可长时间缓释骨形态发生蛋白2的聚己内酯复合支架的制备及应用

目的 制备一种可长时间缓释骨形态发生蛋2(BMP-2)的聚己内酯(PCL)复合支架,并通过检测其对人源骨髓间充质于细胞(BMSC)成骨分化的影响探讨其在骨组织工程中的应用.方法 将磷脂(PL)和BMP-2混合形成的BMP-2/PL混合物(B/P)分散在二氯甲烷中,与PCL混合后,采用相分离法制备负载BMP-2的三维PCL-B/P复合支架和PCL-B传统支架,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种支架的BMP-2缓释效果.将BMSC种植在PCL-B传统支架和PCL-B/P复合支架中,分别采用CCK-8法和实时定量PCR(qPCR)检测两种支架上BMSC的增殖和成骨分化能力.结果 与PCL-B传统支架对比,PCL-B/P复合支架对BMP-2缓释效果更佳,缓释时间更长,可达22 d.在BMSC培养的第7、14和21天,PCL-B/P复合支架上BMSC的增殖能力均优于PCL-B传统支架(P＜0.05),且PCL-B/P复合支架上BMSC中碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙、骨桥蛋白3种成骨基因mRNA的表达均高于PCL-B传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功地制备出一种可长时间缓释BMP-2的高分子三维PCL-B/P复合支架,其较PCL-B传统支架能更好地诱导BMSC的增殖和成骨分化.     

壳聚糖微球/小牛松质骨支架复合缓释体系的制备及体外生物活性评价

目的：通过乳液交联法合成壳聚糖微球并负载骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）,再将其复合于脱细胞基质的小牛松质骨支架,制备壳聚糖微球/小牛松质骨支架复合缓释体系。方法： 使用红外光谱仪、扫描电镜对合成的复合缓释系统进行结构表征和形貌观察,并对微球的包封率和载药量进行检测。用动态浸泡的方法来检测BMP-2的体外释放特征,通过体外检测复合体系的细胞毒性和对细胞增殖的影响。结果： 壳聚糖发生了交联并成功包载了BMP-2,微球平均直径为5.982 μm,表面光滑,且成功负载于小牛松质骨支架,形成了新型的微球/支架药物缓释体系。缓释数据表明,5 mg微球在体外释放21 d,BMP-2逐渐释放,第21天时浓度仍达到（239.1±20.0） mg/L。体外测试表明,该缓释体系有利于小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的生长,促进向成骨方向分化。结论： 壳聚糖微球/小牛松质骨支架复合缓释体系实现了BMP 2的生物学功能及其在骨修复部位的持续、缓慢释放,为骨组织缺损的修复治疗及骨组织工程支架材料的选择提供了依据。     

BMP-2诱导成骨及传送的研究进展

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)属于TGF-β超家族成员,是一种多功能的生长因子,对胚胎骨形成及出生后成骨有重要的作用,其中BMP-2是最主要的骨形成调控因子.骨组织工程的主要研究内容为细胞支架、种子细胞、细胞调控信号.BMP-2是骨组织工程中研究较热的细胞信号蛋白[1].最近,在BMP-2诱导成骨及其应用的传送释放系统的研究方面取得了一些新的进展,现综述如下.     

负载BMP-2组织工程骨修复骨缺损的研究进展

组织工程骨修复骨缺损是当前研究的热点。骨形态发生蛋白(BMP)具有强大的促成骨活性,能够诱导间充质细胞不可逆地分化为骨、软骨组织;BMP-2是成骨能力最强的BMP之一,目前已被广泛应用于骨组织工程领域,并且展现出良好的应用前景。在此分析了近年来BMP-2在骨组织工程中应用研究的文献,概述国际上关于负载BMP-2组织工程骨研究现状及临床应用进展。     

胶原基复合骨组织工程支架材料的研究

以胶原、羟基磷灰石为主要原料，模拟天然骨组织细胞外基质成分，构建骨组织工程支回材料，并复合细胞因了BMP-2，赋予材料骨诱导生物活性。     

阿司匹林缓释微球的制备及体外缓释效果评估

目的:阿司匹林(acetylsalicylic acid, aspirin)作为经典非甾体抗炎药,已被证实具有抗炎、调节免疫和促矿化作用,但是如何实现长期缓释aspirin并实现促进骨再生仍有待研究。本研究拟构建微球缓释体系,实现aspirin药物长期稳定缓慢释放,从而实现更为理想的成骨效果。方法:(1)合成制备三种缓释微球支架:① 单纯物理浸提法合成硅酸钙(calcium silicate, CaSiO₃)负载aspirin微球(CaSiO₃+aspirin),② 水包油(oil/water, O/W)乳化法制备聚乳酸羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA)负载aspirin微球(PLGA+aspirin),③ O/W乳化法制备PLGA复合CaSiO₃负载aspirin微球(PLGA+CaSiO₃+aspirin),并通过调整PLGA与CaSiO₃的比例,得到材料的最佳形貌。(2)缓释效果评价:用分光光度计测第1、2、4、6、9、13、17、21、24、30、36、45天微球浸提液的aspirin浓度,计算微球的aspirin载药率,绘制三种缓释微球支架的aspirin累积释放曲线并评价其缓释效果。结果:(1)环境扫描电镜下观察,三种微球支架表面结构规整,粒径均匀,但PLGA+aspirin组微球存在少量团聚现象,CaSiO₃+aspirin组部分微球破裂,PLGA+CaSiO₃+aspirin组微球均匀分布于CaSiO₃粉末上。(2)三组的载药率分别为(1.06±0.04)%、(7.05±0.06)%和(6.75±0.18)%。(3)95%药物缓释时间分别为3 d、24 d和36 d,PLGA+CaSiO₃+aspirin微球支架释放时间显著长于其余两组,且释放速率更为稳定。结论:PLGA+CaSiO₃+aspirin复合微球支架具有较理想的阿司匹林缓释效果,该复合微球有望成为理想的成骨材料。     

糖尿病大鼠早期骨微结构改变及其BMP-2基因的表达

目的 观察糖尿病大鼠早期的骨密度、骨微结构改变及骨组织中BMP-2基因的表达.方法 清洁级健康成年雄性Wistar大鼠30只,按照随机数字表将其分为A组(普通饲料对照组)、B组(高脂饲料 链脲佐菌素组)和C组(普通饲料 大剂量链脲佐菌素组).饲养12周后,分别对各组大鼠进行骨密度、光镜、扫描电镜、骨形态计量学的观察以及BMP-2基因表达等指标的检测.结果 与A组相比,B组骨微结构无明显变化(P＞0.05),但BMP-2基因表达增高(P＜0.05),C组骨微结构明显改变(P＜0.05),BMP-2基因表达降低,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同的糖尿病大鼠模型早期骨微结构及BMP-2基因表达情况改变不完全一致,可能与高胰岛素血症、胰岛素抵抗有一定关系.     

淫羊藿对肾阳虚雄性大鼠股骨骨形态发生蛋白-7表达的实验研究

目的 观察淫羊藿对醋酸泼尼松所致的肾阳虚雄性SD大鼠股骨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达的影响.方法 3月龄雄性SD大鼠24只,随机分为正常组、肾阳虚模型组、淫羊藿组,灌胃给药90 d后,RT-PCR检测股骨BMP-7 mRNA的表达,免疫组化检测股骨BMP-7的表达.结果 醋酸泼尼松致肾阳虚大鼠股骨BMP-7 mRNA和BMP-7的表达明显下降(P＜0.05),淫羊藿能在mRNA水平(P＜0.05)和蛋白水平上提高股骨BMP-7的表达.结论 淫羊藿可提高股骨中BMP-7的表达来诱导成骨,修复骨损伤.     

BMSCs复合CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性研究

目的:研究CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料。方法:制备CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料联合培养,体外成骨诱导培养2周,扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法分析细胞增殖情况以评价其组织相容性。结果:扫描电镜示细胞在新型支架上吸附、生长良好。MTT示BMSCs在材料上和单纯诱导的细胞增殖能力基本相同。结论:CS-CPC/BMP-2/bFGF支架材料是一种具有良好生物相容性的支架材料,有望在骨组织工程中得到广泛应用。     

Biodegradable chitosan scaffolds containing microspheres as carriers for controlled transforming growth factor-β1 delivery for cartilage tissue engineering

Background Natural articular cartilage has a limited capacity for spontaneous regeneration. Controlled release of transforming growth factor-β(1) (TGF-β(1)) to cartilage defects can enhance chondrogenesis. In this study, we assessed the feasibility of using biodegradable chitosan microspheres as carriers for controlled TGF-β(1) delivery and the effect of released TGF-β(1) on the chondrogenic potential of chondrocytes.Methods Chitosan scaffolds and chitosan microspheres loaded with TGF-β(1) were prepared by the freeze-drying and the emulsion-crosslinking method respectively. In vitro drug release kinetics, as measured by enzyme-linked immunosorbent assay, was monitored for 7 days. Lysozyme degradation was performed for 4 weeks to detect in vitro degradability of the scaffolds and the microspheres. Rabbit chondrocytes were seeded on the scaffolds containing TGF-β(1) microspheres and incubated in vitro for 3 weeks. Histological examination and type II collagen immunohistochemical staining was performed to evaluate the effects of released TGF-β(1) on cell adhesivity, proliferation and synthesis of the extracellular matrix.Results TGF-β(1) was encapsulated into chitosan microspheres and the encapsulation efficiency of TGF-β(1) was high (90.1%). During 4 weeks of incubation in lysozyme solution for in vitro degradation, the mass of both the scaffolds and the microspheres decreased continuously and significant morphological changes was noticed. From the release experiments, it was found that TGF-β(1) could be released from the microspheres in a multiphasic fashion including an initial burst phase, a slow linear release phase and a plateau phase. The release amount of TGF-β(1) was 37.4%, 50.7%, 61.3%, and 63.5% for 1, 3, 5, and 7 days respectively. At 21 days after cultivation, type II collagen immunohistochemical staining was performed. The mean percentage of positive cells for collagen type II in control group (32.7%±10.4%) was significantly lower than that in the controlled TGF-β(1) release group (92.4%±4.8%, P<0.05). Both the proliferation rate and production of collagen type II in the transforming growth factor-β(1) microsphere incorporated scaffolds were significantly higher than those in the scaffolds without microspheres, indicating that the activity of TGF-β(1) was retained during microsphere fabrication and after growth factor release.Conclusion Chitosan microspheres can serve as delivery vehicles for controlled release of TGF-β(1), and the released growth factor can augment chondrocytes proliferation and synthesis of extracellular matrix. Chitosan scaffolds incorporated with chitosan microspheres loaded with TGF-β(1) possess a promising potential to be applied for controlled cytokine delivery and cartilage tissue engineering.     

丝素蛋白壳聚糖三维支架的构建及其生物相容性

目的: 筛选出最适合用于骨组织工程的丝素蛋白壳聚糖三维支架比例。方法: 将提取的丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液以不同质量比混合,冷冻干燥后构建以下各组丝素蛋白壳聚糖三维多孔支架：20%丝素蛋白 ∶80%壳聚糖（20%丝素蛋白组）、30%丝素蛋白 ∶70%壳聚糖（30%丝素蛋白组）、40%丝素蛋白 ∶60%壳聚糖（40%丝素蛋白组）、50%丝素蛋白 ∶50%壳聚糖（50%丝素蛋白组）、纯丝素蛋白组、纯壳聚糖组。采用扫描电镜观察各组三维支架表面形态;将MG-63细胞与丝素蛋白/壳聚糖三维支架共培养（对照组采用盖玻片培养MG-63细胞）,通过细胞计数计算细胞黏附率,通过MTT检测细胞增殖;通过扫描电镜观察MG-63细胞在40%丝素蛋白、50%丝素蛋白三维支架中的形态分布;采用pNPP显色液检测40%丝素蛋白、50%丝素蛋白三维支架中MG-63细胞碱性磷酸酶（ALP）含量。结果： 不同比例丝素蛋白/壳聚糖三维支架中,50%丝素蛋白、40%丝素蛋白支架表面孔隙结构相对规则;黏附率结果显示,三维支架中丝素蛋白含量最少时,支架的细胞黏附率也最低;MTT显示50%丝素蛋白组细胞增殖能力强于其他组支架;MG-63细胞与支架共培养时,50%丝素蛋白支架中细胞量多于40%丝素蛋白组;在共培养第5天,50%丝素蛋白组细胞分泌的ALP含量高于40%丝素蛋白组。结论： 质量比为1 ∶1的丝素蛋白壳聚糖支架孔隙结构规则,最适合成骨细胞MG-63的黏附、增殖。     

骨形态发生蛋白2／7异二聚体对人脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的：探讨新型成骨诱导生长因子骨形态发生蛋白2/7异二聚体（bone morphogenetic protein 2/7 heterodimer,BMP-2/7）在诱导人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化中的作用。方法：体外培养hASCs,以成骨诱导培养基（osteogenic medium,OM）中添加150 μg/L BMP-2/7为实验组,以单纯OM为阳性对照组（OM组）, 以常规增殖培养基（proliferation medium,PM）为阴性对照组（PM组）。体外诱导的第1、4和7天检测细胞DNA含量,第7和14天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,第21和28天进行茜素红染色及定量检测,第1、4、7和14天分别进行成骨相关基因的检测。体内实验使用6只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：（1）单纯β 磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）支架（支架对照组）;（2）β-TCP支架+hASCs（体外PM培养1周）（增殖细胞对照组）;（3）β-TCP支架+hASCs（体外OM培养1周）（诱导细胞对照组）;（4）β-TCP支架+hASCs（体外OM+150 μg/L BMP-2/7培养1周）（实验组）。植入后4周进行取材,标本制成组织学切片,进行HE和Masson三色染色分析。结果：体外诱导后第1天,实验组细胞DNA含量与PM组差异没有统计学意义（P>0.05）,第4天时实验组细胞DNA含量较PM组升高（P<0.05）,第7天时组间DNA含量没有明显差异（P>0.05）。诱导7天和14天后,实验组的ALP染色及定量检测均高于OM组和PM组（P<0.05）;第21和28天矿化结节染色及钙沉积定量检测均高于OM和PM组（P<0.05）。诱导第1天时实验组的成骨相关基因（Runx2、ALP、COL-1A1）的表达量即高于PM组 (P<0.05),诱导第4天时骨钙素（osteocalcin,OC）基因表达量即开始升高,第4、7和14天的基因表达量较OM和PM组显著升高（P<0.05）。HE染色分析可见实验组和诱导细胞对照组的hASCs能分泌出嗜酸性较强的均质细胞外基质,出现了强嗜酸性的类骨组织;与诱导细胞对照组相比,实验组的细胞外基质嗜酸性更强,类骨组织的面积更大,结构更加典型;其他两对照组均未见矿化基质和类骨组织生成。Masson三色染色分析可见实验组呈强阳性表现,细胞基质中充满绿染的胶原;诱导细胞对照组和增殖细胞对照组的细胞基质中有不同程度的阳性表现,但较之实验组,胶原的数量明显减少;单纯支架组未见胶原的表达。结论：BMP-2/7在hASCs的成骨分化过程中发挥了重要作用,能够有效促进hASCs的体外和体内成骨分化。     

羟基磷灰石/聚合物支架修复骨缺损研究进展

羟基磷灰石/聚合物复合支架具有良好的机械性能、降解性、成骨活性、缓释功能，将其作为细胞生长因子、细胞和药物载体用于骨修复成为了骨组织工程的研究热点之一。文章主要就近几年羟基磷灰石/聚合物支架负载生长因子、细胞和药物在骨损伤或骨缺损治疗中的研究进展进行综述。     

聚多巴胺涂层3D打印双相磷酸钙组织工程支架的制备及其评价

目的：在3D打印制备的双相磷酸钙（BCP）支架的表面进行聚多巴胺（PDA）涂层,构建成骨活性较高的新型骨组织工程支架,并对其应用潜力进行初步评价。方法：通过3D打印技术制备BCP生物陶瓷支架,将制备完成的组织工程支架在多巴胺溶液中浸泡,以使支架表面形成纳米级的PDA覆膜结构,无PDA涂层的支架为3DBCP组,有PDA涂层的支架为PDA-3DBCP组。利用扫描电子显微镜观察各组支架表面微观形貌,通过测定支架表面的水接触角表征材料的亲水性,采用比重法测定支架的孔隙度,万能试验机检测支架的机械强度,CCK-8方法检测支架上细胞的增殖活性。结果：与3DBCP组比较,PDA-3DBCP组支架表面水接触角明显缩小（t=5.06,P<0.05）,支架孔隙度和机械强度差异无统计学意义（t=0.103,P>0.05;t=0.002,P>0.05）。将细胞接种至支架并进行1、3和5 d的复合培养,CCK-8法检测,随着培养时间的延长,2组细胞增殖活性逐渐升高,第5天时与3DBCP组比较,PDA-3DBCP组支架细胞增殖活性明显升高（t=39.3,P<0.05）。结论：PDA涂层的3D打印BCP多孔支架符合骨组织工程支架材料的表征,并且可以提高细胞的增殖能力,具备作为骨组织工程支架的潜力。