SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

EphB4信号通路对人胚胎神经干细胞自我更新、增殖、分化和凋亡的影响

目的本实验旨在研究EphB4是否参与调节了人胚胎神经干细胞的增殖、分化、凋亡活动,并探索其下游信号通路。方法培养原代人胚胎神经干细胞,使用沉默慢病毒与过表达慢病毒转染细胞,分别下调和上调EphB4蛋白表达水平。检测EphB4对细胞增殖、分化、凋亡的影响并探索其下游信号通路。结果 EphB4基因沉默后,抑制细胞增殖及向神经元分化,促进细胞向胶质细胞分化,对细胞凋亡无影响。EphB4基因过表达后,促进细胞增殖及向神经元分化,抑制细胞向胶质细胞分化,对细胞凋亡无影响。EphB4是通过下游信号通路Abl-Cyclin D1调节细胞增殖,此信号通路不参与EphB4在细胞分化方面的调节。结论 EphB4参与调节神经干细胞增殖,而且是决定神经干细胞向神经元分化还是向胶质细胞分化的开关,是调节干细胞增殖、迁移和分化的新信号通路,其很可能成为脑卒中后神经元修复的有效治疗靶点。     

蛇床子素通过Wnt/β-catenin信号通路促进转染APP基因的神经干细胞分化为更多神经元且减少神经元凋亡

目的通过转染APP基因于神经干细胞,研究蛇床子素对其增殖和分化能力的影响,及对神经元凋亡的影响,并研究其机制。方法体外建立阿尔茨海默病的神经干细胞模型,利用免疫组化染色法,研究蛇床子素对转染APP基因的神经干细胞增殖和分化能力的影响;通过CCK-8法检测神经干细胞存活率;Hoechst 33258法检测神经元凋亡情况;RT-PCR法检测GSK-3β和β-catenin mRNA的表达变化情况;Western blot法检测GSK-3β和β-catenin蛋白的表达变化情况。结果与APP组相比,蛇床子素组的神经干细胞增殖能力提高了10.24%;分化为神经元的能力提高了6.74%。与APP组相比,蛇床子素组神经干细胞的存活率明显提高;神经元凋亡明显减少;RT-PCR和Western blot结果显示,蛇床子素可抑制GSK-3β基因和蛋白的表达,促进β-catenin基因和蛋白的表达。结论蛇床子素可促进转染APP基因的神经干细胞的增殖,可促进其分化为更多的神经元,并减少神经元凋亡,可能与通过激活Wnt/β-catenin信号通路有关系。     

核受体相关因子1基因转染对神经干细胞体外分化的影响

目的 研究核受体相关因子1(NuRR1)基因对神经干细胞体外分化的影响.方法 收集C17.2细胞和pAdeasy-NURR1+C17.2细胞,分别滴加至皿底铺满盖玻片的7 cm培养皿中,每组10个培养皿.含血清培养液培养4 h细胞贴壁后换无血清培养基继续培养3 d,固定.分别行巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)免疫组织化学检测,计数阳性细胞比例.结果 C17.2细胞、pAdeasy-NURR1+C17.2细胞体外无血清培养细胞爬片,Nestin免疫组织化学检测阳性细胞率分别为(15.25±2.45)%、(16.27±1.77)%,差异无统计学意义(P＞0.05);NSE免疫组织化学检测阳性细胞率分别为(21.48±0.72)%、(70.28±2.14)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NURR1基因转染能促进C17.2神经干细胞向神经元方向分化.     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。     

人骨髓基质干细胞向神经元分化的实验方法改进

目的 改进人骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化的方法，使诱导分化后的神经元样细胞存活时间延长，为其将来可能的临床应用提供理论基础。方法 采用Percoll液分离成人骨髓基质干细胞(hBMSCs)，体外扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达．应用丁羟茴醚(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)，NT-3和PDGF定向诱导hBMSCs分化为神经元样细胞。结果 hBMSCs在体外扩增后，流式细胞检测结果显示CD29、CD44表达阳性，CD11b、CD45表达阴性；加入诱导剂一定时间后，细胞形态发生改变，同时神经丝蛋白表达阳性，胶质纤维酸性蛋白表达阳性。结论 成人骨髓基质干细胞在体外可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞，而且较单独使用BHA DMSO诱导的方法延长了诱导后的细胞存活时间。     

EGB对大鼠神经干细胞分化为星形胶质样细胞的影响

目的：观察银杏叶提取物（EGB）对大鼠海马神经干细胞（NSCs）增殖及分化为星形胶质样细胞的影响。方法：取新生24h内的Wistar大鼠海马组织的细胞进行体外培养，1周后将其接种在培养板中．观察不同浓度的EGB对细胞的生长作用．并检测胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：各实验组NSCs的生长明显好于对照组．免疫细胞化学显示：同一时间内，诱导NSCs分化为星形胶质样细胞的百分率增高；同一浓度的EGB，诱导神经干细胞分化为星形胶质样细胞的百分率随着时间的延长呈上升的趋势。结论：EGB能促进神经干细胞的存活、增殖及向星型胶质样细胞的方向分化。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化鉴定

目的建立神经干细胞分离、培养和分化鉴定技术。观察神经干细胞生长、增殖特点。方法利用无血清培养,从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术,观察鉴定神经干细胞及其分化结果。结果从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有巢蛋白(nestin)表达阳性细胞,显微镜下观察见典型的干细胞特征。分化为3种神经细胞类型:神经元、胶质细胞、少突胶质细胞。结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,通过鉴定确为神经干细胞,并经过分化鉴定确认。     

转胰岛素样生长因子Ⅰ基因促细胞增殖作用的研究

目的：研究转胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因对细胞增殖的影响。方法：构建含IGF-1信号肽及成熟肽全部编码序列的重组报告基因载体pTracer-IGF-1，脂质体法将该重组质粒转染入体外培养的C2C12小鼠成肌细胞。以杀稻瘟毒素(blasticidin)筛选出稳定转染的细胞并进行克隆化，^3H-TdR法检测细胞增殖率。结果：与对照组相比，转IGF-1基因细胞的增殖速率明显增加，其培养基亦可显著促进细胞的增殖。结论：所转染的IGF-1基因可在受体细胞内稳定的表达，合成的IGF-1可被分泌至培养基中，在局部发挥促细胞增殖作用。     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

岩大戟内酯B通过阻断PI3K/Akt/NF-κB通路抑制结肠癌细胞的增殖和转移

目的:研究岩大戟内酯B(JB)对结肠癌HT-29细胞增殖和转移的抑制作用及其作用机制。方法:用不同浓度JB处理HT-29细胞,采用MTT法检测细胞增殖率;平板克隆实验检测细胞克隆形成率;流式细胞仪检测细胞周期变化;划痕实验分析细胞的迁移能力;Transwell小室实验研究细胞的侵袭能力;免疫荧光法和Western blotting法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白vimentin、锌指蛋白(Snail)1、Snail2、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白的表达;Western blotting法检测p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、NF-κB P65、p-NF-κB P65蛋白表达水平。100μg/L IGF-1组和100μg/L IGF-1+20μmol/L JB组分别处理HT-29细胞,Western blotting法检测PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达变化。结果:JB抑制HT-29细胞增殖作用浓度依赖性,其作用24 h的IC 50为52.68μmol/L;JB呈浓度依赖性地降低HT-29细胞的克隆形成率(P<0.05);与对照组相比,JB处理后的HT-29细胞G0/G1期比例显著增高,S期细胞比例明显下降;JB可显著抑制HT-29细胞的体外迁移、侵袭能力(P<0.05);JB作用后的HT-29细胞E-cadherin蛋白水平升高,vimentin、Snail1、Snail2、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB P65蛋白表达水平显著降低(P<0.05);IGF-1+JB组p-PI3K、p-Akt、与p-NF-κB P65蛋白的表达水平较IGF-1组显著下降(P<0.05)。结论:JB在体外能抑制HT-29细胞增殖,诱导细胞在G0/G1期阻滞,抑制HT-29迁移和侵袭,调控上皮-间质转化(EMT)及MMPs,其机制可能与阻断PI3K/Akt/NF-κB通路有关。     

Shh通路介导损伤后反应性星形胶质细胞获得干细胞潜能

目的 探讨Shh信号通路对大脑皮质反应性星形胶质细胞（RAS）获得神经干细胞潜能的影响。方法 体外原代培养SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞,以肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1α和C1q三种因子诱导炎症型RAS,划痕实验制备创伤型RAS,使用免疫荧光染色法观察细胞形态及纯度。实验分为普通星形胶质细胞组（对照组）、炎症组、划痕组（创伤组）。炎症组培养至干预后 24 h,对照组和划痕组培养至第 5天进行免疫荧光染色观察巢蛋白（Nestin）阳性细胞,运用Western blot技术检测不同损伤模型的细胞中Shh蛋白的表达量。之后各组细胞培养 至第7天更换神经干细胞培养基,将前述3组各自再分为激活组（各组细胞更换神经干细胞培养基后添加Shh激活剂SAG）和抑制组（各组细胞更换神经干细胞培养基后添加Shh抑制剂环巴胺）两个亚组,培养14 d后采用qRT-PCR检测各亚组 RAS源性神经干细胞相关基因的表达量。结果 细胞损伤模型中,免疫荧光染色证明各组细胞中划痕组Nestin阳性细胞明显多于炎症组和对照组。Western blot结果显示2组损伤细胞中划痕组Shh蛋白表达量高于炎症组（P＜0.05）。更换神经干细胞培养基后,激活组中 2 组损伤细胞的干细胞相关基因 Nestin、Pax-6、Sox-2、Oct-4 和Map-2的表达水平均有所升高,其中由划痕诱导的RAS神经干细胞相关基因Nestin、Pax-6、Sox-2、Oct-4和Map-2的表达水平高于炎症诱导的 RAS神经干细胞和普通星形胶质细胞（P＜0.01）;添加 Shh抑制剂后,3组上述基因表达量皆明显降低,但划痕组的表达量仍高于其他 2组（P＜0.01）。结论 在体外,Shh信号通路可以介导损伤后大脑皮质RAS获得干细胞潜能。     

同型半胱氨酸对体外大鼠神经干细胞增殖及Notch信号通路相关基因表达的影响

【摘要】目的 研究同型半胱氨酸（Hcy）对体外大鼠神经干细胞(NSCs)增殖及Notch信号通路相关基因Notch1和Hes1mRNA表达的影响。方法 采用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs,细胞分为对照组(Hcy-C)、Hcy低剂量组（Hcy-L）、Hcy中剂量组（Hcy-M）、Hcy高剂量组（Hcy-H）。采用免疫组化法检测Nestin、β-tubulin Ⅲ及GFAP的表达对NSCs进行鉴定,MTT法检测细胞增殖情况,Real-time PCR检测Notch1、Hes1基因mRNA表达。结果 无血清培养条件下,所培养细胞形成大量呈Nestin抗原阳性细胞组成的神经球;诱导分化6d后,形成β-tubulin Ⅲ表达呈阳性的神经元和GFAP表达呈阳性的星形胶质细胞;Hcy干预组细胞活力低于对照组,且有剂量依赖性(P<0.05)。Hcy干预组Hes1mRNA表达低于对照组(P<0.05)。Hcy-H组Notch1mRNA表达低于其他3组(P<0.05);Hcy-M组Notch1mRNA表达低于对照组和低剂量组(P<0.05)。结论 Hcy能抑制大鼠新生鼠NSCs的增殖,可能与下调Notch信号通路中Notch1和Hes1mRNA表达有关     

二噁英对成骨肉瘤细胞增殖和胰岛素样生长因子2表达的影响

目的探讨环境类致癌因子二噁英(TCDD)对成骨肉瘤细胞增殖及胰岛素样生长因子2(IGF-2)mRNA和蛋白表达的影响。方法TCDD作用于人成骨肉瘤细胞SaOS-2细胞株24~48h。MTT法检测细胞增殖率;对硝基酚磷酸盐法测定细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR半定量分析细胞IGF-2 mRNA的表达;Western蛋白质印迹法测定细胞IGF-2和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路中p38 MAPK蛋白表达及其磷酸化水平。结果与对照组比较,TCDD 1,10和100nmol·L-1作用48h,使SaOS-2细胞内ALP活性分别增加38%,95%和142%。TCDD 1,10及100nmol·L-1作用24h后,SaOS-2细胞存活率分别增加21%,47%和56%,细胞内IGF-2 mRNA和IGF-2蛋白表达均增加。TCDD对SaOS-2细胞内p38 MAPK蛋白表达无明显影响,但明显降低其磷酸化水平。结论TCDD具有促进SaOS-2细胞增殖的作用。TCDD可能通过促进SaOS-2细胞内IGF-2的表达,并抑制MAPK信号通路中转录因子p38 MAPK活性而促进细胞增殖。     

Perfluorooctane sulfonate (PFOS) impairs the proliferation of C17.2 neural stem cells via the downregulation of GSK‐3β/β‐catenin signaling

The neurotoxic effects of perfluorooctane sulfonate (PFOS) have attracted significant research attention in recent years. In the present study, we investigated the impact of PFOS exposure on the physiology of neural stem cells (NSCs) in vitro. We showed that PFOS exposure markedly attenuated the proliferation of C17.2 neural stem cells in both dose‐ and time‐dependent manners. Additionally, we found that PFOS decreased Ser9 phosphorylation of glycogen synthase kinase‐3β (pSer9‐GSK‐3β), leading to the activation of GSK‐3β and resultant downregulation of cellular β‐catenin. Furthermore, blockage of GSK‐3β with lithium chloride significantly attenuated both the PFOS‐induced downregulation of GSK‐3β/β‐catenin and the proliferative impairment of C17.2 cells. Notably, the expression of various downstream targets was altered accordingly, such as c‐myc, cyclin D1 and survivin. In conclusion, the present study demonstrated that PFOS decreased the proliferation of C17.2 cells via the negative modulation of the GSK‐3β/β‐catenin pathway. We present the potential mechanisms underlying the PFOS‐induced toxic effects on NSCs to provide novel insights into the neurotoxic mechanism of PFOS. Copyright © 2016 John Wiley & Sons, Ltd.     

Effects of diosgenin on cell proliferation induced by IGF-1 in primary human thyrocytes

Others and our previous studies showed that the increase of IGF-1 was involved in the formation of goiter. Our aim here was to evaluate the possible effects of diosgenin on cell proliferation induced by IGF-1 in primary human thyroid cells. The cells were treated with or without different concentrations of diosgenin in the present or absent of IGF-1 for 24, 48 and 72 h, respectively. Cell viability was determined by MTT, and cell proliferation was tested by EdU assay, and cell cycle analysis was performed by FACS. In addition, Cyclin D1 and B1 protein expression was tested by Western Blotting, respectively. We found that IGF-1 promoted cell cycle progression to S phase and increased the primary human thyroid cells proliferation. Diosgenin decreased the protein expression of cyclin D1 and resulted in cell G(0)/G(1) arrest. Importantly, when the human thyrocytes were exposed to diosgenin in the present of IGF-1, the IGF-1 inducing proliferation was significantly decreased and the proportion of the cells in G(0)/G(1) phase was increased, while that of S phase was decreased. This study shows that diosgenin inhibited cell proliferation, caused G(0)/G(1) arrest, and could inhibit cell proliferation induced by IGF-1 in primary human thyroid cells.     

β-淀粉样蛋白对神经干细胞致凋亡作用研究

目的观察β-淀粉样蛋白(Aβ)能否诱导体外培养的大鼠神经干细胞凋亡。方法取孕13d的胎鼠大脑,体外进行培养、传代、鉴定后,加入Aβ,利用细胞计数观察细胞增生,利用琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪观察凋亡情况。结果当Aβ浓度>25μmol/L时,能明显抑制神经干细胞的增生,同时引起神经干细胞的明显凋亡。结论Aβ抑制神经干细胞的增生并可致神经干细胞凋亡,可能与阿尔茨海默病的发病有关。     

Microarray analysis of the effects of serum-free medium on gene expression changes in human mesenchymal stem cells during the in vitro culture

We examined the effects of serum-free medium on the gene expression changes in human mesenchymal stem cells (hMSCs) during the in vitro culture using a DNA microarray analysis. In this study, we cultured hMSCs with two kinds of medium; 1) MSCGM (contain 10% fetal bovine serum) or 2) STK2 (serum-free medium developed for mesechymal stem cells multiplication), and compared hMSCs proliferation, cell morphology, and gene expression changes until 50 days culture. Expression analysis was performed with Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array. hMSC proliferation was significantly higher in STK2 medium than in MSCGM medium. The cell morphology of hMSC cultured with STK2 was not significantly changed in 50 days culture. The gene expression changes in hMSCs during the in vitro culture were significantly higher in STK2 than in MSCGM. After 50 days culture, 1991 genes were significantly changed the expression levels compared with 3 days in STK2 but not MSCGM. The expressions of genes related to cell cycle, cancer, proliferation, and cell growth were significantly changed by STK2 for 50 days culture. It was also changed by STK2 that the expressions of genes related to the signaling pathways contain various growth factors, such as IGF-1, FGF, TGF-β, EGF, proliferation, and cell cycle. These results suggest that STK2 may be useful to obtain an enough number of hMSC cells for tissue engineered medical devices in short-term, however, it should be recognized that STK2 would alter the expressions of genes related to a variety of signaling pathways in hMSC if the culture period would be extended to obtain a large number of cells.     

rhIGF-1对神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的：研究重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1）对缺血再灌注所致神经细胞损伤的保护作用。方法：自新生大鼠脑组织中分离培养原代神经细胞,^3H—TdR掺入法检测rhIGF-1对神经细胞增殖的影响。将所培养的细胞分为正常对照组、类缺血对照组及损伤后rhIGF-1干预组，对不同组别的细胞进行类缺血-复氧处理，流式细胞检测细胞凋亡情况。结果：rhIGF-1可明显促进原代培养的神经细胞增殖，并降低再灌注损伤所导致的细胞凋亡。结论：rhIGF-1对神经细胞缺血再灌注损伤具有保护及治疗作用。