转染血小板源生长因子和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制移植血管狭窄的实验研究

目的　探讨联合应用血小板源生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)防止移植血管狭窄的作用。方法　将同一只兔的左、右髂外动脉(各1 0cm)对换移植,移植血管用PDGF- AODN和PCNA -AODN转染;移植血管病理切片后测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并分别用原位杂交组织化学和免疫组织化学染色计数PDGF和PCNA阳性细胞数。结果　PDGF- AODN加PCNA- AODN组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和PDGF阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于对照组(P<0 .01),而且亦明显低于单独转染PDGF- AODN组或PCNA -AODN组(P<0. 05 ),PDGF AODN组和PCNA AODN组间差异无显著意义(P>0. 05 )。结论　联合应用PDGF AODN和PCNA- AODN能有效抑制血管平滑肌细胞增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。     

联合转染反义c-myc寡核苷酸和组织纤溶酶原激活物基因预防损伤后动脉内膜增生的研究

目的观察血管局部联合转染c-myc反义寡核苷酸(AODN)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤后动脉内膜增生的影响。方法将同一只兔的左、右髂外动脉(各1·0cm)对换移植,移植血管分别用脂质体、c-myc-AODN和pBudCE4·1/tPA液浸泡,血管吻合口用上述3种液体浸泡过的缝线吻合。实验终点(术后3、7、14、28、56d)分为5个亚组,术后各实验终点取移植血管标本用于病理学检测、发色底物法检测tPA活性实验、3H-TdR掺入实验和免疫组织化学染色检测。结果术后各时间点联合转染组血管的内膜面积、管腔狭窄程度、3H-TdR掺入量和增值细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数均显著低于对照组(P<0·01),而且亦明显低于c-myc-AODN和tPA单独转染组(P(0·05)。结论血管局部联合转染c-myc-AODN和tPA基因能有效抑制内膜增生,防止损伤血管狭窄。     

自体股静脉复合血管外支架修复股动脉缺损的组织学变化

目的探讨复合聚乙丙交酯(PGLA)血管外支架对自体静脉修复动脉缺损的组织学变化的影响。方法以30只犬两侧股动脉各切除5cm,用6cm同侧股静脉移植修复,随机一侧复合PGLA血管外支架为A组;另一侧仅行自体股静脉移植为B组。术后1、2、4、6、8周取材,HE、Masson和弹力染色,光镜观察组织形态变化,进行图像分析,PCNA免疫组化染色观察平滑肌细胞增殖。结果两组移植静脉内膜厚度和截面积都较正常静脉差异有极显著意义(P<0.01),且随时间的推移而递增;两组间内膜厚度、截面积差异有极显著意义(P<0.01)。两组中膜厚度和截面积较正常静脉差异有显著意义(P<0.05),两组管腔截面积与正常静脉相比差异有极显著意义(P<0.01);两组间比较自第4周起差异有极显著意义(P<0.01)。移植静脉PCNA阳性细胞较正常静脉明显增加,术后2周达到高峰,而后逐渐减少,B组PCNA阳性细胞数高于A组,其中在术后前6周两者差异有极显著意义(P<0.01)。实验中A组移植的静脉无明显炎症反应,PGLA血管外支架保持较完整的结构,强度没有明显改变。结论复合应用PGLA血管外支架移植静脉内膜增生和平滑肌增殖减少,管腔狭窄较少。     

脑源性神经生长因子和神经干细胞联合移植对大脑中动脉阻塞大鼠神经功能恢复的作用

目的 将脑源性神经生长因子(BDNF)和神经干细胞(NSCs)单独及联合移植应用于大脑中动脉阻塞(MCAo)模型大鼠,观察BDNF和NSCs移植对大鼠缺血性脑卒中神经功能恢复的作用及BDNF对内源性和外源性NSCs增殖、迁移及分化的影响.方法 体外分离、培养新生大鼠海马NSCs,BrdU标记.实验动物随机分为A组(MCAo组);B组(MCAo+BDNF组);C组(MCAo+NSCs组);D组(MCAo+BDNF+NSCs组),每组16只,移植后进行神经功能损害评分(NSS),用免疫组织化学行BrdU、nestin、BrdU/NSE检测,分析结果.结果 移植后的2、4周神经功能评分分别为:A组5.3±0.5、5.3±0.5;B组4.0±0.8、3.8±0.5;C组3.5±0.6、3.5±0.6;D组2.0 ±0.8、1.8±1.0,D组显著好于其他3组(P<0.05),B组与c组显著好于A组(P<0.05).nes.tin阳性细胞数:A组1.24±1.13,B组2.59±1.44(P<0.05),BrdU阳性细胞数:A组0.52±0.68,B组1.65±1.10(P<0.05).BrdU阳性细胞数:C组6.08±1.52,D组10.26±1.96(P<0.05),BrdU/NSE双阳性细胞数:C组1.74±1.04,D组3.58±1.20(P<0.05).结论 BDNF和NSCs移植单独及联合应用对MCAo大鼠的神经功能恢复均有作用,两者联合具有协同作用.BDNF对内源性NSCs的激活、增殖有促进作用,对外源性NSCs的增殖、迁移及分化有促进作用.     

自体股静脉复合聚乙丙交酯血管外支架修复股动脉缺损的实验研究

目的 报道聚乙丙交酯(PGLA)血管外支架复合自体股静脉移植修复股动脉缺损的实验效果及其作用机制。方法 30只犬两侧股动脉各切除5cm，一侧用6cm自体股静脉修复，为对照组(B组)；另一侧在移植静脉上套1个PGLA血管外支架，为实验组(A组)。术后分别检测两组移植静脉的血流动力学、血管壁组织形态和细胞行为的变化。结果 两组内膜在术后1周即出现增殖，此后内膜厚度随时间递增直至第8周。PCNA阳性细胞百分数术后2周达到最大值，此后逐渐减少。但无论内膜增殖还是细胞增生A组都远小于同时间段B组，差异有非常显著性。结论 复合应用PGLA血管外支架通过有效控制移植静脉的扩张程度减轻移植静脉内膜的过度增生和管腔的狭窄，提高静脉移植修复动脉缺损的效果。     

经外膜缓释雷帕霉素抑制兔同种异体移植血管内膜增生的研究

目的：探讨雷帕霉素抑制血管移植后再狭窄的作用机制.方法：健康雄性新西兰大耳白兔36只,随机选取其中18只切取腹主动脉,经20%甲醛浸泡48 h去除抗原活性.另18只动物随机分为3组,腹主动脉移植去抗原同种异体腹主动脉后给予不同处理.A组：血管移植后不予处理;B组：在移植血管外膜及吻合口周围涂抹20% pluronic F-127多聚凝胶0.5 ml;C组：在相同部位涂抹含0.5 mg雷帕霉素的20% pluronic F-127多聚凝胶0.5 ml.术后4周获取移植血管,HE染色观察移植血管内膜增生情况,计算机图像分析系统测量移植血管内膜厚度,免疫组化SP法检测移植血管α-actin、PCNA和p27kip1的表达.结果：术后4周,A、B组较C组内膜增生明显（P＜0.05）.增生的血管内膜均可见类似于血管平滑肌的α-actin阳性表达.各组移植血管增生的内膜均可见不同程度的PCNA、p27kip1阳性表达.C组α-actin和PCNA的表达较A、B组明显降低（P＜0.05）,而p27kip1的表达较A、B组明显增多（P＜0.05）.结论：对20% pluronic F-127多聚凝胶携带雷帕霉素涂抹移植血管外膜可有效抑制移植血管平滑肌细胞增殖.雷帕霉素抑制移植血管再狭窄的机制与其上调移植血管组织中p27kip1的表达而使细胞增殖周期受抑有关.     

联合转染tPA基因和PCNA反义寡核苷酸抑制兔自体移植动脉再狭窄研究

目的研究血管局部联合转染组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA—ASODN）对自体移植动脉血管再狭窄的防治作用。方法120只新西兰雄性白兔，按数字表法随机均分为4组（对照组、PCNA—ASODN组、tPA组、tPA＋PCNA—ASODN组）。将同一只兔的左、右髂外动脉（各1、0cm长）对换移植，移植血管及吻合口缝线分别用pBudCE4．1／tPA和PCNA-ASODN液浸泡。于术后3、7、14、28及56d取移植血管制片，显微镜下观察内膜增生情况，计算机图像分析测量其内膜面积和移植血管狭窄率，扫描电镜观察移植血管壁血栓形成情况，并分别用RT—PCR和免疫组织化学染色法检测tPA基因的mRNA表达率与PCNA阳性细胞百分率。结果术后3、7、14和28d时，tPA组与tPA＋PCNA-ASODN组的tPA基因mRNA表达率明显高于另2组（P〈0．01），PCNA—ASODN组、tPA组和tPA＋PCNA—ASODN组PCNA阳性细胞百分率均明显低于对照组（P〈0．05，P〈0、01）。tPA＋PCNA—ASODN组和PCNA—ASODN组、tPA组各时相血管壁内膜增生比对照组明显减轻，内膜面积和管腔狭窄程度显著低于对照组（P〈0、05．P〈0．01），且tPA＋PCNA—ASODN组又明显低于另2组（P〈0．05）。扫描电镜观察显示，tPA组和tPA＋PCNA-ASODN组血管壁只见少量血小板附着，未见血栓形成，而对照组血管壁可见大量血小板附着，且有血栓形成。结论血管局部联合转染tPA基因和PCNA—ASODN能有效抑制VSMC增殖和血栓形成，阻止内膜增生，防止移植血管狭窄。     

联合转染P21基因和c-Fos反义核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的 探讨联合转染P^21基因和c—Fos反义核酸对自体移植静脉内膜增殖的影响。方法 选择20只新西兰家兔，随机等分为实验组和对照组，均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术，仅实验组移植静脉段行腺病毒介导的P^21基因溶液浸泡、吻合口周围行c—Fos反义核酸凝胶涂布；术后2周取出移植血管，分别行病理学、免疫组织化学检查。结果 实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、内膜平滑肌细胞数以及增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达细胞数均较对照组明显减少。结论 联合转染P^21基因反义c—Fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生，是一种比较有发展前途的防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

平滑肌22α启动子/增强子靶向调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对移植血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 采用血管平滑肌细胞(SM)特异性SM22α启动子/平滑肌肌球重链蛋白(SMHC)增强子,构建靶向大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的干扰RNA真核表达载体,研究其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及移植血管新生内膜增生的影响.方法 构建大鼠特异性SM22α真核表达载体SM22α-p/e-mTOR-短发卡RNA(shRNA),建立大鼠颈静脉-动脉移植模型,在血管吻合完成后通过Pluronic F-127质粒缓释系统对血管内平滑肌增殖进行局部RNA干扰.实验分5组,每组20只SD大鼠.A组:对照组(25％ Pluronic F-127组);B组:SM22α组(SM22α-p/e-mTOR-shRNA);C组:巨细胞病毒(CMV)组(CMV-p/e-mTOR-shRNA);D组:阴性对照组(空质粒pGenesil-10);E组:阳性对照组;其中,B组和C组统称实验组.根据实验分组的不同,将含有50 μg shRNA质粒,或50 μg渥曼青霉素(wortmannin)凝胶,或单纯200μl 25％ Pluronic F-127凝胶均匀涂抹在移植静脉周围,分别于术后1、3、7、14 d获取移植血管.苏木素-伊红(HE)染色观察新生内膜厚度;免疫组织化学检测平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)、磷酸化-mTOR (Ser2448),原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡,评估mTOR信号通路的变化以及平滑肌细胞的增殖.结果 术后7d各组新生内膜厚度差异有统计学意义(P＜0.05);术后14 d,A组新生内膜较术后1d增厚12.4倍;B、C、D、E组分别增厚9.7、4.8、7.6、2.6倍.术后14d,各实验组和阳性对照组移植静脉α-SM-actin表达阳性面积均明显低于对照组(P＜0.05),PCNA阳性表达面积均低于对照组(P＜0.05),磷酸化-mTOR(Ser2448)阳性表达面积均低于对照组(P＜0.05);实验组、对照组、阴性对照组术后移植静脉凋亡细胞阳性面积比较差异无统计学意义(P＞0.05),阳性对照组凋亡面积明显高于其他组(P＜0.05).结论 SM22α-p/e-mTOR-shRNA可通过抑制血管平滑肌细胞mTOR信号通路而抑制血管平滑肌细胞增殖,预防或延缓移植静脉狭窄.     

血管外雷帕霉素缓释涂层抑制移植静脉再狭窄

目的观察血管周围局部应用雷帕霉素对兔自体移植静脉段内膜过度增殖的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法大耳白兔30只,采用自身对照设计建立模型。任取一侧静脉旁路为干预组,外涂含0.3 mg雷帕霉素的Pluronic凝胶;另一侧为对照组,外涂空凝胶。4周后测旁路静脉内膜厚度、细胞的增殖指数及PCNA、P27~(kipl)免疫组化阳性细胞数。并于术后1、2、4、8周检测血管壁中雷帕霉素的含量。结果干预组旁路静脉内膜厚度(63.72±14.00)μm与对照组(77.76±14.90)μm相比,增生明显减少(P<0.05)。增殖指数对照组(29.30±7.15)明显高于干预组(20.10±9.48)(P<0.05)。在干预组和对照组均有阳性PCNA免疫组化染色表达细胞,正常静脉未见阳性表达,对照组较干预组细胞的阳性表达更强(P<0.05)。P27~(kipl)免疫组化染色干预组见阳性表达细胞,对照组表达阴性(P<0.05)。干预组血管壁术后1～8周均可测到雷帕霉素,含量呈逐步递减趋势。结论血管周围局部应用雷帕霉素具有抑制兔移植静脉内膜过度增殖的作用;这种作用和P27~(kipl)的上调表达有关。     

反义c-myc寡核苷酸对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的 研究反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法 移植静脉外周涂以加有反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸的Ｆ１２７凝胶,于术后１、２周测量静脉内膜平均厚度及观察血管内膜内ｃ－ｍｙｃ蛋白表达情况。结果 手术后１、２周,移植静脉内膜的平均厚度、内膜中ｃ－ｍｙｃ蛋白表达在反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸组均减少,并存在量效关系（Ｐ〈０．０１）。而只用Ｆ１２７胶组及正义寡聚脱氧     

Prevention of cardiac allograft arteriosclerosis using antisense proliferating-cell nuclear antigen oligonucleotide

Cardiac allograft arteriosclerosis limits long-term survival of recipients and is characterized by intimal thickening comprised of proliferative smooth muscle cells. Proliferating-cell nuclear antigen (PCNA) plays a pivotal role in the cell cycle regulatory genes involved in smooth muscle cell proliferation. To test the hypothesis that antisense PCNA oligodeoxynucleotide (ODN) can prevent allograft arterial intimal hyperplasia, we performed single intraluminal delivery of the antisense or sense PCNA ODN or no transfer into murine cardiac allografts. DBA/2 murine hearts were transfected and transplanted into B10.D2 mice; the allografts were harvested 4 weeks later. Severe intimal thickening with enhanced expression of PCNA was observed in untransfected and sense PCNA ODN-treated allografts, whereas antisense PCNA ODN prevented neointimal formation.     

可溶性支架转染c-myc基因反义寡核苷酸对静脉移植物c-myc及PCNA表达的影响

目的采用可溶性支架将原癌基因c—myc反义寡核苷酸转染静脉移植物，观察其对静脉移植物内c—myc蛋白和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白产物表达的影响。方法50只新西兰大耳白兔建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型后随机分成5组，每组10只。对照组：无支架；组1：植入单纯可溶性支架；组2：植入正义c—myc寡核苷酸可溶性支架；组3：植入反义c—myc寡核苷酸可溶性支架；组4：植入不匹配c—myc寡核苷酸可溶性支架。于静脉移植后7d、28d和90d取出静脉移植物，采用免疫组织化学方法检测其c—myc蛋白和PCNA蛋白的表达。结果对照组、组1、组2、组4静脉移植术后7d、28d、90d时静脉移植物内膜和中膜内可见大量c—myc蛋白和PCNA蛋白表达阳性的细胞，与同时间点组3比较差别均有统计学意义（P〈0．01）。28d、90d时5组静脉移植物内c—myc蛋白的表达与同组7d时比较明显增强（P〈0．01）。结论可溶性支架转染c—myc反义寡核苷酸可显著抑制静脉移植物内c—myc蛋白和PCNA蛋白的表达。     

手术缝线携载反义基因预防血管吻合口内膜增生的实验研究

目的：探讨预防血管吻合口内膜增生的新方法。了解手术缝线携载反义基因对吻合口内膜增生的影响。方法：用分别浸泡过反义，正义及错配c-myc基因溶液的保护薇乔缝线行兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉的血管吻合。实验动物24只随机分为对照组，反义组，正义组和错配组，每组6只，4周后血管造影观察吻合口通畅情况，同时取材制片显微镜下观察其内膜增生情况，计算机图像分析测量其内膜，中膜厚度及两者比值；内膜，中膜面积及两者比值。结果：所有吻合口通畅，未见闭塞，扩张或动脉瘤，反义组的内膜厚度，内膜／中膜厚度比值及内膜面积，内膜／中膜面积比值较其他组均低（P＜0．05），其他3组间比较差异均无显著意义（P＞0．05）；各组间的中膜厚度及中膜面积间差异无显著意义（P＞0．05），结论：用浸泡过反义 c-myc溶液的保护薇乔缝线进行血管吻合，能有效地抑制血管吻合口内膜增生。     

bcl-2基因表达在人膀胱癌多药耐药现象中的意义

目的探讨ｂｃｌ２基因在人膀胱癌多药耐药中的作用。方法应用原位ＤＮＡ末端转移酶标记法（ＴＵＮＥＬ）、免疫细胞化学及逆转录多聚酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）技术,分别对阿霉素诱导的人膀胱癌耐药细胞株（ＢＩＵ８７／ＡＤＭ）及敏感细胞株（ＢＩＵ８７）的细胞凋亡及其ｂｃｌ２基因表达进行研究。结果（１）在相同条件下,与敏感细胞株相比,耐药细胞株中细胞凋亡明显受到抑制;（２）耐药细胞株中ｂｃｌ２基因表达明显强于敏感细胞株。结论凋亡抑制基因ｂｃｌ２在人膀胱癌多药耐药细胞中的高表达,是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因,对于人膀胱癌多药耐药的产生具有重要意义。     

移植血管平滑肌细胞PCNA表达及药物影响的研究

目的　探讨 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 等药物对兔静脉移植模型早期增殖细胞核抗原（ Ｐ Ｃ Ｎ Ａ） 表达的影响。　方法　兔颈静脉移植于颈动脉后应用 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 、 Ｌ Ｍ Ｗ Ｈ 、 Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ 和 Ｖｅｒａｐａ ｍｉｌ 治疗, 并于不同时间采用免疫组化方法观察血管平滑肌 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达的变化。　结果　术后３ 、７ 、１４ 天均有 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 的表达;３ 天时 Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ 、 Ｌ Ｍ Ｗ Ｈ 两组 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 的表达与对照组差异不显著;相反 Ｖｅｒａｐａ ｍｉｌ 及 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ两组的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 指数均低于对照及其他两组;术后７ 、１４ 天动、静脉 Ｖ Ｓ Ｍ Ｃ 中的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 各组的表达均与术后３ 天相同只是强度略有下降;移植静脉 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 指数均略低于相应动脉。　结论　 Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ 、 Ｌ Ｍ Ｗ Ｈ对血管移植后动、静脉 Ｖ Ｓ Ｍ Ｃ 内的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达无影响, Ｖｅｒａｐａ ｍｉｌ 及 Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ 对移植静脉及相应动脉平滑肌细胞的 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ 表达有抑制作用     

脂质体介导的VEGF-C反义寡核苷酸对肺癌微淋巴管及微血管生成的影响

目的 观察脂质体介导的血管内皮生长因子C(VEGF-C)反义寡核苷酸对肺癌裸鼠皮下原位种植瘤模型微淋巴管及微血管生成的影响.方法 建立BALB/C小鼠皮下肺癌模型30只,随机分为磷酸盐缓冲液对照组、正义寡核苷酸对照组(SODN组)和反义寡核苷酸干预组(AODN组).接种人肺腺癌细胞株A549后24 h内,用PBS、SODN及AODN分别行皮下注射,观察小鼠肿瘤的生长情况.建模4周后,处死动物,留取瘤体标本,采用RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学方法检测VEGF-C反义寡核苷酸对种植瘤中VEGF-C表达水平和微淋巴管及微血管生成的影响.结果 种植瘤内VEGF-C mRNA和蛋白表达量AODN组低于对照组 (P<0.05),种植瘤内微淋巴管密度AODN组亦较对照组减少(P<0.01).种植瘤内微血管密度各组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 脂质体介导的VEGF-C反义寡核苷酸可以显著降低肺癌裸鼠皮下原位种植瘤模型VEGF-C的表达水平,并对其微淋巴管生成具有较强的抑制作用.