转染血小板源生长因子和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制移植血管狭窄的实验研究

目的　探讨联合应用血小板源生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)防止移植血管狭窄的作用。方法　将同一只兔的左、右髂外动脉(各1 0cm)对换移植,移植血管用PDGF- AODN和PCNA -AODN转染;移植血管病理切片后测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并分别用原位杂交组织化学和免疫组织化学染色计数PDGF和PCNA阳性细胞数。结果　PDGF- AODN加PCNA- AODN组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和PDGF阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于对照组(P<0 .01),而且亦明显低于单独转染PDGF- AODN组或PCNA -AODN组(P<0. 05 ),PDGF AODN组和PCNA AODN组间差异无显著意义(P>0. 05 )。结论　联合应用PDGF AODN和PCNA- AODN能有效抑制血管平滑肌细胞增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。     

反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞c-myc、增殖细胞核抗原蛋白表达的影响

目的　研究反义c myc、增殖细胞核抗原 (PCNA)基因片断对血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的作用。　方法　使正义、反义及错配反义c myc、PCNA ,分别作用于体外培养的VSMCs ,应用蛋白印迹和免疫组化法测定并经计算机图像分析 ,观察其对c myc、PCNA蛋白表达的影响。　结果　 10μmol/L浓度的反义c myc、PCNA作用于VSMCs后 1～ 5d ,相应c myc和PCNA蛋白表达减弱 ,计算机图像分析表明其表达产物与对照组相比 ,差异有显著意义 (P <0 0 5 ) ,而正义和错配反义寡核苷酸无此效应 (P >0 0 5 )。　结论　反义c myc、PCNA寡核苷酸可通过阻遏其相应基因表达进而抑制蛋白表达及VSMCs增殖。     

反义核酸抑制增殖细胞核抗原表达的研究进展

反义核酸是天然存在于原核生物内或根据碱基互补原理人工合成的短片断寡聚核苷酸,通过与靶基因或mRNA配对结合,阻断基因转录和翻译,从而特异性抑制靶基因的表达。1978年Zamecnik等〔1〕首次将反义技术应用于抑制病毒基因表达研究并获得成功,从而进入了应用反义技术研究基...     

PCNA反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞体外增殖的研究

目的 观察增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对人肝癌细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变，方法 MTT法，集落形成试验观察PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制，免疫组化技术检测PCNA的蛋白表达，流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCNA反义核酸作用后的肝癌细胞生长明显受到抑制，抑制效应于作用后48h最为明显，并于72h后逐渐减弱，集落形成率明显下降，PCNA蛋白表达明显下降，细胞周期中S期细胞数明显减少。结论 PCNA反义寡核苷酸能显著抑制人肝癌细胞的生长。     

脂质体介导增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞增殖的实验研究

目的 观察脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）对肝癌细胞增殖的影响。方法：根据PCNA cDNA序列设计合成与PCNAmRNA AUG起始密码子后的18位碱基序列互补的PCN反义寡核苷酸，脂质体介导转染人肝癌细胞析，通过细胞生长曲线测定，MTT比色法检测PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制率，比较阳离子脂质体介导转染法与直接转染法的区别。结果 PCNA反义寡核苷酸作用后的肝癌细胞、生长明显受到抑制。应用阳离子脂质体介导转染能显著提高PCNA反义寡核苷酸的抑增殖效应。结论 利用阳离子脂质体介导转染PCNA反义寡核苷酸能显著提高对人肝癌细胞增殖的抑制效应。     

反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞c—myc,增殖细胞核抗原 …

目的 研究反义ｃ－ｍｙｃ、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因片断对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣＳ）增殖的作用。方法 使用正义、反义及错配反义ｃ－ｍｙｃ、ＰＣＮＡ,分别艇于体外培养的ＶＳＭＣＳ,蛋白印迹和免疫组化法测定燕经计算机图像分析,观察其对ｃ－ｍｙｃ、ＰＣＮＡ蛋白表达的影响。结果 １０μｍｏｌ／Ｌ浓度的反义ｃ－ｍｙｃ、ＰＣＮＡ作用于ＶＳＭＣＳ后１￣５ｄ相庆ｃ－ｍｙｃ和ＰＣＡＮ蛋白表达减弱,计算机图像分     

p53重组腺病毒联合增殖细胞核抗原反义寡核苷酸治疗膀胱癌的研究

目的：探讨重组腺病毒p53(Ad-p53)与增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA-ASO）联合应用对膀胱癌的抑瘤效应。方法：用腺病毒将p53{感染强度（MOI）100}导入细胞，PCNA-ASO(1.6μmol/L)在脂质体（Lipofectin）介导下转染细胞，通过噻唑蓝比色法（MTT）、流式细胞术、克隆形成、建立移植瘤模型，探讨其体内外抗瘤活性。结果：Ad-p53与PCNA-ASO联合应用明显抑膀胱癌胞EJ(89.3%)和BIU-87(78.6%)生长，细胞克隆形成能力分别下降74.8％和67.5％，S期比率（EJ细胞11.4％，BIU-87细胞14.6％）明显降低，细胞生长受阻于G1期(EJ细胞62.2％，BIU-87细胞56.8％)；联合应用7d后，肿瘤体积较初始分别下降47.6％和36.4％。结论：Ad-p53联合PCNA-ASO可抑制膀胱癌细胞体内外生长，产生协同效应。     

半乳糖受体介导的增殖细胞核抗原反义核酸对肝癌Bel-7402细胞增殖的靶向抑制作用

目的探讨半乳糖受体介导的增殖细胞核抗原（PCNA）反义核酸（ASODN）对肝癌Bel-7402细胞增殖的靶向抑制作用。方法选择来源于3个不同系统的肿瘤细胞：肝癌Bel-7402细胞、肺腺癌GLC-82细胞、慢性髓系白血病K562细胞，将半乳糖-聚乙烯亚胺（Gal-PEI）与PCNA反义核酸结合形成交联复合物Gal-PEI-ASODN，台盼兰拒染计数法观察不同浓度Gal-PEI-ASODN对这3种细胞增殖的影响；流式细胞仪检测3种细胞对羧基荧光素（FAM）标记的Gal-PEI-ASODN的摄取率及细胞内平均荧光强度；相差／荧光显微镜观察FAM标记的Gal-PEI-ASODN及ASODN进入3种不同细胞的情况。结果浓度从10μmol／L到40μmol／L的ASODN作用于Bel-7402细胞48h后，可抑制其增殖，IC50为29．3μmol／L。浓度从0．05μmol／L到0．25μmol／L的ASODN作用于Bel-7402细胞48h后，均未显著抑制其增殖；相同浓度的Gal-PEI-ASODN作用于3种不同细胞48h后，对GLC-82细胞、K562细胞的增殖未产生显著抑制作用，而Bel-7402细胞的增殖却受到明显抑制。对于Bel-7402细胞，Gal-PEI-ASODN的IC50为0．06μmol／L，与单纯ASODN组相比。增敏倍数为488倍。FAM标记的Gal-PEI-ASODN或ASODN与不同细胞孵育0．5h到2．0h内，Gal-PEI-ASODN-Bel-7402细胞组所有时间点的细胞荧光摄取率、胞内平均荧光强度均显著高于A-SODN-Bel-7402细胞组、Gal-PEI-ASODN-GLC-82细胞组和Gal-PEI-ASODN-K562细胞组。FAM标记的Gal-PEI-ASODN或ASODN与Bel-7402、GLC-82、K562细胞作用1h后．Gal-PEI-ASODN-Bel-7402组的细胞荧光摄取率较高（反义核酸大量分布于细胞的胞浆内），其他各组细胞荧光摄取率较低。结论半乳糖受体介导的PCNA反义核酸能被肝癌Bel-7402细胞高效地摄取。抑制Bel-7402细胞的增殖，增强反义核酸的作用效果，具有靶向性。     

反义增殖细胞核抗原联合p16基因转染抑制膀胱癌细胞生长的研究

目的 探讨膀胱癌联合基因治疗的新策略。方法 反义增殖细胞核抗原(PCNA)联合p16转染膀胱癌细胞，观测共转染1—7d后癌细胞增殖活性、DNA合成速率、细胞周期时相、克隆形成能力、细胞凋亡和PCNA、p16基因表达情况。结果 联合转染后癌细胞PCNA表达减弱，p16表达显著增强，增殖活性抑制15．45％—68．47％(P＜0．01)，DNA合成速率减慢65．77％(P＜0．01)，细胞周期阻滞于G0／G1期，克隆形成率抑制64．49％(P＜0．01)，凋亡率为22．00％(P＜0．01)。结论 反义PCNA与p16共转染具有抑制增殖、诱导凋亡的双重作用，有望成为膀胱癌联合基因治疗的新途径。     

PCNA反义寡核苷酸抑制膀胱癌细胞BIU-87体外增殖的研究

目的检测脂质体介导增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）反义寡核苷酸抑制人膀胱癌细胞ＢＩＵ８７体外增殖活性效果。方法采用细胞计数及ＭＴＴ比色法评价反义寡核苷酸对ＢＩＵ８７细胞体外增殖的影响;应用免疫组化法（ＳＡＢＣ法）检测ＰＣＮＡ蛋白表达情况。结果脂质体介导ＰＣＮＡ反义寡核苷酸组与对照组比较,ＢＩＵ８７细胞增殖活性受到明显抑制（Ｐ＜０．０５）,１２小时后可完全抑制ＰＣＮＡ蛋白表达,２４、３６小时后仍有极显著的抑制作用（Ｐ＜０．０１）;脂质体介导反义寡核苷酸组与单纯反义寡核苷酸组比较,前者抑制作用提高５０倍以上;脂质体介导正义寡核苷酸组、单纯脂质体组与对照组比较均无此抑制作用（Ｐ＞０．０５）。结论脂质体介导ＰＣＮＡ反义寡核苷酸可抑制人膀胱癌细胞ＢＩＵ８７体外增殖活性。应用反义技术封闭ＰＣＮＡ基因、抑制ＰＣＮＡ蛋白表达,为膀胱癌的基因治疗提供了新的思路和探索。     

反义寡核苷酸抑制Survivin基因表达对移植静脉内膜增生的影响

目的研究反义寡脱氧核苷酸（ASODN）抑制Survivin基因表达对移植静脉内膜增生的抑制作用。方法Wistar大鼠60只，建立自体静脉移植模型，术后随机分为：对照组、Survivin ASODN 50、200μg组、正义对照组、Lipofectin＋pluronic等五个组，施加不同的处理因素，在移植后1、2周取材。组织形态学方法比较内膜增生程度，逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测Survivin基因的mRNA表达，Westem blot检测Survivin基因的蛋白产物表达，免疫组织化学方法检测Survivin及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，脱氧核苷酸转移酶末端标记法（TUNEL）检测血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的变化。结果移植后1、2周内膜增生明显，局部转染50μg Survivin ASODN组内膜增生明显受抑制（P〈0．05），200μg组受抑制程度更为明显（P〈0．05）；与对照组相比，Survivln ASODN组Survivin的mRNA及蛋白产物表达显著减少（P〈0．05），PCNA阳性表达同时减少，而TUNEL阳性细胞却明显增加。结论Survivin ASODN可显著抑制移植静脉的内膜增生，其作用可能是通过抑制Survivin基因及其蛋白产物表达，从而抑制VSMC增殖、促进其凋亡而实现的。     

The anti-proliferative effect of proliferating cell nuclear antigen-specific antisense oligonucleotides on human gastric cancer cell lines

The proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a nuclear protein that leads DNA synthesis by the DNA polymerase delta. As the PCNA gene is strongly expressed in invasive gastric cancer cells with high proliferative activity, PCNA is suspected of playing an important role in the proliferation and advancement of gastric cancer. Thus, the effects of antisense oligonucleotides specific for PCNA mRNA were examined in seven gastric cancer cell lines. It was found that treatment with antisense oligonucleotides at concentrations of 10–40 M dose-dependently inhibited the growth of all cell lines; however, random sequence oligonucleotides did not modify the proliferation of any type of cells. These results indicate that PCNA is essential for cell proliferation in gastric cancer cells, and that the growth inhibitory effect results from the inhibition of PCNA gene expression. Therefore, PCNA-specific antisense oligonucleotides may be effective in the treatment of gastric cancer.     

地塞米松对兔髓核细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞表达增殖细胞核抗原(PCNA)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为4组,实验组给予l～100 nmol/L地塞米松进行培养,对照组给与等量磷酸盐缓冲液(PBS),培养5 d后收集细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内PCNA mRNA表达的影响;并提取蛋白用Western blot方法检测PCNA蛋白表达.结果 RT-PCR及Western blot检测结果表明,1～100 nmol/L地塞米松可增加兔髓核细胞内PCNA的表达,当地塞米松浓度为100 nmol/L时效果最显著,分别增加了0.42和1.37倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内PCNA的表达增高.     

增殖细胞核抗原蛋白和mRNA在胆管癌中的表达及其意义

目的 检测胆管癌和癌旁0.5cm胆管组织及手术切缘的正常胆管组织增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白及mRNA的表达,探讨其在胆管癌发生发展中的作用.方法 应用免疫组织化学过氧化物酶标记链霉卵白素法(SP)检测42例胆管癌组织及20例正常组织中PCNA蛋白的表达,同时应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测42例术中所取的新鲜的胆管癌、17例同个体癌旁胆管黏膜和20例正常胆管组织中的PCNA mRNA表达,并与临床资料进行相关分析.结果 正常胆管组织、癌旁组织、胆管癌组织中PCNA mRNA相对表达量分别0.5605±0.0331,0.5692±0.0408,0.6303±0.0773,PCNA mRNA在3组之间表达呈上升趋势(P<0.05),PCNA蛋白表达趋势同其相对应的基因表达趋势一致,即PCNA mRNA在胆管癌组织中高表达(P<0.05).结论 PC-NA基因转录和蛋白可能参与了胆管癌的发生发展过程.     

端粒酶反义基因对紫杉醇诱导原代胃癌细胞凋亡的增敏作用

目的：探讨端粒酶反义寡核苷酸（PS－ASODN）与紫杉醇（TAXOL）联合应用对原代胃癌细胞凋亡作用的影响。方法：常规组织块培养法进行胃癌细胞原代纯化培养．取第3代对数生长期细胞进行实验。各组在培养24h及48h分别加入相同剂量的培养液；终浓度：3μM的PS-ASODN。3μM的N-ASODN，1.0μM的TAXOL。作用24h后再分别在PS-ASODN组及N-ASODN组加入终浓度为1．0μM的TAXOL；分别于培养后24，48，72，96h收集各组细胞。以台盼蓝拒染法计算各组细胞生长抑制率，观察PS-ASODN联合TAXOL对原代胃癌细胞生长的影响；流式细胞学观察细胞凋亡率及细胞周期变化。结果：终浓度为3μM的PS-ASODN作用于原代胃癌细胞24h后加入TAXOU1．0μM．能明显抑制胃癌细胞增殖，同时流式细胞学检测到凋亡峰，细胞受阻于G2／M期．作用48．72，96h的凋亡细胞百分率（34．8％，44．6％及50.6％）明显高于TAXOL组及N-ASODN＋TAXOL组，差异有统计学意义（P〈0．05），其作用呈时间依赖性及序列特异性。结论：以端粒酶RNA模板区为靶点的PS-ASODN可促进TAXOL诱导的胃癌细胞凋亡．对胃癌具有重要治疗价值。     

星形细胞瘤中p53与增殖细胞核抗原的表达

目的 观察星形细胞瘤中ｐ５３与增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达,讨论两者在该肿瘤预后判断上的价值。方法 应用ＳＰ免疫组织化学法对１１０例星形细胞瘤的１３３个病理分级区的ｐ５３和ＰＣＮＡ表达进行研究。结果 在不同病理级别中,ｐ５３与ＰＣＮＡ的阳性表达率无显著相关（ｒ＝０．７４３６,Ｐ〉０．０５）结论 ＰＣＮＡ与ｐ５３表达无直接相关。     

前列腺癌增殖细胞核抗原的免疫组化研究

为了探讨增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）与前列腺癌分化程度的关系及其对预后的影响，采用ＰＣＮＡ单克隆抗体及免疫组织化学链菌素－生物素标记法（ＬＳＡＢ法），对３８例前列腺癌穿刺的石蜡标本中ＰＣＮＡ的表达进行了检测，以１５例前列腺良性增生及１０例正常前列腺组织作为对照，通过观察、统计组织切片中ＰＣＮＡ表达阳性细胞数目，计算出ＰＣＮＡ表达的阳性指数。结果发现，在低分化癌、中分化癌、高分化癌、前列腺良性增生及正常前列腺组织中，其ＰＣＮＡ阳性指数依次为８．０±４．０％、５．２±１．８％、２．４±１．１％、１．１±０．３％、０．８±０．６％，呈逐渐降低趋势。３８例前列腺癌患者经去势手术后随访１年以上者２５例，其中死亡６例，死亡组ＰＣＮＡ表达平均指数为９．０±３．０％，非死亡组为５．０±４．２％。两组比较Ｐ＜０．０５。结果表明：ＰＣＮＡ是判断细胞增殖程度的重要指标，对估计前列腺癌的分化程度及推测预后具有重要参考价值。     

增殖细胞核抗原在血管瘤组织中的表达及临床意义

目的探讨PCNA在血管瘤中的表达及临床意义。方法根据Mulliken分类法将30例血管瘤标本分为3组增殖期(≤1岁)11例，退化期(≤5岁)9例，退化完成期（≤12岁）10例，用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法检测3组不同时期血管瘤标本中PCNA表达。结果PCNA在增殖期阳性细胞表达指数最高为(62.50±9.49)%，退化期次之为(37.56±10.57)%，退化完成期最低(12.20±6.09)%；三者相互间有显著性差异。结论根据以上结果，我们认为PCNA在不同时期血管瘤中表达不同，可作为划分不同时期血管瘤的一种标志物。     

PCNA反义寡核苷酸对人不同恶性肿瘤细胞体外增殖活性的影响

目的：探讨增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(ASO)对人不同恶性肿瘤细胞体外生长的影响。方法：PCNA—ASO在脂质体(1ipofectin)介导下转染膀胱癌EJ细胞、结肠癌HCT—8细胞、肺癌GLC—82细胞及恶性胶质瘤BT—325细胞，运用细胞计数、MTT、流式细胞术、克隆形成及免疫组织化学方法分析其抗瘤活性及机制。结果：PCNA—ASO对上述4种肿瘤细胞的体外生长均有明显抑制作用；不同细胞敏感性差异较大，其中以GLC—82细胞最敏感，HCT—8细胞最不敏感；4种细胞生长均受阻于Gl期。结论：PCNA在恶性肿瘤细胞的增殖中是必需的。PCNA—ASO体外对不同肿瘤细胞具有抗瘤活性。