人MxA基因重组真核载体抗乙型肝炎病毒作用的实验室研究

目的:研究重组真核载体PcDNA3.l-MxA体外抗HBV的作用,为研究MxA基因(myxovirus-resistant A)治疗慢性HBV感染奠定基础.方法:将构建成功的重组真核载体PcDNA3.l-MxA转染入HepG 2.2.15.将HepG 2.2.15分为实验组(转染PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15)和对照组(转染PcDNA3.1的HepG 2.2.15),应用RT-PCR方法检测两组HepG2.2.15内MxAmRNA(P<0.01),并应用ELISA法检测两组HepG2.2.15内HBsAg、HBeAg的水平.结果:RT-PCR扩增结果显示实验组的MxAmRNA水平均较对照组明显升高,实验组HBsAg、HBeAg水平明显低于对照组(均P<0.01).结论:转染重组真核载体PcDNA3.l-MxA HepG2.2.15内MxA蛋白明显抑制了HBV DNA的复制及表达,为进一步研究MxA蛋白体内抗病毒作用提供理论.     

KDR启动子驱动的双自杀基因对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基凶系统CDglyTK对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用.方法 用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的BEL-7402、HUVEC细胞和不表达KDR的HepG2细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应.结果 以感染复数MOI为100的腺病毒AdKDR-CDglyTK分别感染各细胞株,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率.RT-PCR检测发现,重组腺病毒及感染AdKDR-CDglyT的三种细胞均有目的基因CDglyTK的表达.感染腺病毒的BEL-7402、HUVEC细胞对前药具有较高的敏感性,而HepG2细胞对前药不敏感(P<0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应.结论 KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对肝癌细胞及人脐静脉内皮细胞具有特异性的杀伤作用.     

HBV-TRL重组腺病毒载体的抗病毒活性

目的:观察有linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV-TRL)重组腺病毒载体(RAd)对HBV复制的抑制作用.方法:以第四军医大学病原生物学教研室已构建的pc DNA3.1(-)/TRL,TR,TRmut,HBVc和hEDN为基础,分别将目的片段TRL,TR,TRmut,HBVc和hEDN插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生含各目的片段的复制缺陷型腺病毒,即RAd/TRL,TR,HBVc和hEDN,经鉴定、扩增及滴度测定.其中RAd/TRL,TR为实验组,其余重组腺病毒为对照组.将获得的重组腺病毒感染HepG2.2.15细胞后通过间接免疫荧光检测重组腺病毒在细胞中的表达,并应用荧光定量PCR法检测细胞上清中HBVDNA含量.同时,应用MTT比色法检测细胞的代谢活性.结果:成功获得了含TRL,TR,HBVc和hEDN等不同目的片段的复制缺陷型腺病毒载体.RAd/TRL在HepG2.2.15细胞中得到有效表达,并且明显降低了细胞上清HBV-DNA含量,与RAd/TR相比(P=0.0266,P＜0.05),与其他对照组相比(P＜0.01).MTT比色分析表明细胞代谢活性未受到影响(P＞0.05).结论:成功地构建了RAd/TRL,其有效表达成功地抑制了HBV的复制.     

携带RGD多肽的嵌合型腺病毒载体AD11-RGD-4C-EGFP的构建及其感染效率的研究

目的在嵌合型腺病毒的fiber中插入具有整合素特异性的RGD肽,构建可提高腺病毒感染效率的腺病毒载体,观察其对人肝癌细胞株HepG2、BEL-7404以及成纤维细胞BJ的感染效率。方法将RGD-4C插入到AD5/11嵌合型腺病毒载体fiber的HI区,与腺病毒骨架质粒pPE3共转染大肠杆菌BJ5183,同源重组产生腺病毒重组质粒(pPE3-F11-RGD-4C),该重组质粒与PDC328-EF1-EGFP共转染人胚肾293细胞进行包装,产生重组腺病毒(AD11-RGD-4C-EG-FP)。用该重组腺病毒感染HepG2、BEL-7404以及BJ细胞,通过荧光显微镜观察感染效率。结果所构建的重组腺病毒PCR扩增出1 123 bp包含目的片段的基因片段。同时,制备了高滴度的重组病毒,纯化后病毒滴度为1.3×1010pfu/ml。当MOI=10,48 h时该重组病毒对HepG2、BEL-7404及BJ细胞的感染效率明显高于对照组腺病毒(AD11-EGFP)。结论成功构建了可提高腺病毒感染效率的嵌合型腺病毒(AD11-RGD-4C-EGFP),为进一步的研究奠定了基础。     

腺病毒介导的LacZ基因在人肝癌细胞HepG2中的表达

目的观察腺病毒介导的LacZ基因在人肝癌细胞HepG2中的转染表达效率。方法常规重组腺病毒Ad-LacZ扩增、滴度测定及转染HepG2细胞,并检测细胞表达LacZ的情况。结果当病毒感染繁殖数(MOI)为100时,24小时后接近100%的HepG2细胞被感染并表达LacZ。感染后HepG2细胞的增殖能力无明显异常。结论腺病毒介导的LacZ基因在HepG2细胞中能获得较高的转染效率和有效表达。     

腺病毒介导的VEGF启动子-胸苷激酶表达系统对肝癌细胞的选择性杀伤作用

目的:构建携带受血管内皮生长因子(VEGF)启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的重组腺病毒载体,并探讨该重组腺病毒对体外培养的肝癌细胞的特异性杀伤活性.方法:采用AdEasy System 构建携带受VEGF启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控tk基因表达的AdVEGF-tk和AdCMV-tk,这两种重组腺病毒载体在293细胞中包装、扩增后,体外感染正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测受染细胞的增殖情况.结果:AdVEGF-tk的病毒滴度为1×1010 pfu/ml,AdCMV-tk为5×1010 pfu/ml.L02细胞感染AdVEGF-tk后对GCV的敏感性无明显改变,而HepG2细胞感染AdVEGF-tk后对GCV的敏感性明显增加,在感染复数(MOI)为100并用50 μg/ml GCV处理时,则有90％ 以上HepG2细胞被杀死;而AdCMV-tk可杀死95％ HepG2细胞和80％ 以上L02细胞.结论:VEGF启动子调控的HSV-tk基因表达可特异性地杀死肝癌细胞,同时对正常肝细胞几无影响.     

携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的　构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法　以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果　重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论　成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

人GM—CSF基因转移表达及抑制乙肝病毒的实验研究

为了探讨重组腺病毒为载体的人GM—CSF基囤转移表达及对HBV复制的影响，将携带人GM—CSF基因的重组腺病毒感染22．15HepG2细胞，观察了GM—CSF基因转染前后2.2.15 HepG2细胞上清中HBV—M的变化。     

端粒酶逆转录酶启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用

目的观察端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用。方法采用Western印迹检测了腺病毒E1A在细胞中的表达;通过病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK300选择性复制和杀伤能力,并与ONYX-015(E1B55000蛋白缺失的2型和5型嵌和型腺病毒)和wtAd5(野生型腺病毒)进行比较;用携带绿色荧光蛋白的CNHK300-EGFP感染BJ和Hep3B,直观的观察其增殖过程。结果CNHK300病毒48h在Hep3B和HepGⅡ中的增殖倍数分别为40625和65326倍,与wtAd5增殖能力相近,较ONYX-015强几倍至十几倍。在BJ正常成纤维细胞中CNHK300病毒增殖能力减弱,CNHK300病毒48h增殖倍数为180倍,而wtAd5增殖能力仍可高达4000倍。CNHK300在MOI 0．5集落形成单位／细胞以下就可以有效地杀伤肝癌细胞,MOI 0．002集落形成单位／细胞时就可以杀伤半数Uep3B细胞,较ONYX-015具有更强的肿瘤杀伤能力。CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力明显弱于wtAd5,CNHK300在MOI100集落形成单位／细胞时BJ细胞存活率近50％。结论肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300可选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中复制,并产生溶瘤作用,在正常细胞中复制能力和杀伤能力明显减弱,且无论选择性和杀伤能力均优于ONYX-015。