD阳性组和阴性组的临床复发率均有显著性差异(P0.05),诱导化疗后MRD阳性组的临床复发率低于巩固治疗后MRD阳性组,二者之间没有显著性差异(P0.05)。结论 FCM连续监测MRD水平能够有效预测AML患者的复发,并指导临床治疗。     

急性髓系白血病M_2微小残留病与细胞遗传学关系探讨

目的 了解急性髓系白血病(AML)M2微小残留病(MRD)水平与细胞遗传学分组的关系.方法 采用多参数流式细胞仪(MFC)进行白血病免疫分型,然后再根据白血病相关免疫表型(LAIP)选择抗体组合,完成对117例M2病人的MRD监测.结果 将初次缓解AML-M2病人的微小残留病灶水平以5×10-4为界,在细胞遗传学预后较好组、预后中等组、预后较差组之间进行比较,发现三组MRD水平差异无显著性.动态监测中比较了45例患者1年内不同遗传学分组MRD从10-3水平后上升到10-2水平的发生率:预后较好组33%,预后中等组32%,预后较差组50%.结论 MFC检测AML-M2病人MRD水平可用于评估治疗反应及预测复发.     

定量PCR方法检测儿童ALL微小残留病

为深入研究儿童急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）微小残留病（ＭＲＤ）的生物学特性及病程中ＭＲＤ的动力学变化，有必要对体内ＭＲＤ水平进行定量。本文拟就国外近年来定量ＰＣＲ方法检测儿童ＡＬＬ ＭＲＤ的研究进展作一简介，主要对各种方法的原理，特点及定量ＭＲＤ检测的临床意义予以综述。     

实时定量聚合酶链反应动态监测白血病治疗后微小残留病研究

目的建立急性早幼粒细胞白血病(APL)实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测方法,并检测APL治疗后微小残留病(MRD),评价MRD检测的意义。方法应用RQ-PCR对96例APL患者的骨髓标本进行分析,检测PML/RARa融合基因的转录水平。结果 (1)RQ-PCR与传统巢式PCR(RT-PCR)检测结果的差异有统计学意义(P<0.05),提示应用RQ-PCR检测PML/RARa融合基因转录水平的敏感性高于RT-PCR。(2)RQ-PCR可对PML/RARa融合基因进行定量检测,监测患者的PML-RARa融合基因拷贝数水平变化,结果显示初诊时较高,有效治疗后迅速下降,复发时又出现上升,提示若患者在完全缓解(CR)后PML/RARa融合基因拷贝数呈现上升趋势,其复发机率大。结论 RQ-PCR检测作为APL治疗后微小残留病检测的方法,准确可靠,可以判断治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要的临床应用价值。     

定量PCR方法检测儿童ALL微小残留病

为深入研究儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)微小残留病(MRD)的生物学特性及病程中MRD的动力学变化,有必要对体内MRD水平进行定量。本文拟就国外近年来定量PCR方法检测儿童ALL MRD的研究进展作一简介,主要对各种方法的原理、特点及定量MRD检测的临床意义予以综述。     

多参数流式细胞术动态监测急性髓系白血病微小残留病的临床研究

目的:探讨8色流式细胞术动态监测急性髓系白血病(AML)患者微小残留病(MRD)的预后意义。方法:使用8色流式细胞术对282例初治缓解的AML患者进行MRD动态监测,通过受试者工作特征曲线(ROC)确定预测复发的MRD阈值,分析患者从出现MRD⁺到临床复发的时间,比较不同MRD变化情况的患者总生存时间(OS)和无复发生存时间(RFS)的差异,对影响MRD^-患者复发的相关因素进行单因素和Logistic回归分析。结果:ROC曲线确定预测复发的MFC-MRD阈值为0.105%,MRD⁺患者复发率明显高于MRD^-患者[52.45%(75/143例) vs 35.97%(50/139例),P=0.005]。MRD持续阳性组和阴性转阳性组患者比阳性转阴性组和阴性阳性波动组患者在出现MRD⁺后更早出现复发(P<0.005)。生存分析结果表明,MRD持续阳性组患者的OS、RFS时间较持续阴性组、阳性转阴性组和阴性阳性波动组患者明显缩短(P<0.005)。MRD阴性转阳性组与持续阳...     

实时定量PCR动态监测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的临床意义

目的:探讨实时定量PCR(RQ-PCR)监测PML-RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的临床意义.方法:采用实时定量PCR(RQ-PCR)法监测患者骨髓PMLRARα融合基因亚型及动态变化.结果:初发32例患者中28例(87.5%)患者PML-RARα融合基因阳性,其中长型(L)19例(67.9%),短型(S)9例(32.1%).23例(82.1%)患者初次诱导后完全缓解,其中L型18例(94.5%),S型5例(55.6%),L型完全缓解率优于S型(P＜0.05),而复发率和病死率均低于S型,但差异无统计学意义(P＞0.05).长期随访的28例完全缓解患者,4例分子学复发,其中1例发生于第一次完全缓解后3个月,诱导缓解治疗后达第二次完全缓解,随后3个月再次分子学与血液学复发,再次诱导后达第三次完全缓解;3例在第一次完全缓解后3、4个月复发,经1疗程诱导后缓解,随访结束时生存期已达24个月.结论:APL初诊时PML-RARα融合基因亚型的检测可在一定程度上提示疾病的预后.在完全缓解期定期监测PML-RARα融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗,避免血液学复发.     

微小残留白血病检测在急性髓系白血病治疗及预后判断中的意义及研究进展

急性髓系白血病(AML)是较为常见的造血系统恶性克隆性疾病.虽然目前临床应用大剂量化疗和干细胞移植等手段取得了一定的疗效,可延长部分患者无病生存期,但是恶性疾病易复发的特点使得其长期生存率依旧很低.微小残留白血病(MRL)是导致白血病复发的重要原因,若能及时发现残留病变并施加相应的临床干预,对于减少缓解后复发,改善白血病预后将提供极大的帮助.目前,尚无对MRL的统一标准定义,但现有的技术可以在一定程度上对MRL进行相关指标的检测,利用多参数流式细胞技术(MFC)以及实时荧光定量PCR(RQ-PCR)等手段可监测MRL,这对MRL明确诊断后治疗决策的选择以及治疗后预后判断均有重要意义.现就MRL相关指标的检测在AML治疗及预后判断中的研究及应用进展作一综述.     

急性淋巴系白血病微小残留病的动态监测

本研究旨在建立免疫球蛋白重链基因重排的实时定量PCR(RQ-PCR)检测方法,并探讨其在急性淋巴系白血病(ALL)微小残留病(MRD)动态监测中的应用价值。采用多重PCR筛选初诊ALL患者的IgH基因单克隆重排,PCR产物测序并进行序列比对,据其连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)前向引物,联合下游保守JH引物和保守JH探针,用Taqman探针法RQ-PCR监测ALL患者治疗过程中各时间点的MRD水平,分析其敏感性和特异性。结果表明,在51例ALL患者中鉴定出21例单克隆IgH重排,其中有条件定量的为15例,标准曲线的斜率在-3.1～-3.9,相关系数均>0.98,敏感性在10-4-10-5,仅1例敏感性为10-3,定量范围多在10-4以下,背景的非特异性扩增均在低水平,不影响定量。7例MRD水平在10-3以下的患者一直持续缓解,8例MRD水平>10-3,复发率较高。结论:RQ-PCR方法定量IgH基因单克隆重排用于监测ALL患者的MRD水平,具有敏感性高、特异性强、定量结果可靠的优点。IgH重排水平与ALL患者预后高度相关。     

儿童急性白血病微小残留病检测的临床意义

目的 探讨微小残留病（MRD）的检测在儿童急性白血病中的临床意义。方法 对1996年2月～2005年3月在本科治疗的30例急性白血病患儿采集外周血,利用单克隆抗体直接免疫荧光标记法和流式细胞仪多参数分析技术进行微小残留病的检测,并动态随访。结果 在已停药的14例患儿中,7例MRD持续阴性或由阳转阴,7例由阴转阳性（其中2例复发）;在维持治疗的16例患儿中,缓解至今MRD阴性者6例,缓解时MRD阳性者8例（其中2例分别于缓解后3月、8月复发,4例经治疗后转阴）,缓解时MRD可疑阳性2例（其中1例转阳性）。结论 诱导治疗能杀死大量的白血病细胞,但尚未彻底清除MRD;缓解期的一定时间内患者MRD阳性不一定复发MRD持续阴性的患儿预后较好,维持治疗的后期或停药后MRD持续阳性,则有可能复发。因此,连续监测MRD对指导临床治疗、早期预示复发有重要意义。     

实时定量PCR动态监测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因的临床意义

目的：探讨实时定量PCR（RQ—PCR）监测PML—RARa融合基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）中的临床意义。方法：采用实时定量PCR（RQ—PCR）法监测患者骨髓PML-RARa融合基因亚型及动态变化。结果：初发32例患者中28例（87．5％）患者PML—RARa融合基因阳性,其中长型（L）19例（67．9％）,短型（S）9例（32．1％）。23例（82．1％）患者初次诱导后完全缓解,其中L型18例（94．5％）,S型5例（55．6％）,L型完全缓解率优于S型（P〈0．05）,而复发率和病死率均低于S型,但差异无统计学意义（P〉0．05）。长期随访的28例完全缓解患者,4例分子学复发,其中1例发生于第一次完全缓解后3个月,诱导缓解治疗后达第二次完全缓解,随后3个月再次分子学与血液学复发,再次诱导后达第三次完全缓解;3例在第一次完全缓解后3、4个月复发,经1疗程诱导后缓解,随访结束时生存期已达24个月。结论：APL初诊时PML—RARa融合基因亚型的检测可在一定程度上提示疾病的预后。在完全缓解期定期监测PML—RARa融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗,避免血液学复发。     

半巢式PCR检测淋巴细胞白血病微小残留病

半巢式ＰＣＲ检测淋巴细胞白血病微小残留病徐兵，周淑芸，孙竞免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因重排可作为Ｂ－淋巴细胞白血病的克隆标志，一次ＰＣＲ方法检测ＩｇＨ重排敏感性可达１０￣（－４）～１０￣（－５）水平，我们采用更灵敏的半巢式多聚酶链反应（ＰＣＲ）检测了...     

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病miR-125b的表达及临床应用

目的 采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)法检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中微小RNA-125b(microRNA-125b,miR-125b)转录本含量,初步评价其在AML临床诊断中的意义. 方法 建立扩增miR-125b转录本的SYBR Green I染料法qPCR,对miR-125b转录本克隆质粒进行扩增,评价其在AML诊断中的特异性、重复性和灵敏性.并对69例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测并评价其临床相关性. 结果 该方法能定量检测骨髓标本中miR-125b的表达水平,熔解曲线呈单峰,在108～ 103 copies/μL范围内有良好的线性关系(R2=0.999)并且检测重复性良好.结果显示69例AML患者中miR-125b表达水平明显高于25例对照组,差异有显著统计学意义(P=0.001).在初发AML的不同亚型中,M3型的miR-125b表达水平高于其他亚型,差异有统计学意义(P＜0.05).miR-125b表达水平与非M3型AML患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型、核型分组之间均无相关性(P＞0.05).4例初诊AML患者在获得完全缓解后miR-125b表达水平均较治疗前有所降低. 结论 所建立的实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测骨髓单个核细胞标本中miR-125b的表达水平,为进一步临床应用研究奠定了方法学基础.miR-125b异常高表达是AML中的一个常见分子事件,检测其表达可能有助于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测.