血浆外泌体miR-26a-5p和miR-151a-3p在结核病中的表达及诊断价值

目的 研究miR-26a-5p和miR-151a-3p在结核病血浆外泌体中的表达差异性及其诊断价值。方法 通过生物信息学网站筛选结核病外泌体中具有差异性表达的miRNAs(miR-26a-5p和miR-151a-3p)。再以70例结核病患者(结核病组),58例体检健康者(健康对照组)样本进行临床验证：采用差速离心法提取血浆外泌体,透射电子显微镜,粒径分析,Western blot对其鉴定,采用RT-qPCR检测血浆外泌体中miR-26a-5p和miR-151a-3p在结核病组和对照组中的表达水平,并通过ROC曲线评价二者在结核病中诊断价值。结果 透射电镜、粒径分析、Western blot鉴定到典型的外泌体特性,即成功提取到血浆外泌体。在临床验证中,以内参和外参同时校准,结核组患者血浆外泌体中miR-26a-5p表达水平低于对照组(P<0.000 1),结核组患者血浆外泌体中miR-151a-3p表达水平高于对照组(P<0.000 1),与生物信息学结果一致。作为诊断标记,以内参为基准,血浆外泌体miR-26a-5p、miR-151a-3p鉴别结核病的曲线下面积(AUC)分...     

人脐带间充质干细胞外泌体递送外源miR-130a-3p抑制人肺癌A549细胞的研究

目的 观察人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)外泌体介导的外源miR-130a-3p摄取对肺癌A549细胞的影响.方法 采用超速离心法分离hUC-MSCs外泌体,透射电子显微镜鉴定外泌体形态和大小,Western blot检测外泌体标志性蛋白(CD63、CD81)表达,纳米粒度分析仪(NTA)测定外泌体颗粒浓度和粒径...     

脓毒症患者早期外周血外泌体中miR-1-3p的表达分析

目的 本研究通过提取脓毒症患者与健康人的外周血中的外泌体,并对提取的外泌体中含有miR-1-3p进行荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,探讨miR-1-3p与脓毒症关系.方法 纳入2019年1月至8月本院重症医学科脓毒症患者17例,另取9例健康志愿者为对照组.按脓毒症诊疗常规处理,检测血常规、C-反应蛋白、降钙素原(...     

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

目的 探究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）外泌体源性miR-214-3p调控B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶β（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta,IKBKB）对宫颈癌细胞的影响。方法 采用生物信息学方法分析宫颈癌组织中异常表达的微RNA,最终选择miR-214-3p作为目的基因,并确定其下游靶基因IKBKB;检测宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-214-3p、IKBKB的表达情况;提取并鉴定BMMSC外泌体,干预外泌体中miR-214-3p的表达水平,构建IKBKB过表达质粒,将改造后的外泌体及质粒分别转染至宫颈癌HeLa细胞,测定转染后不同组别宫颈癌细胞焦亡相关指标。结果 生物信息学和实验检测均发现miR-214-3p在宫颈癌组织和细胞中低表达,而在BMMSC外泌体中高表达,且BMMSC源性外泌体可显著提高宫颈癌细胞中miR-214-3p的表达水平;IKBKB基因是miR-214-3p的下游靶点,在宫颈癌组织和细胞中高表达;高表达miR-214-3p可促进宫颈癌细胞焦亡,过表达IKBKB基因后宫颈癌细胞的焦亡水平显著降低。结论 BMMSC分泌的外泌体通过携带miR-214-3p调控IKBKB促进宫颈癌细胞焦亡。     

急性髓系白血病患者血清外泌体中miR-92a-3p的表达及其意义

目的：检测急性髓系白血病（AML）患者血清外泌体中微小RNA-92a-3p (miR-92a-3p表达水平,探讨其对AML的诊断价值。方法：选取AML患者51例（AML组）和34名同期健康体检志愿者（对照组）作为研究对象,收集研究对象外周血标本;差速离心法提取血清外泌体,通过透射电子显微镜、纳米粒度分析仪和Western blotting法鉴定外泌体;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测2组研究对象血清外泌体中miR-92a-3p表达水平;根据血清外泌体中miR-92a-3p表达水平绘制受试者工作特征（ROC）曲线,计算ROC曲线下面积（AUC）,确定其临界值,根据灵敏度和特异度评估miR-92a-3p表达水平对AML的诊断效能。结果：在透射电子显微镜下外泌体呈外观圆形且中间凹陷的膜状结构,纳米粒度分析仪检测外泌体粒径为30～100 nm,Western blotting法在提取外泌体中检测到CD63和CD9蛋白表达。与对照组比较,AML组患者血清外泌体中miR-92a-3p表达水平明显降低（P<0.01）;ROC曲线分析,血清外泌体miR-92a-3p诊断AML的最...     

星形胶质细胞分泌的外泌体对神经干细胞活力的影响研究

  目的  探讨小鼠星形胶质细胞外泌体对神经干细胞活力的影响。  方法  分离培养小鼠星形胶质细胞,收集细胞上清后超离出外泌体并予以鉴定。取原代培养的第2～6代神经干细胞,分别以0、20、40、60 μg/mL外泌体的条件培养基处理,CCK-8法筛选出培养神经干细胞的最佳外泌体质量浓度（40 μg/mL）。实验分为实验组（40 μg/mL外泌体处理的神经干细胞）和对照组（加入同等体积PBS处理的神经干细胞）,干预72 h后,EdU试剂盒标记阳性干细胞数。利用Transwell模型,通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色,荧光显微镜下分别统计出Transwell下室的实验组和对照组的细胞核个数。  结果  ①星形胶质细胞外泌体的鉴定:通过电镜、蛋白免疫印迹实验、外泌体浓度粒径等技术鉴定细胞上清超离出的外泌体;②CCK8实验检测:随着外泌体质量浓度的增加,促进原代神经干细胞的增殖作用逐渐增强,且与对照组相比,40 μg/mL、60 μg/mL外泌体组对神经干细胞均有显著增殖作用,但此两组间比较无明显差异,所以选择40 μg/mL为最佳干预质量浓度;③EdU检测:实验组EdU标记阳性细胞数高于对照组（P<0.05）;④Transwell模型中,实验组处理的神经干细胞从Transwell膜上层迁移到下层的细胞个数高于对照组（P<0.05）。  结论  小鼠星形胶质细胞外泌体可提高神经干细胞的生存活力。     

miR-27a-3p靶向调控Yes相关蛋白1促进人牙髓干细胞成骨分化

目的 探讨miR-27a-3p靶向调控Yes相关蛋白1(YAP1)基因对人牙髓干细胞(hDPSCs)成骨分化的影响.方法 体外分离培养hDPSCs细胞,将miR-27a-3p模拟物(miR-27a-3p mimics,过表达组)、miR-27a-3p抑制剂(miR-27a-3p inhibitor,敲低组)、miR-NC(对照组)分别转染至hDP-SCs细胞中,检测miR-27a-3p表达水平的改变对YAP1表达的影响.采用TargetScan数据库检索miR-27a-3p的靶基因.应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-27a-3p和YAP1的靶向关系.将miR-27a-3p mimics、miR-NC转染到hDPSCs特定时间后收集细胞,应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot等检测经典的成骨标志物骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、成骨转录因子-2(RUNX2)、骨桥蛋白(OPN)、YAP1 mRNA和蛋白表达水平.应用MTT比色法验证miR-27a-3p和YAP1对细胞增殖活性的影响.结果 过表达组hDPSCs细胞中miR-27a-3p的表达水平较对照组显著上调(P＜0.05),YAP1 mRNA和蛋白的表达水平下调(P＜0.05).而敲低组miR-27a-3p的表达水平较对照组明显下降(P＜0.05),YAP1 mRNA和蛋白的表达水平增高(P＜0.05).生物信息学分析表明,miR-27a-3p作用于YAP1的3'UTR区,双荧光素酶报告基因实验验证了YAP1是miR-27a-3p的靶基因.qRT-PCR、Western blot检测显示,与对照组相比,miR-27a-3p过表达时hDPSCs中BMP-2、RUNX2、OPN mRNA和蛋白的表达水平上调(P＜0.05).MTT检测显示,miR-27a-3p过表达可明显上调hDPSCs增殖率(P＜0.05),而YAP1过表达则会降低hDPSCs的增殖率(P＜0.05).结论 miR-27a-3p可能通过靶向调控YAP1促进hDPSCs成骨分化.     

被α-synuclein激活的小胶质细胞通过外泌体转运miR-19a-3p抑制神经细胞自噬

研究被过表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞外泌体刺激后的小胶质细胞重新分泌的外泌体（SNCA-HM Exo）的miRNAs成分变化,及其对神经细胞自噬的影响。     

外泌体miRNA-148a-3p在胃肠间质瘤中的表达及临床意义

目的 研究胃肠间质瘤患者血清外泌体中miRNA-148a-3p的表达情况及其与患者临床资料之间的关系.方法 选择2020年6月—2021年6月本院收治的37例间质瘤患者和10名体检的健康人作为研究对象,分为间质瘤患者组和正常组两组.利用超速离心法提取间质瘤患者和健康人血清中的外泌体,采用高通量测序和qRT-PCR检测外...     

外泌体转运miR-324-5p对胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨外泌体转运微小RNA(miR)-324-5p对胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响。方法培养人胃癌细胞系MGC-803并提取外泌体,制备外泌体转运miR-324-5p模拟物(mimic)。细胞分为对照组(细胞不进行处理)、外泌体组(外泌体混悬液)和miR-324-5p mimic组(加入外泌体转运miR-324-5p mimic混悬液),制备移植瘤模型。检测各组摄取外泌体效率。MTT法和流式细胞术检测细胞增殖率和凋亡率,qRT-PCR和Western blotting法检测各组瘤体中miR-324-5p、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和微管相关蛋白1轻链3(LC3)mRNA及蛋白的表达。结果外泌体组和miR-324-5p mimic组MGC-803细胞摄取外泌体效率分别为60%和57%。与对照组和外泌体组比较,miR-324-5p mimic组MGC-803细胞增殖率降低,凋亡率增加(P＜0.05);裸鼠移植瘤质量和CyclinD1 mRNA及蛋白降低,抑瘤率、miR-324-5p、p21、LC3 mRNA及蛋白增加(P＜0.05)。结论外泌体转运miR-324-5p能抑制MGC-803细胞增殖和促进MGC-803细胞凋亡,其机制可能是增加移植瘤中p21和LC3水平,降低CyclinD1水平,从而提高抑瘤率,降低移植瘤质量。     

子宫腺肌病治疗前后miR-103a-3p、sICAM-1、miR-101-3p表达及临床意义

目的 探讨子宫腺肌病治疗前后miR-103a-3p、可溶性细胞间黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)、miR-101-3p表达及临床意义。方法 选取承德市第三医院子宫腺肌病患者125例作为研究组,另选择同期月经正常、无痛经的健康体检者87例作为对照组。统计2组miR-103a-3p、sICAM-1、miR-101-3p, Spearman分析各指标与痛经强度、疗效相关性,绘制受试者工作曲线(receiver operating characteristic, ROC)及曲线下面积(area under the concentration-time curve, AUC)分析各指标对子宫腺肌病疗效预测价值。结果 治疗前研究组miR-103a-3p、miR-101-3p水平高于对照组,sICAM-1水平低于对照组(P<0.05)。治疗后,研究组miR-103a-3p、miR-101-3p水平低于治疗前,sICAM-1水平高于治疗前(P<0.05)。治疗前、治疗6个月后研究组重度患者miR-103a-3p、...     

miR-23a-3p在脂多糖诱导的人肾小管上皮细胞中的表达及作用

目的探讨miR-23a-3p在脂多糖诱导的人肾小管上皮细胞中的表达及其作用。方法使用LPS诱导人肾小管上皮细胞HK-2细胞建立脓毒症性急性肾损伤细胞疾病模型,用CCK-8法检测细胞活力,实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测IL-6 mRNA和miR-23a-3p的相对表达量。将实验细胞分为3组： 正常对照组、LPS＋空白对照(NC)组和LPS＋miR-23a-3p模拟物（mimic）组,采用Western印迹法检测炎症和凋亡相关蛋白p-NF-κB、IL-6、Cleaved Caspase-3和Usp5的表达水平。结果LPS可以抑制HK-2的细胞活力并增加炎症因子IL-6 mRNA的表达水平,同时,miR-23a-3p在LPS诱导的HK-2细胞中表达下降。与正常对照组相比,LPS增加了p-NF-κB、IL-6、Cleaved Caspase-3和Usp5蛋白的表达水平,而转染miR-23a-3p模拟物可以逆转以上这些变化。结论miR-23a-3p模拟物可以显著减轻LPS诱导的HK-2细胞的炎症和凋亡水平,其作用机制可能与靶向抑制Usp5有关。     

MicroRNA-122-5p与MicroRNA-199a-5p在EMS患者血清的表达及临床意义

目的 探讨microRNA-122-5p（miR-122-5p）与microRNA-199a-5p（miR-199a-5p）在子宫内膜异位症（EMS）患者血清的表达及临床意义。方法 前瞻性设计,随机选取2016年1月—2017年12月华北石油管理局总医院诊治的EMS患者90例（EMS组）及同期不孕症检查的患者70例（对照组）为研究对象。分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组人群血清的miR-122-5p和miR-199a-5p的表达及白细胞介素-6（IL-6）的表达,并分析其与临床特征的相关性。构建受试者操作特征（ROC）曲线。结果 EMS组患者的血清及腹腔液中IL-6、miR-122-5p、miR-199a-5p的表达与对照组比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,EMS组均增高。miR-122-5p的表达与IL-6水平（r?=0.578,P?<0.05）、miR-199a-5p表达（r?=0.721,P?<0.05）呈正相关。miR-199a-5p的表达与IL-6水平（r?=0.562,P?<0.05）呈正相关。miR-122-5p和miR-199a-5p检测EMS的敏感性分别为94.7%和92.1%,特异性分别为90.5%和88.6%。结论 血清miR-122-5p和miR-199a-5p在EMS患者中的表达增加,miR-122-5p与miR-199a-5p有成为诊断子宫内膜异位症的生物标志物的潜力。     

MiR-199a-3p在胰腺癌中的表达水平及生物信息学分析

目的:探讨miR-199a-3p在胰腺癌中的表达水平及作为胰腺癌的诊断指标的意义,并进行生物信息学分析。方法:从GEO数据库收集胰腺癌和正常胰腺组织中miR-199a-3p的数据。汇总数据绘制受试者工作特征曲线,进行Meta分析,采用生物信息学方法预测miR-199a-3p的靶基因,并对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果:收集到6个GEO数据,4个数据的ROC曲线表现出显著的诊断意义,Meta分析结果显示miR-199a-3p在胰腺癌中表达水平高于正常胰腺组织,差异有统计学意义（P<0.001）。预测到221个miR-199a-3p潜在的靶基因,其功能主要富集在基因表达的调控,细胞代谢的调控,蛋白质域特异性结合等生物学过程（P<0.001）,KEGG分析结果显示主要集中在PI3K-Akt通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调控、癌症通路、Hippo通路、鞘脂通路、ErbB通路、MAPK通路等通路（P<0.05）。结论:相比正常胰腺组织,miR-199a-3p在胰腺癌为高表达,可作为胰腺癌的一个潜在诊断指标,并可能在胰腺癌的发生发展中起到重要作用,为胰腺癌的研究和治疗提供了新的方向。     

MicroRNA-219a-5p和AFAP1L2对胰腺癌细胞的作用研究

目的 探讨microRNA-219a-5p（miR-219a-5p）和肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白2（AFAP1L2）对胰腺癌细胞的作用。方法 分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting法检测胰腺癌细胞株（PANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1）及正常胰腺导管上皮细胞（HPDE）miR-219a-5p、AFAP1L2的表达,采用siRNA及过表达质粒下调或上调AFAP1L2表达,CCK-8法观察胰腺癌细胞株增殖变化。采用mimics或inhibitor上调或下调miR-219a-5p表达,CCK-8法观察胰腺癌细胞株增殖变化。流式细胞术检测不同干预条件下细胞凋亡和细胞周期。生物信息学预测两者可能具有靶向调控关系。qRT-PCR和Western blotting法检测AFAP1L2 mRNA及蛋白表达,荧光素酶实验观察二者碱基配对关系,进一步验证miR-219a-5p对AFAP1L2具有靶向调控作用。结果 与HPDE细胞比较,胰腺癌细胞株中miR-219a-5p表达较低（P <0.05）。AFAP1L2 mRNA及蛋白在胰腺癌细胞株中的表达高于在HPDE细胞中的表达（P <0.05）。Capan-1或SW1990细胞培养48 h后,与空白对照组（NC组）比较,pCMV-EGFP-AFAP1L2组光密度（OD）值升高（P <0.05）,siAFAP1L2组OD值下降（P <0.05）,AFAP1L2对胰腺癌细胞增殖具有正向调控作用。Capan-1及SW1990细胞培养48 h后,与miR-NC组比较,miR-219a-5p mimics组OD值下降（P <0.05）,miR-219a-5p inhibitor组OD值升高（P <0.05）,miR-219a-5p表达对胰腺癌细胞增殖具有负向调控作用;上调miR-219a-5p表达,可诱导细胞S期阻滞,导致细胞凋亡增加。miR-219a-5p负向调控AFAP1L2表达;荧光素酶实验显示,miR-219a-5p与AFAP1L2的3''-URT互补结合,miR-219a-5p与AFAP1L2存在靶向调控关系。结论 miR-219a-5p通过靶向调控AFAP1L2表达负向介导胰腺癌细胞增殖及凋亡。     

miR-148a-3p对LPS诱导的肾小球系膜细胞增殖、凋亡及炎症因子的影响

目的 探讨miR-148a-3p对LPS诱导的肾小球系膜细胞增殖、凋亡及炎症因子的影响及其机制.方法 以肾小球系膜细胞(HBZY-1)为研究对象,分为control组、LPS组(10 μg/mL)和miR-148a-3p inhibitor组3组;qPCR法检测各组细胞中miR-148a-3p的表达水平;克隆形成实验检...     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的 探寻出生后1~3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法 向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子,采用单细胞克隆技术,分离出生后1~3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养;以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞,以及其分化后的细胞进行鉴定。结果 上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球,且具有连续克隆的能力;分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论 新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的时间效应

目的 探讨培养于诱导分化液中不同时间的大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的效应.方法 大鼠神经干细胞球在含有细胞因子IL-1、IL-11、GDNF和LIF的诱导分化液中分别培养2、4、6、8的10 d后,流式细胞仪检测其体外诱导分化成多巴胺能神经元的分化率.结果 在诱导分化液中大鼠神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,多数细胞有1、2个长突起或有多个短突起.免疫组织化学显示分化的细胞中含有TH阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2、4、6、8和10 d的神经球分化成TH阳性细胞比率分别为(3.2%±0.9%)、(6.8%±1.6%)、(16.7%±2.6%)、(14.8%±1.8%)和(12.2%±2.5%).结论 大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元存在着分化的时间效应,诱导分化6d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比率最高.