人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：以毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21（hFGF21）,为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法：根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastoris GS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut⁺,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果：PCR　扩增出约569 bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明：FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20 000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论：成功克隆FGF21基因,并在Picha pastoris　SMD1168中获得表达。     

牛碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆琢其酵母重组表达质粒的…

根据已有资料设计合成引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到牛ｂＦＧＦ ｃＤＮＡ全序列，经过序列分析后，建立其酵母分泌表达质粒ｐＶＴ１０２Ｕ／α－ｂｂＦＧＦ。     

血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子在喉癌细胞Hep-2中的表达

目的研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)在喉癌细胞Hep-2中的表达,及其与喉癌细胞生长、浸润及转移的关系。方法培养Hep-2和正常永生化表皮细胞HaCaT,提取总细胞RNA,应用逆转录聚合酶链反应检测VEGF mRNA和bFGF mRNA在Hep-2和HaCaT细胞中的表达。结果VEGF mRNA在Hep-2细胞中高表达,平均相对积分吸光度值为(0.839±0.063);VEGF mRNA在HaCaT细胞中低表达,平均相对积分吸光度值为(0.305±0.066),差异有极显著性意义(t=14.94,P<0.01)。bFGF mRNA在Hep-2细胞中高表达,平均相对积分吸光度值为(0.792±0.058);bFGF mRNA在HaCaT细胞中低表达,平均相对积分吸光度值为(0.296±0.049),差异有极显著性意义(t=17.54,P<0.01)。结论VEGF及bFGF与喉癌细胞的生长、浸润及转移有密切关系。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

碱性成纤维细胞生长因子mRNA在运动性肌损伤骨骼肌中的表达

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的mRNA在运动致骨骼肌损伤过程中不同阶段量的变化.方法 利用bFGF引物对不同阶段骨骼肌标本进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测其mRNA含量,电镜观查形态学变化.结果 在正常训练条件下,bFGF的mRNA在第8～12天明显升高;在一周力竭训练组,bFGF的mRNA在第2～6天明显升高.结论 SD大鼠骨骼肌运动损伤过程中有内源性bFGF mRNA的表达.     

牛碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及其酵母重组表达质粒的构建

根据已有资料设计并合成引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到牛ｂＦＧＦｃＤＮＡ全序列，经过序列分析后，建立其酵母分泌型表达质粒ｐＶＴ１０２Ｕ／ａ－ｂｂＦＧＦ。     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定

目的 :构建和表达一种抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白 ,在创伤皮肤表面应用时能裂解成有功能的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子 ,预防伤口感染和促进皮肤修复。方法 :利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因。再将两者作为模板 ,用PCR方法扩增出编码融合蛋白的DNA。将该DNA片段插入到载体pPICZαA中 ,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd116 8中 ,Zeocin抗性筛选重组转化子。甲醇诱导 96h ,SDS PAGE电泳检测融合蛋白的表达 ,并用Western blot杂交检测融合蛋白的免疫原性。利用肝素亲和层析纯化融合蛋白 ,同时检测融合蛋白的抑菌和促3T3Bal/b细胞分裂活性。结果 :筛选出能表达相对分子质量约为 19kD融合蛋白的重组转化株 ,SDS PAGE电泳检测显示甲醇诱导 96h后 ,融合蛋白表达量达到最高 ,且能与人酸性成纤维细胞生长因子抗体产生免疫反应。融合蛋白没有抑菌活性 ,而裂解产物则具有抑菌活性。此外 ,融合蛋白的促细胞分裂活性与野生型人酸性成纤维细胞生长因子相比没有明显的降低。结论 :获得含凝血酶切割位点的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白 ,并在毕赤酵母中实现了表达。融合蛋白的裂解产物具有抑菌活性。     

牛碱性成纤维细胞生长因子在酵母中表达产物的纯化与鉴定

在以往工作基础上，将已经鉴定的牛碱性成纤维细胞生长因子（ｂｂＦＧＦ）基因克隆至酵母分泌型功体ｐＶＴ１０２Ｕ／ａ并转化宿主菌Ｓ－７８，表达产物经一系列纯化后，得到ＳＯＳ－ＰＡＧＥ银染鉴定纯度〉９０％的最终产物，免疫学和细胞学检查结果表明，重组ｂｂＦＧＦ具有天然ｂｂＦＧＦ相同的生物活性。     

人胎盘生长因子2在毕赤酵母中的表达和纯化

为获得真核表达的重组人胎盘生长因子2(PIGF-2)纯化蛋白样品,采用基因工程方法构建重组人PIGF-2酵母表达载体pPIC9K-PIGF-2,电转后筛选阳性克隆,经甲醇诱导表达、肝素亲和柱色谱分离纯化得到蛋白纯化样品,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,该蛋白为重组人PIGF-2纯化蛋白,表明该法可用于制备分泌表达的hPIGR-2。     

肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆和表达

目的：克隆、表达和鉴定肿瘤坏死因子凋亡相关配体(TRAIL)．方法：从培养的人外周血淋巴细胞中提取总RNA，经RT-PCR获得TRAIL基因．将该基因克隆到pGEM-Teasy载体中，测序鉴定．将TRAIL基因插入pBV220表达载体中，42℃诱导表达4～5h，进行SDS-PAGE分析．免疫印迹法鉴定TRAIL蛋白的表达．结果：DNA测序证明，获得了TRAIL基因，其序列与GenBank中报道序列完全一致．SDSPAGE分析表明，TRAIL蛋白获得高效表达，分子质量为17ku，表达量约占菌体总蛋白的300k，．免疫印迹法鉴定显示，该蛋白可与鼠抗人TRAIL mAb产生阳性反应．结论：成功克隆和表达了TRAIL基因．     

外源性hbFGF cDNA导入人角朊细胞及其表达

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ,并探讨其机理;为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础。方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞。用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂ     

半定量RT-PCR检测细胞因子表达的研究

目的：建立一种客观、敏感的检测IL-2／IL-4细胞因子基因表达变化的方法。方法：采用TRIzol试剂提取免疫排斥／免疫耐受大鼠脾脏组织总RNA，分光光度计法定量。取2μg总RNA．采用RT—PCR法逆转录-扩增IL-2、IL-4和内参照β-actin cDNA。扩增产物经电泳分离后。用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，检测其相对表达量。结果；RT—PCR产物经电泳后。β-actin、IL-2和IL-4分别在226bp、342bp和332bp处出现明显条带，与预定条带大小相一致；免疫耐受组IL-4与免疫排斥组IL-2的表达有明显差异．在免疫耐受组中IL-4表达增高，而在免疫排斥组中IL-2表达增高，内参照β-actin扩增条带亮度在两组中相同，PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的对应关系。结论：半定量RT—PCR检测是-种从少量细胞中快速、简便、可靠地检测特异基因mRNA表达的方法。     

人角蛋白K6acDNA的克隆及其在E.coli中的表达

目的：克隆并表达人角蛋白K6a cDNA。方法：从人角质形成细胞中提取RNA,以RT－PCR法扩增人角蛋白K6a(1.7kb)cDNA。测序正确,将该片段克隆入表达载体pRSETB中,用IPTG诱导表达。结果：获得了角蛋白K6a（1.7kb)cDNA片段,并在大肠杆菌中获得高效表达。结论：获得了人角质蛋白K6a(1.7kb)cDNA片段及其原核表达产物,对研究人角蛋白K6a功能有重要意义。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

表皮生长因子受体配体在星形胶质细胞上的表达

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)配体在星形胶质细胞上的表达。方法:采用RT-PCR技术检测星形胶质细胞上表皮生长因子、转化生长因子α、肝素结合上皮生长因子和双调蛋白的表达。结果:表皮生长因子、转化生长因子α、肝素结合上皮生长因子在星形胶质细胞上均有表达。而双调蛋白在星形胶质细胞上无表达。结论:星形胶质细胞在促进神经发生和有丝分裂后期神经元存活和分化中发挥重要的作用。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。