泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化方法的优化

目的：筛选和优化泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化的方法,为进一步筛选Em18抗原表位奠定基础.方法：原核表达pET41a-Em18重组质粒,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达,获得rEm18-GST蛋白,采用不同的超声程序破碎大肠杆菌细胞,分别采用GST柱、His柱及两者结合方法,改变不同的平衡、洗涤和洗脱缓冲液浓度,纯化rEm18-GST蛋白.结果：（1） rEm18-GST蛋白在相对分子质量为50 kDa处有表达条带,蛋白表达量随诱导时间的延长而增加;（2）超声程序为工作1 s,间歇3 s,每个循环时程10 min,加入蛋白酶抑制剂,可降低目的蛋白的降解;（3）采用单纯His柱可获得回收量高、纯度高的rEm18-GST蛋白.结论：（1）对含有GST-tag和His-tag双重标签重组蛋白的纯化,应用His柱更有效,更经济;（2）建立和优化一套从大肠杆菌细胞中分离纯化重组Em18蛋白的有效方法.     

重组蛛丝蛋白工程菌高密度发酵及蛋白的纯化

蜘蛛丝是自然界中性能优良的天然蛋白纤维。为了从基因工程菌中获取大量的重组蛛丝蛋白，采用溶氧反馈．分批补料的高密度发酵方法，在培养过程中保持溶解为30％～40％，以溶氧反馈控制补料培养基流加速度，成功地进行了工程菌的高密度培养，最终菌体OD600达51．2，菌体干重24、1g／L，重纽蛛丝蛋白表达率22．1％，并采用金属亲和层析对重组蛛丝蛋白进行了有效纯化。     

抗癌蛋白NOR1基因工程重组蛋白表达条件的优化和纯化

目的:构建NOR1基因原核表达载体,并在大肠杆菌中原核表达NOR1重组蛋白,对其诱导条件进行优化,并纯化NOR1蛋白.方法:PCR扩增人NOR1基因全长开放阅读框,克隆入原核表达载体pET28b.重组质粒转化大肠杆菌,采用不同温度、不同抗生素浓度、不同IPTG浓度诱导NOR1蛋白表达.选择最佳条件大量诱导NOR1蛋白表...     

重组凋亡相关蛋白PDCD5的纯化及稳定性

目的：建立简便、有效的原核表达促凋亡相关蛋白PDCD5的纯化路线，获得高纯度的PDCD5蛋白，并观察其稳定性。方法：以包涵体形式表达的PDCD5融合蛋白，经包涵体洗涤、变性、复性、酶切、DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200两步层析分离获得PDCD5蛋白。选用毛细管电泳方法检定蛋白质纯度，SDS—PAGE检定蛋白质的稳定性。结果：经毛细管电泳方法检测PDCD5蛋白纯度为100％，相对分子质量15800，等电点5．9。生物学活性分析PDCD5蛋白能够促进撤除细胞因子的HL-60细胞的凋亡，呈现一定的量效关系。稳定性研究发现储藏中的PDCD5蛋白不稳定，对温度敏感，4℃和25℃极易降解，而-20℃和冻干保存则相对稳定。结论：本研究建立的蛋白纯化方法可以获得大量、高纯度PDCD5蛋白。稳定性实验提示PDCD5宜在-20℃以下或冻干保存。     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

重组血红蛋白的纯化

在大肠杆菌中用热诱导方式分别进行了人重组血红蛋白α、β珠蛋白的非融合高效表达，并对表达产物进行阴离子交换、凝胶过滤纯化，使表达产物的纯度达90%左右，此为下一步制度和纯化人血红蛋白多克隆抗体奠定了关键基础。     

人重组MPIF-1(25-99)蛋白的纯化

目的：探索截短型髓样造血细胞抑制因子-1(MPIF—1)蛋白纯化的技术路线。方法：构建MPIF—1(25-99)-pMTY4原核表达载体，转化大肠杆菌后，用摇瓶培养，收获诱导菌，经破碎菌体一洗涤包涵体一溶解包涵体一复性初步纯化后，再经二步柱层析纯化。结果：获得了MPIF—1(25-99)的高效表达，表达量约占苗体总蛋白的30％。经纯化后，MPIF—1(25—99)蛋白的纯度达80％以上。结论：获得纯化的MPIF—1(25——99)蛋白。     

小鼠IL-4重组质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化

目的 构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并鉴定.方法 将优化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a (+)上,获得重组质粒pET32/rmIL-4,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体.经复性处理后,依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白.对纯化得到的蛋白用Western blot检验免疫学特异性,用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功.诱导得到的包涵体用3 mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7 mol/L盐酸胍溶液中变性,在pH9.5的条件下梯度透析复性.纯化出的蛋白经Western blot鉴定,能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合;经细胞和动物实验鉴定,rmIL-4蛋白具有生物学活性,能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖,使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4,为进一步研究其生物学功能提供了条件.     

重组人白细胞介素2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的 探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2－绿脓杆菌外毒素（IL－2－PE66^4lu）融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法 采用该所发明的新方法提纯包涵体，包涵体复性后，样品经DEAE＝SepharoseFF离子交换层析，获得融合蛋白纯品。结果 获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95％，复性咽收率为80％。结论 此包涵体分离纯化技术简便、实用，可为中试研究和规模化生产提供基础。     

高通量蛋白纯化方法的建立

目的:建立一种简便、经济的高通量蛋白纯化的技术平台。方法:利用重组融合蛋白N端所带的6×H is标签,通过96孔板对172个在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的鼠疫菌蛋白进行高通量纯化。将纯化出的蛋白制备蛋白芯片,与抗6×H is的单抗反应筛选出能够满足后续试验要求的蛋白。结果:通过改变细菌培养温度、IPTG诱导浓度等条件,经过三次96孔板纯化,在两个星期内完成了对149个重组蛋白的纯化。结论:这种简便、快捷、经济的蛋白高通量纯化技术平台的建立,为大规模蛋白的研究提供了基础。     

人表皮生长因子-天花粉蛋白融合蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的 构建人表皮生长因子(EGF)-linker-天花粉蛋白(TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-linker-TCS融合蛋白.方法 用PCR方法扩增EGF及柔性连接肽Linker基因片段,插入质粒PQE30-TCS中,转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-linker-TCS).表达产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 PQE30-EGF-linker-TCS蛋白在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化后纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功地构建了融合蛋白EGF-linker-TCS的表达载体,表达并纯化了该融合蛋白,为进一步研究其结构功能关系和肿瘤临床应用奠定了基础.     

重组SARS冠状病毒N蛋白纯化与鉴定

目的分析重组SARS-CoVN蛋白的表达,并予以纯化。方法SDS-PAGE分析N蛋白的表达,于自动蛋白层析系统上,用His·BindTM柱亲和层析纯化。结果重组表达的N蛋白存在于裂解细菌上清中,分子量大小约49000u,N蛋白经亲和层析获得纯化,纯化蛋白能与病人血清反应。结论表明自动层析获得了纯化良好抗原性的N蛋白。     

重组生长激素释放激素GHRH的纯化及活性测定

OBJECTIVE: To express recombinant growth hormone-releasing hormone (GHRH) peptide in E.coli by genetic engineering and examine its biological activity. METHOD: GHRH peptide was purified to homogeneity by means of cell lysis, washing, ethanol precipitation, acid hydrolysis, SP-Sephadex C25 and Sephadex G-25 column chromatographies. RESULT: SDS-PAGE showed that the recombinant plasmid pET-28a /L-ansB-GHRH in E.coli BL21(DE3) expressed the fusion protein under the induction with IPTG. The fusion protein was expressed in the form of inclusion body, accounting for 30% of the total bacterial protein. After the purification procedures, the peptide was purified about 147-fold with a peptide yield of 0.68%. The molecular mass of the peptide was 5 235 Da as determined by electrospray ionization (ESI) mass spectrum, in agreement with the predicted value, and SDS-PAGE presented a single peak in assessment of the purity. Experiment showed that there were significant differences in the growth hormone released by the peptide between the dose groups and the blank control group, and the differences tended to be more obvious with the increase of the doses. CONCLUSION: The recombinant GHRH peptide possesses good biological activities.     

HSV—1包膜糖蛋白G重组蛋白的纯化与抗原性分析

目的：纯化原核表达的HSV－1包膜糖蛋白G重组蛋白并对其抗原性进行分析。方法：应用亲和层析法纯化重组蛋白，Western印迹和ELISA法检测分析其抗原性。结果：Western-Blot检测15份HSV－1 IgM阳性血清，其中12份血清可与重组蛋白发生反应；ELISA法检测535份血清，与商品化同类试剂盒相比符合率为89．7％。结论：该重组蛋白检测HSV－1活动性感染有较高的应用价值。     

p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的：制备p62DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法：用PCR方法扩增编码p62Dok PTB结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL－21,构建成表达GST－PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后,经Glutathion-Sepharose 4B亲和层析柱纯化,用SDS－PAGE进行分析,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的25％。结果：获得重组GST－PTB融合蛋白,纯度在95％以上,产物得率约75％。结论：成功制备高纯度p62DokPTB结构域的GST融合蛋白,为进一步研究p62DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌Tipα重组蛋白的表达?纯化及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌(H.polyri,HP)的Tipα基因,构建含有Tipα的重组载体,在大肠杆菌表达并纯化以获得Tipα蛋白。方法:从HP的26695菌株扩增位于HP0596的Tipα基因,将Tipα基因与pET28a载体(His标签)同时经BamHI和XhoI酶切、纯化及连接后,构建含有Tipα的重组载体pET28a-Tipα,重组载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物以Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot进一步鉴定。结果:克隆Tipα基因,经测序证实与Genbank对比,二者同源性为100%。大肠杆菌表达产物,纯化后SDS-PAGE显示相对分子量为23 ku。Western blot证实纯化产物与抗Tipα抗体特异性结合。结论:成功克隆并表达出HP的Tipα蛋白,为进一步研究Tipα的功能奠定基础。     

人重组白细胞介素—8的快速纯化

报道一种快速人重组ＩＬ－８纯化方法，大肠杆菌表达的ＩＬ－８包涵体经尿素变性后，直接用ＤＥＡＥ柱和ＳｅｙｈａｄｅｘＧ５０柱纯化，纯化的ｈＩＬ－８经ＦＰＬＣ鉴定，纯度的９０％以上，该法为实验室快速，简便纯ｈＩＬ－８提供了新的技术路线。