糖基转移酶-2基因silD在大肠埃希菌中的克隆与表达

从伊纽小单孢菌（Micromonospora inyoensis）扩增参与西索米星生物合成的糖基转移酶基因silD（1181bp），并分别将其克隆到pUC18和表达载体pET-30a上。其开放性阅读框长1173bp，编码含390aa（43．04ku）的多肽链，在大肠埃希菌BL21（DE3）：：pET-silD中实现表达。基因silD的碱基序列与gntD（来自M．echinospora）的碱基序列的同源性高达94％。预测的silD蛋白序列与GntD的同源性为98％。这是继从依纽小单孢菌克隆参与生物合成西索米星的抗性基因srml（AY661430）、西索米星2-脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB（DQ250993）和糖基转移酶基因sisZ（DQ250994）后，克隆到的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

侵袭性大肠埃希菌IpaC的表达和纯化与检验学研究

目的研究分析侵袭性大肠埃希茵的发病机制,表达和纯化侵袭性大肠埃希茵毒力蛋白IpaC与临床意义。方法将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIAexpressionitsTM蛋白纯化系统纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子量约为63 kD的条带,其含量约占总蛋白量的13%,对目的蛋白进行纯化后发现,以400 mmol/L咪唑洗脱液洗脱时效果最为理想,纯度可达90%以上。结论 pET32a-ipaC重组表达质粒转化大肠杆菌B121(λDE3),可稳定、高效地表达目的蛋白;QIAexpressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。     

哺乳动物CYP450在大肠埃希菌上表达的研究进展

［摘要］细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是人体内代谢各种内外源性物质最重要的酶系之一。随着分子生物学和重组技术的快速发展，对哺乳动物来源的细胞色素P450cDNA进行精细操作并将使其在异源系统中表达成为可能。目前已经有多种异源系统被用来进行哺乳动物CYP450的表达，每一种系统都各具优缺点。哺乳动物CYP450在大肠埃希菌上的表达是在实验室中的主要表达方式，但采用不同方式表达的蛋白量不一样，而且对蛋白酶的活性也有着一定的影响；同时，蛋白纯化手段的选择也会影响CYP450表达方式的应用。该文对哺乳动物CYP450在大肠埃希菌上的表达纯化现状和应用进行概述。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

大肠埃希菌AmpC酶检测与基因分型研究

随着广谱β-内酰胺类抗生素的使用,特别是第三代头孢菌素在临床的广泛应用,使大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性越来越严重。     

合成基因IL-6在大肠杆菌中表达及融合蛋白鉴定分析

目的合成IL-6的编码基因,并在大肠杆菌中表达,获得纯化的融合蛋白IL-6。方法采用基于PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法,设计全长拼接引物,合成基因IL-6,并将其插入载体pCzn1,获得的重组质粒pCzn1-IL-6,化学法将其转化入大肠杆菌TOP10进行克隆。将克隆得到的阳性克隆子转化入大肠杆菌Arctic Express后用IPTG诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达效果。结果经测序和双酶切验证,正确构建了重组质粒pCzn1-IL-6,重组质粒成功转入表达菌株,IL-6原核蛋白在表达菌株中以包涵体和可溶性形式稳定表达,通过Ni柱亲和纯化获得纯化的目标蛋白。结论 IL-6原核蛋白在大肠杆菌中成功表达,为进一步的应用研究打下基础。     

致泻性大肠埃希菌毒力相关基因的检测和方法学分析

目的 分析5种致泻性大肠埃希菌(DEC)的毒力基因,建立一种快速检测与鉴定DEC的多重聚合酶链式反应(PCR)。方法 采用多重PCR方法检测800份粪便标本中大肠埃希菌的毒力基因,对检测到毒力基因阳性的菌株进行DEC的归类,并对扩增结果进行测序验证。结果 800份粪便标本中分离DEC 46株(5.8%),其中肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离最多22株,其次为肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)15株,肠聚集性大肠埃希菌(EaggEC)7株,肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)2株,无肠出血性大肠埃希菌(EHEC)。结论 建立同时检测多个粪便标本的多重P C R方法,可敏感、快速地检测DEC。     

抗菌肽cecropin-Xm在大肠埃希菌中的串联表达与抑瘤作用

在TNFα基因3’端连接抗菌肽cecropin—Xm基因多拷贝串联体，与温度诱导的表达载体pRCs组成表达载体pRCs—TNFα-（cecropin—Xm）。（n=1，2，3），并在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白TNFa-（cecropin—Xm）。（n=1，2，3）。SDS—PAGE结果显示，在同样表达条件下应用BL21（DE3）／pRCs—TNFα-（cecropin—Xm）2表达系统可获得比BL21（DE3）／pRCs—TNFα—cecropin—Xm系统多出-倍的目的物cecropin—Xm。融合蛋自经CNBr切割后用CM52纤维索柱分离纯化得到纯度大于95％的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin—Xm，体外MTT抑瘤实验表明cecropin—Xm具有广谱杀灭肿瘤细胞的作用并且对正常细胞影响极小。     

惠东地区产ESBLs大肠埃希菌的主要基因类型

目的探讨惠东地区产ESBLs大肠埃希菌的主要基因类型。方法收集本地区临床各科室明确诊断为院内感染的标本,经分离获得大肠埃希菌483株,采用API20E进行产ESBLs初筛,并参照CLSI文件M100-S22推荐的纸片表型确证试验进行确证。对确证产ESBLss大肠埃希菌进行基因型检测和PFGE检测。结果（1）API鉴定试剂条（API 20E）试验提示本研究所收集483例院内大肠埃希菌菌株中,产ESBLs阳性菌株共214例;确证试验结果提示,214例菌株均为产ESBLs阳性菌,符合率为100％;（2）214株产ESBLs大肠杆菌共有3种基因型和6种PFGE型,其中基因型TEM最多,共123株（57．5％）,CTX—M51株（23．8％）,SHV40株（18．7％）;PFGE图谱结果提示,3a和6a最多见．分别为70株和63株,其余分别为1a（30株）、2（21株）、4（18株）和18（12株）;（3）产ESBLs大肠埃希菌来源：214株产ESBLs大肠埃希菌,主要来源于重症监护室（118株）、血液科（39株）、呼吸科（34株）,以及其他相关科室（共23株）。结论现阶段本地区院内感染大肠埃希菌标本中,产ESBLs大肠埃希菌所占比例较高,其中以基因型TEM最多,PFGE型3a和6a最多见;病原菌主要来源于重症监护室、血液科和呼吸科。     

重组猪促肾上腺皮质激素在大肠埃希菌中的高效表达与分离纯化

本研究建立了一种以大肠埃希菌作为宿主,表达重组猪促肾上腺皮质激素(pig adrenocorticotropic hormone,pACTH)的新方法。pACTH在N末端与经典猪瘟病毒N末端自切蛋白酶N^pro突变体EDDIE融合,然后在大肠埃希菌胞浆中以包涵体形式表达,包涵体约占菌体湿重的36.2%。经过复性后的包涵体可以促使EDDIE自酶切,从而获得pACTH。通过优化复性条件,EDDIE-pACTH蛋白的自切率从25%提高至60%。复性液通过酸沉淀,能够去除杂蛋白,经反相色谱纯化后获得纯度为99.56%的pACTH。     

肝门部胆管癌中CD44v6的表达及意义

目的 探讨CD44v6与肝门部胆管癌发生的关系。方法 应用免疫组化S—P法研究13例肝门部胆管癌中CD44v6的表达。结果 CD44v6在正常胆管组织中无表达，在癌组织中的表达明显，且仅与病理分化有关。结论 CD44v6可能在肝门部胆管癌的发病机制中起一定作用。     

金丝桃素合酶基因的快速克隆及功能鉴定

金丝桃素合酶能催化大黄素生成金丝桃素,根据已发表的金丝桃素合酶的基因序列,设计了6对引物,通过连续重叠PCR快速克隆得到了金丝桃素合酶基因hyp-1。构建含hyp-1基因的原核表达载体pET32ahyp,将该载体导入大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,hyp-1基因在大肠杆菌中获得表达;Western blot结果表明,重组的Hyp-1蛋白具有特异的免疫活性,表明hyp-1基因在E.coli中得到了表达。酶促反应表明,Hyp-1确实能催化大黄素形成金丝桃素,上述结果表明,本研究克隆的hyp-1基因是金丝桃素合酶基因,具备催化大黄素形成金丝桃素的能力,从而为通过合成生物学技术制备金丝桃素奠定了物质基础。     

甲硫氨酸脑啡肽增强白细胞介素-6的产生及其基因表达(英文)

目的:研究甲硫氨酸脑啡肽对自细胞介素-6的产生及其基因表达的影响.方法:用依赖株MH60·BSF2和MTT法测定IL-6,分离RNA和IL-6 cDNA杂交后测定其基因表达.结果:甲啡肽体外诱导小鼠IL-6 mRNA的表达并提高其稳定性.腹腔注射甲啡肽0.1和1 mg·kg~(-1)也能明显提高IL-6水平并促进脾细胞IL-6mRNA的表达.结论:甲啡肽能通过提高转录活力并增加其mRNA稳定性上调IL-6.     

CYP2B6基因多态性及其功能意义的研究进展

CYP2B6是一个在药理和毒理学上均占有重要地位的代谢酶,参与约7%临床上常用药物代谢,其中包括一些治疗窗较窄的药物。CYP2B6具有高度基因多态性,在基因编码区和非编码存在许多单碱基突变。到目前为止,已发现并被命名的等位基因有CYP2B6*1～*29。本文主要对CYP2B6的基因多态性、种族差异及其在药物代谢上的功能意义等方面的研究进展进行综述。     

Activation of human ether-a-go-go related gene (hERG) potassium channels by small molecules

Human ether-a-go-go related gene (hERG) potassium (K(+)) channels play a critical role in cardiac action potential repolarization. Mutations that reduce hERG conductance or surface expression may cause congenital long QT syndrome (LQTS). However, the channels can be inhibited by structurally diverse small molecules, resulting in an acquired form of LQTS. Consequently, small molecules that increase the hERG current may be of value for treatment for LQTS. So far, nine hERG activators have been reported. The aim of this review is to discuss recent advances concerning the identification and action mechanism of hERG activators.     

趋化因子受体CCR6的克隆及其在HEK293细胞中的表达

目的：构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体，并了解其在HEK293细胞中的表达。方法：提取人淋巴结总RNA，通过逆转录PCR扩增出CCR6基因片段，并构建真核表达载体pcDNA3，1（＋）-CCR6；重组载体通过脂质体转染HEK293细胞，免疫荧光法鉴定CCR6的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有CCR6编码序列．转染实验表明重组质粒能在HEK293细胞中表达出具有活性的CCR6片段。结论：CCR6真核表达载体构建及表达成功，为下一步CCR6拈抗剂的筛选奠定了基础。     

转染IL-6基因增强MCF-7人乳腺癌细胞肿瘤相关抗原的表达

目的 研究IL-6 影响癌症预后的机制和IL-6与乳腺癌肿瘤相关抗原CA15-3, CEA 和CA125 的关系.方法 转染外源IL-6基因到MCF-7细胞株, 用酶联免疫吸附法(ELISA) 定量培养液中细胞分泌的CA15-3, CEA和CA125.结果 在 72 h 培养后, 成功转染pCI-neo-IL-6质粒的MCF-7细胞分泌IL-6 (338.5±22.6) pg/106细胞明显高于没有转染的细胞(25.4±4.6) pg/106细胞 (P＜0.01) 和无IL-6基因的质粒pCI-neo转染的细胞(19.6±3.0) pg/106细胞 (P＜0.01).pCI-neo-IL-6转染的MCF-7细胞分泌CA15-3, CEA 和CA125同样明显高于没有转染的细胞和空载体pCI-neo转染的MCF-7细胞.特异性IL-6抗体降低CA15-3, CEA 和CA125在MCF-7细胞和IL-6 cDNA转染的MCF-7细胞中表达.结论 转染IL-6基因可增强人乳腺癌细胞肿瘤相关抗原的表达,高IL-6血症的乳腺癌病人预后不良部分原因可能是高IL-6刺激癌细胞表达肿瘤相关抗原.     

Cloning,functional expression,and characterization of an edema-producing Asp-49 phospholipase A2 from Trimeresurus mucrosquamatus

The snake-bite of Trimeresurus mucrosquamatus can cause severe edema and result in complications. Snake venom phospholipase A₂s are the major components responsible for causing edema. Therefore, understanding the edema-producing mechanism induced by the venom of T. mucrosquamatus can be important in treating the edema. In order to study the edema-producing effect, a venom Asp-49 phospholipase A₂ (TMV-D49-PLA₂) was cloned, sequenced, and functionally expressed in Escherichia coli. This expressed venom protein demonstrated specific phospholipase activities both in the digestion of lecithin in vitro and in inducing edema in rats in vivo. Therefore, the cloning and functional expression of the recombinant edema-producing protein are critical steps and should allow further characterization of the functional motifs responsible for both the edema-inducing activity and the development of therapeutic antiserum against the edema effect of the snake venom proteins.     

A missense mutation in exon 6 of the CYP2D6 gene leading to a histidine 324 to proline exchange is associated with the poor metabolizer phenotype of sparteine

The sparteine/debrisoquine polymorphism is a clinically important genetic deficiency of cytochrome P4502136-catalyzed oxidative drug metabolism. 5–10% of Caucasians designated as poor metabolizers have a severely impaired capacity to metabolize more than 30 therapeutically used drugs. Genotyping of a random Caucasian population for the known cytochrome P4502D6 mutations A, B and D which are associated with the poor metabolizer phenotype has revealed a substantial number of misclassified poor metabolizers indicating the existence of one or more unknown mutations which cannot be identified with the currently available genotyping assays. Therefore we have cloned and sequenced one nonfunctional cytochrome P4502D6 allele of a. misclassified poor metabolizer and could identify a single missense mutation designated E mutation at position 3023^(A–C) in exon 6. Direct sequencing analysis, Fokl restriction analysis and a newly developed allele-specific polymerase chain reaction assay were applied to analyze for this mutation in a population study.Three out of 97 randomly selected Caucasians were carriers of this mutation and thus the E allele has a frequency of 1.5% (confidence interval_95% = 0.33–4.54%). Since only 2 out of 4 misclassified poor metabolizers carried the E mutation, additional unknown mutant alleles must exist.Computer modelling suggests that the E mutation, which results in a histidine to proline exchange in position 324 of the protein, may cause an alteration of the 3D structure of CYP2D6 in close vicinity to the active site thereby leading to total loss of enzyme function. Correspondence to. E.-U. Griese at the above address     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础