HBV cccDNA检测临床应用研究进展

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis Bvirus covalently closed circular DNA,HBVcccDNA)是嗜肝病毒复制过程中产生的一种重要复制中间体,在宿主细胞核内积聚,形成HBV cccDNA池,半衰期长,现有抗病毒药物不能清除,是宿主肝细胞持续     

肝组织HBV总DNA和cccDNA阴性参考值的探讨

目的探讨肝组织乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）总DNA（total DNA,tDNA）和共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的阴性参考值,为进一步研究实时定量PCR检测肝组织HBV tDNA和cccDNA的应用价值奠定基础。方法分别有88例HBsAg阳性/抗-HBc阳性、20例HBsAg阴性/抗-HBc阳性和19例HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎患者入选本研究。肝组织β-globin DNA、HBV tDNA和cccDNA采用实时荧光定量PCR检测,单个肝细胞HBV tDNA和cccDNA含量（copies/cell）=HBV tDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）和HBV cccDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）。肝组织HBVtDNA和cccDNA含量的计算单位定义为log_（10）copies/10~6cell。统计分析采用SPSS 13.0软件。结果肝组织HBVtDNA和cccDNA鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.909和0.891（P=0.000和0.000）,最佳截断值分别为5.772和4.883 log_（10） copies/10~6cells;鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阳性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.893和0.857（P=0.000和0.000.）,最佳截断值分别为5.559和4.630 log_（10） copies/10~6cells。就HBsAg阳性/抗-HBc阳性慢性肝炎而言,当肝组织HBV tDNA和cccDNA≥5.699和cccDNA≥4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均呈显著正相关（P=0.000和0.000）;当肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均无显著相关性（P=0.065和0.880）。结论肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells可能是合适的阴性参考值。     

应用滚环扩增研究肝癌组织中的HBV cccDNA

目的：运用滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）分离肝癌患者组织中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,研究pre-S区的缺失。方法：对RCA技术的特异性和灵敏度进行了研究,并应用该技术扩增13对癌组织和癌旁组织中HBV cccDNA,对pre-S区的缺失进行了研究。结果：RCA能够高效,特异的扩增组织中10拷贝/μl HBV cccDNA;26例样本中,22例样本的HBV cccDNA能够被RCA撤增测序,其中有8例样本（8/22,36.4%）在pre-S区域存在着缺失,pre-S2缺失比例高于 pre-S1（8/8 vs. 2/8,P=0.007）。结论：首次发现肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中HBV cccDNA存在着pre-S区的缺失,有助于深入理解cccDNA pre-S区缺失与HCC的关系。     

外周血HBV cccDNA检测的临床应用

目的通过对乙型肝炎患者外周血单个核细胞及血浆中共价闭合环状DNA（cccDNA）的检测,初步探讨其外周血检测对乙型肝炎诊治的价值。方法将86例确诊为乙型肝炎患者根据病情分为3组,急性乙型肝炎（AHB1、慢性乙型肝炎（CHB）及HBsAg无症状携带者（ASC）组。采集外周血,分别检测ALT、AST、总胆红素（TBIL）、cccDNA、HBV—DNA。结果三组血浆cccDNA检测结果有显著性差异（P〈0．01）。单个核细胞cccDNA7个标本阳性,血浆cccDNA与HBV—DNA、ALT、AST、TBIL相关系数分别为0．817、0．402、0．450、0．221。结论血浆cccDNA在乙型肝炎患者的各个病程有显著性差异,单个核细胞cccDNA储存池确实存在但浓度较低难以检测。血浆cccDNA．与HBV—DNA、ALT、AST相关,但与TBIL无明显相关。     

乙型肝炎病毒cccDNA检测方法的建立及初步应用

目的：建立和应用聚合酶链反应法（PCR）检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）。方法：应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA,同时验证此方法的特异性。结果：31例慢性乙型肝炎患者肝组织中,10例HBVcccDNA阳性,阳性率为32.3%。HBV cccDNA阳性组的ALT、HBVDNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组（P〈0.01和P〈0.05）。结论：该方法操作简单,特异性好,可用于测定肝组织中HBV cccDNA,用于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价抗乙肝病毒药物的疗效。     

人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA影响的初步研究

目的：建立HBVcccDNA荧光定量PCR方法并检测重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后血清中HBVcccDNA含量。初步探索人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者血清中HBVcccDNA的影响。方法：以50例重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后血清作为检测标本,对血清中总HBVDNA、HBVcccDNA含量进行定量检测。用SAS8．0统计软件对结果进行统计学分析。结果：成功建立定量检测HBVcccDNA方法并证实在重型乙型肝炎患者血清中存在HBVcccDNA。在人工肝血浆置换前后总HBVDNA及HBVcccDNA含量明显降低（P〈0．05）。总HBVDNA与HBVcccDNA之间有较好的相关性忙0．78,P〈O．01）。总HBVDNA水平与PT（r=0．37,P〈O．01）、AIJT（r=0．29,P〈0．05）、AST（r=-0．39,P〈0．01）水平有一定的相关性;HBVcccDNA水平与PT（r=0．34,P〈0．05）、ALT（r=0．34,P〈0．05）、AST（r=0．40,P〈0．01）水平有一定的相关性。结论：总HBVDNA及HBVcccDNA在一定程度上能够反映肝细胞坏死程度;血浆置换术后病毒含量明显降低,为进一步研究重型乙型肝炎治疗途径及发病机制打下基础。     

鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测

目的 探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染麻鸭外周血中能否检测出DHBVcccDNA.方法 选择持续感染DHBV的2月龄上海麻鸭24只随机分均分为4组,分别以(1)A组:D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100 μg/kg;(2)B组:D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;(3)C组:D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次;(4)NC组:生理盐水处理作为正常对照组(NC组).在处理后0、24、36和48 h进行血清ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA检测,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA.结果 NC组鸭肝脏无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组之间的肝损伤程度分级差异有统计学意义(P＜0.01).B组和C组在处理后48 h分别有1只和4只鸭死亡.NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在处理后36 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在(0.32～1.72)×104拷贝/ml之间,在处理后48 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA.Logistic逐步回归分析显示血清中DHBVcccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA 含量无关.结论 在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA,血清中DHBV cccDNA的检出与肝组织损伤程度显著相关.     

外周血淋巴细胞中乙肝病毒cccDNA检测研究

目的做外周血淋巴细胞中乙肝病毒cccDNA检测研究,并探讨其临床意义。方法采用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞,用荧光定量PCR法检测外周血淋巴细胞中cccDNA含量。结果36例CAH患者中检出29例阳性(80.56%),61例CPH患者中检出32例阳性(52.46%),59例ASC标本中检出1例阳性(0.02%)。47例健康人标本检测结果均为阴性。CAH组、CPH组、携带者及阴性对照组之间互相存在统计学差异(P<0.05),携带者组和阴性对照组之间无统计学差异。对定量资料的统计学分析显示:CAH组检测的基因拷贝数较CPH组基因拷贝数明显增高,两者具有统计学差异(P<0.05)。结论(1)cccDNA在外周血淋巴细胞中的存在,对于慢性乙肝病毒持续感染状态的建立和维持,可能具有重要意义。(2)检测外周血淋巴细胞乙肝病毒cccDNA存在及其含量高低,可以作为评估临床抗乙肝病毒治疗有效性的一个参考指标。(3)该检测还可用于乙肝患者治疗中的复发及预后判断。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究现状

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）在病毒持续感染、停药后复发及药物抵抗等方面起关键的作用。本文对cccDNA形成机制、代谢调控、研究模型、检测方法和临床应用进行了简要综述。     

HBV感染与宿主基因及病毒DNA甲基化

乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因,HBV感染诱导的宿主基因组甲基化及病毒自身DNA甲基化改变可能是病毒感染慢性化及慢性肝病形成的重要发病机制之一,HBV基因组及HBV共价闭合环状DNA的甲基化在调控病毒复制和蛋白表达中起着重要作用。探讨HBV DNA甲基化对于研究病毒的致病机制、指导HBV感染的治疗有重要意义。     

血清乙肝病毒cccDNA检测的临床分析

目的:探讨血清中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)全序列的PCR检测与HBV复制及肝细胞损伤的临床相关性?方法:用长链PCR方法对乙型肝炎患者血清进行HBV cccDNA全序列直接扩增,同时检测血清中乙型肝炎病毒前S1(PreS1)抗原和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性?结果:cccDNA和PreS1抗原在乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性血清中检出率分别为43.94%(29/66)和83.33%(55/66),在HBeAg阴性血清中的检出率分别为13.33%(4/30)和30.00%(9/30);cccDNA阳性血清的PreS1抗原阳性率和ALT活性升高分别为90.91%(30/33)和93.94%(31/33),cccDNA阴性血清的PreS1抗原阳性率和ALT活性升高分别为53.97%(34/63)和41.27%(26/63)?结论:血清中cccDNA的检出与PreS1抗原?HBeAg的表达以及肝细胞损伤呈高度相关性?     

慢性乙肝患者血清HBV cccDNA检测的临床意义

目的探讨慢性乙肝患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标（AST、ALT、TBIL、HBeAg、HBV DNA）的相关性。方法选取解放军第309医院2009年5月-2012年5月就诊的慢性乙肝患者58例,采用Roche C6000电化学发光法检测HBeAg;日立Hi7600全自动生化分析仪检测ALT、AST、TBIL;采用实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA、HBVcccDNA载量。结果血清HBV cccDNA与HBV DNA有很好的相关性（r=0.880,P=0.000）。HBeAg阳性组HBV cccDNA阳性的比例为67.6%,显著高于HBeAg阴性组的37.5%（χ2=5.170,P=0.023）。血清HBV cccDNA与肝组织炎症的严重程度呈正相关（χ2=4.819,P=0.028）。结论血清HBV cccDNA定量检测是评价HBV复制情况和肝细胞损伤程度较为可靠的指标。     

体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

目的：建立一种体外培养细胞内乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的检测方法。方法：Southern blot 检测HBV复制中间体,以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制;用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA（protein-free DNA,PF DNA）,经加热变性处理,EcoRⅠ酶切,然后用Southern blot检测HBV cccDNA;用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA,观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果：用Southern blot可在HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞中检测到HBV复制中间体;Hirt法提取物经变性和酶切处理,可有效地将cccDNA与其他形式HBV DNA区分开;HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞内均可检测到HBV cccDNA;HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时,其细胞内cccDNA的量较多。结论：成功建立了体外培养细胞内HBV cccDNA检测方法,该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southern blot方法,能可靠、准确地检测HBV cccDNA。     

抗乙型肝炎病毒免疫治疗研究新进展

抗乙型肝炎病毒(HBV)免疫治疗主要通过介导激活免疫细胞及释放细胞因子发挥免疫调控作用,增强宿主产生有效的先天性和适应性免疫应答,从而有效抑制HBV复制与转录,实现长期稳定的控制。该综述总结抗HBV免疫治疗的几种策略,以期找到清除HBV共价闭合环状DNA治疗新方法或药物,为HBV抗病毒治疗提供参考。     

一种新的同时定量检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA的检测方法

目的 设计并建立一种新的能够同时测定核酸提取物中乙型肝炎病毒（HBV）前基因组RNA（pgRNA）和DNA的检测方法。方法 建立检测HBV pgRNA和DNA的探针法双重荧光定量PCR体系,通过DNA凝胶电泳、定量PCR等实验考察该检测体系的特异性和灵敏度,验证以该方法测定HepG2.2.15细胞及其培养上清中HBV pgRNA和DNA的可行性及准确度。结果 建立的探针法双重荧光定量PCR体系具有较好的特异性和灵敏度,测定不同稀释倍数的细胞培养上清时,在稀释倍数和测定结果间具有较好的相关性。但该方法更适用于测定细胞培养上清中的HBV pgRNA和DNA,而不适用于测定细胞样本。结论 本实验建立的方法能够避免核酸提取物中由于HBV DNA污染造成HBV RNA定量不准的问题,并且在一管PCR反应中同时实现了HBV pgRNA和DNA的双重检测,极大提高了检测效率,具有潜在的临床应用价值。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA研究进展

共价闭合环状DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒的原始复制模板,对乙型肝炎病毒的复制具有重要的意义,药物难以清除。近年来,国内外对cccDNA的研究取得了新的进展,学者们对不同标本中cccDNA的检测,及临床上对cccDNA的清除等进行了广泛的研究。现就有关乙型肝炎病毒cccDNA方面的研究进展予以综述。     

血清HBV RNA在慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中的动态变化及其临床意义

目的:探讨血清HBV RNA在慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗过程中的动态变化及其临床意义。方法:慢性乙型肝炎患者62例采用恩替卡韦抗病毒治疗,分别在第0、7、14、30天以及第2、3、6、9、12个月来本院进行随访,TaqMan探针法定量检测HBV RNA水平,采用实时荧光定量PCR法进行HBV DNA水平检测,采用化学发光法进行HBsAg和HBeAg检测,采用酶法进行ALT及AST检测。结果:血清HBV RNA水平随着治疗时间的延长呈下降趋势,治疗3个月后下降速度趋缓,从9个月后变化不大。血清HBV RNA水平从0 d到6个月间,各个相邻监测点间变化均有统计学意义（均P<0.05）,在治疗6～12个月两个时间点间差异无统计学意义（P>0.05）。HBeAg（+）患者基线血清HBV RNA与HBV DNA（rs =0.68,P<0.05）、HbsAg（rs =0.64,P<0.05）、HBeAg（rs=0.77,P<0.05）均强相关。在治疗前6个月各时间点,HBV RNA与HBV DNA呈强相关（rs＞0.5,P<0.05）。HBV RNA与HBsAg在治疗前3个月呈强相关（rs＞0.5,P<0.05）,治疗6～9个月时为弱相关（rs=0.23,P=0.31;rs=0.28,P=0.23）。HBV RNA与HBeAg水平在各治疗时间点均为强相关（rs＞0.5,P<0.05）。HBeAg（-）患者在治疗30 d时血清HBV RNA与HBV DNA 呈正相关（rs=0.62,P<0.05）,在治疗14 d时HBV RNA与HBsAg水平呈正相关（rs=0.60,P<0.05）。结论:抗病毒治疗时,慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA水平随着治疗时间的延长呈下降趋势。患者血清HBV RNA水平与血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg在治疗前和治疗初期有明显相关性,随着治疗时间延长,其相关性逐渐减弱。     

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

 目的  建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法  提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果  30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论  LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。