单链抗体融合重构型人caspase-3蛋白的靶向抑瘤作用研究

目的：探讨分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白对ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。 方法：将重构型人caspase3基因亚克隆入pCMVe23scFvPEⅡPEⅢ相应位点，构建表达分泌型的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白基因的真核表达载体pCMVe23scFvPEⅡrevcasp3，转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat，筛选并建系，ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。用含有该融合蛋白的培养介质培养人宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞SKBr3以及人卵巢癌细胞SKOV3等研究该蛋白对细胞生长的抑制作用；将转染建系的Jurkat细胞尾静脉注射SKBr3荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用，间接免疫荧光检测重构型人caspase3蛋白在瘤体的靶向分布。结果：融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤ErbB2抗原阳性的SKBr3和SKOV3细胞而对ErbB2抗原阴性的Hela细胞生长无明显影响，尾静脉注射该细胞可靶向抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长。结论：分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白靶向诱导ErbB2抗原阳性肿瘤细胞死亡。     

Notch1基因转染对人肝癌细胞Hep3B生长的影响及作用机制的研究

目的：研究逆转录病毒介导的Notch1（ICN）基因转染对人肝癌细胞生长的影响，并对其作用机制进行了探讨。方法： 采用磷酸钙沉淀法质粒共转染293T细胞，制备出表达组成性活化形式的Notch1（ICN）和/或绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体MSCVICN/GFP及对照逆转录病毒载体MSCVGFP，并检测病毒滴度。用逆转录病毒感染人肝癌细胞Hep3B，观察病毒的感染效率，MTT比色法测定瞬时表达Notch1（ICN）对Hep3B人肝癌细胞生长的影响，利用流式细胞仪分析细胞周期分布的变化，Western blot方法检测细胞周期调控蛋白的变化。结果：通过质粒共转染可获得具有较高滴度的重组逆转录病毒。MTT比色法显示瞬时表达Notch1（ICN）基因可以抑制人肝癌细胞Hep3B的生长，瞬时表达Notch1（ICN）基因可使Hep3B细胞周期停滞在G0/G1期并上调细胞周期调控蛋白P53的表达水平。结论：Notch1基因可通过影响细胞周期分布和P53蛋白的表达水平而抑制人肝癌细胞生长。     

HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因对喉癌细胞Hep-2杀伤作用的体外研究

目的:观察自杀基因HSV-tk与不同细胞因子基因(IL-2、TNF-α)构建的不同融合基因表达产物对喉癌细胞系的体外杀伤作用。方法:分别构建不同融合基因逆转录表达载体PL(TI)SN,PL(N)SN,PL(TK)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将各重组病毒分别感染人喉癌细胞系Hep-2,G418筛选出抗性克隆,分别命名为Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK,以RT-PCR及Southern blot检测各融合基因的整合及表达。通过观察各基因修饰细胞生长状况及GCV杀伤实验鉴定融合基因的表达及杀伤效应。结果:RT-PCR及South-ern blot分析证明各重组外源基因在人喉癌细胞系Hep-2中均有整合及表达。Hep/TI,HeP/TK生长速度无明显差别,Hep/TT细胞增殖速度受到抑制。在GCV杀伤试验中,Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK均显示出对GCV的高敏感性,其中GCV对Hep/TT的杀伤作用最为明显,各基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合,均显示出明显旁观者效应。结论:自杀基因与细胞因子基因共表达体系对喉癌细胞系Hep-2体外杀伤具有协同作用,并且有明显的旁观者效应,可望成为肿瘤基因治疗的新途径。     

Survivin-pPRIME-IGF1R-miR30慢病毒载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制

目的：探讨survivin启动子调控的重组慢病毒survivinpPRIMEIGF1RmiR30载体(简写为surIGF1RmiR30)对肝癌Hep3B细胞IGF1R表达和细胞生长的影响。方法：PCR扩增survivin启动子,构建surpPRIME;将针对〖STBX〗IGF1R〖STBZ〗基因的干扰序列与surpPRIME载体连接,构建surIGF1RmiR30慢病毒载体。将surIGF1RmiR30、psPAX2和pMD2G质粒共转染293T细胞,扩增慢病毒,检测病毒滴度。以surIGF1RmiR30感染人肝癌Hep3B细胞和胎肝L02细胞,RTPCR、Western blotting检测Hep3B细胞IGF1R的表达,CCK8法检测Hep3B细胞的生长。结果：成功构建survivin启动子调控的慢病毒载体surIGF1RmiR30,滴度为4.58×109 PFU/ml。SurIGF1R miR30感染后,Hep3B细胞中特异表达荧光蛋白,L02细胞中基本没有表达。SurIGF1RmiR30感染Hep3B细胞可阻断IGF1R mRNA和IGF1R蛋白的表达。SurIGF1RmiR30感染抑制肝癌细胞的生长,第7天时的抑制率达60％(P<0.05)。结论：成功构建的重组慢病毒载体surIGF1RmiR30 可有效地降低肝癌细胞中IGF1R的表达,抑制肝癌细胞的增殖。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究

目的：构建高靶向性基因转移及表达系统，并研究其介导HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法： 通过重组技术分别构建antiTfR ScFvGAL4融合蛋白表达载体ScFvGAL4pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列（GAL4rec）的HSVtk真核表达载体pEBAF/tkGAL4rec。IPTG诱导后，利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tkGAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2，SMMC7721及A549。潮霉素筛选后，MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果：双酶切鉴定、SDSPAGE电泳及测序分别证明antiTfR ScFvGAL4融合蛋白及重组pEBAF/tkGAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中，高分泌AFP(845 ng/ml) 的HepG2/tk细胞对GCV很敏感，且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关；而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感；不分泌AFP 的A549/tk细胞则不敏感。结论：双靶向组织特异性HSVtk/GCV抗瘤系统构建成功，并显示出很好的靶向性。     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因对肝癌细胞SK-Hep-1黏附和侵袭的影响

摘 要 目的: 肝细胞癌中高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因(glypican3,GPC3)，而在非肿瘤肝组织、肝细胞腺瘤、胆管癌、肝内胆管细胞癌、胆囊癌等细胞中低表达甚至不表达；本研究利用携带GPC3重组真核表达载体，探讨GPC3基因对SKHep1肝癌细胞增殖、黏附和侵袭能力的影响。方法：将pEGFP-N2-GPC3通过脂质体方法转染人肝癌细胞SKHep1。RT-PCR检测GPC3SKHep1细胞中GPC3 mRNA的表达；MTT法检测SK-Hep-1细胞的增殖并计算黏附率；Transwell小室实验检测SK-Hep-1肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。结果：pEGFPN2GPC3成功转染SKHep1细胞，转染后GPC3-Hep-1细胞明显表达GPC3mRNA。GPC3转染能显著抑制肝癌细胞SK-Hep-1的增殖（P<0.01）；GPC3转染细胞的黏附能力较对照细胞显著下降[（10.21±0.62）% vs (15.51±095)%,P<0.01];GPC3转染细胞的迁徙和侵袭能力较对照细胞明显增强[（131.7±7.44）vs（69.6±5.25），P<0.01;(220±12.8) vs （130±8.2），P< 0.01]。结论：GPC3基因显著抑制肝癌细胞的增殖和黏附能力，但显著增强后者的迁移和侵袭能力。     

TGF-α与绿脓杆菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及对肿瘤细胞的杀伤作用

目的： 表达并纯化转化生长因子α与绿脓杆菌外毒素融合蛋白（TGFαPE40）,探讨其对EGF受体（EGFR）阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法：用pET28a表达载体构建表达TGFαPE40蛋白的重组体pV28,IPTG诱导其表达后,提取包涵体蛋白并用Ni柱纯化,MTT法观察复性融合蛋白对肿瘤细胞A431和SKOV3的杀伤效用。结果：成功构建基因重组质粒pV28,纯化后的包涵体蛋白中TGFαPE40蛋白纯度达98％以上,这种活性毒素蛋白对EGFR高表达的A431癌细胞抑制率为50％（IC50）时所需蛋白浓度为(0.86±0.07)μg/ml,低于EGFR低表达的SKOV3癌细胞的IC50 (6.37±2.18μg/ml),差异显著（P<0.05）。结论： 融合蛋白 TGFαPE40 对肿瘤细胞的毒性与肿瘤细胞表面表达的EGFR数量成正相关,可选择性杀伤肿瘤细胞。     

PD-L1-Ig融合蛋白的酵母表达及其对T细胞的抑制作用

目的：利用毕赤酵母表达系统表达PDL1Ig融合蛋白,检测该融合蛋白的生物学活性。方法：化学合成hPDL1IgG4融合基因,构建携带该基因的酵母表达载体,转化GS115酵母菌株后分泌表达融合蛋白,亲和层析和离子交换层析法纯化,SDSPAGE和Western blotting分析鉴定。ELISA法检测融合蛋白与受体PD1的结合能力,混合淋巴细胞反应检测融合蛋白对T细胞功能的抑制能力,51Cr稀释法检测其对CTL杀伤人结肠癌SW480细胞效应的抑制作用。结果：成功构建酵母表达载体pPIC9KPDL1IgG4,转化菌株分泌表达PDL1IgG4融合蛋白,相对分子质量为55 000,含量为120 μg/ml。发酵菌株,纯化制备融合蛋白。融合蛋白与受体PD1具有良好的结合能力,能够显著抑制T细胞增殖、活化（P<0.01）,并抑制CTL对结肠癌细胞的杀伤（P<0.01）。结论：成功制备了酵母表达PDL1IgG4融合蛋白,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为深入研究其在肿瘤免疫应答中的调控效应奠定了良好基础。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接，构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv／tBid载体，转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，AnnexinV染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv／tBid。重组质粒转染E10细胞后，间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达；细胞色素C在细胞质中出现；细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。AnnexinV染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16．1％VS4．5％）；TUNEL染色显示，E10细胞出现典型的凋亡特征。结论重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达，并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的：构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法：通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果：流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16.1% vs 4.5%）;TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论：重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

mGM-CSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定

目的 构建pc—mGM—CSF重组质粒载体，为mGM—CSF基因治疗肿瘤的研究奠定基础。方法 采用RT—PCR方法从小鼠脾脏中获得目的基因mGM—CSF，克隆于pcDNA3.1／Myc-His(-)(A)质粒上，成为pc-mGM-CSF，用PCR、酶切进行鉴定，然后用脂质体转染小鼠骨髓瘤细胞SP2／0，用G418筛选后通过RT—PCR和SDS—PAGE鉴定，将转染SP2／0上清加入NFS-60细胞，检测蛋白活性。结果 重组质粒中含有mGM—CSF基因，在SP2／0中有表达，且表达产物能分泌到肿瘤细胞外，分泌到细胞外的产物用mGM—CSF依赖株NFS-60细胞检测证明具有生物学活性。结论 成功构建含mGM—CSF真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

血管生长抑制因子angiostatin在昆虫细胞中的表达及活性研究

背景与目的:抑制新生血管的形成,有助于抑制肿瘤的生长,减少和预防肿瘤转移的发生。血管抑素(angiostatin)是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂,对血管内皮细胞增殖有较强的抑制作用。为获得具有高活性的Angiostatin表达,本研究通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin,分析其在昆虫细胞中表达和生物活性。方法:用带有angiostatin的杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B和病毒DNA共同转染Sf9细胞,构建重组病毒,蚀斑实验筛选,PCR分析确定后扩增产生大量高滴度的病毒贮存液;用SDS-PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间后分泌的重组蛋白做时间表达分析;用ProBondTM纯化系统对表达的重组angiostatin进行纯化,分光光度计确定蛋白含量,SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度;采用MTT法测定重组蛋白angiostatin对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用而后通过鸡胚尿囊膜实验进一步证实其抗血管形成作用。结果:成功构建了滴度为2×108pfu/ml的angiostatin重组杆状病毒,并在昆虫细胞Sf9中高效表达了分子量为53ku的angiostatin重组蛋白,纯度约为90%,重组angiostatin蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长(IC50为2.3μg/ml),而且显著抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。结论:此系统可制备高滴度angiostatin重组杆状病毒贮存液,并在Sf9昆虫细胞中高效表达该重组蛋白,经在体和离体细胞学实验验证其对内皮细胞的增殖具有抑制作用。     

TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用

目的构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用。方法RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。采用adMax adenovjrus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺痛LA795细胞系,绘制细胞生长曲线。采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(FLISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTFS基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010pfu/ml。Western blot结果表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显菩减低,而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

多靶向VEGF-EGFR的Fc融合蛋白EVP1的构建及其结合特性【创新点评：一种富有潜力的多靶向抗体类肿瘤治疗药物】

目的:构建能同时靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的Fc融合蛋白EVP1,并分析其多靶向结合功能,为后续的抗肿瘤研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增Herin基因和Flt-1基因Ig样第二结构域(Flt-1D2)编码序列,全序列合成带有点突变的人IgG1的Fc段编码序列,利用重组PCR方法将Herin、Flt-1D2和Fc基因依次连接,构成Herin-Flt-1D2-Fc基因(命名为EVP1基因)。再将EVP1编码基因插入质粒pDC659,构建携带EVP1基因的腺病毒穿梭质粒pDC659-EVP1。将质粒pDC659-EVP1与腺病毒骨架载体pPE3-F35共转染至293细胞,包装获得表达EVP1融合蛋白的非增殖型腺病毒Ad5/35-EVP1,经PCR鉴定,扩增、纯化病毒,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用MOI=11的腺病毒Ad5/35-EVP1感染293细胞,4 d后收集细胞培养上清液。采用硫酸铵盐析法和Protein G亲和层析对融合蛋白EVP1进行纯化。Western blotting检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的含量。采用间接免疫荧光实验和Octet Red 96生物分子相互作用分析仪对融合蛋白EVP1的靶向结合特性进行定性和定量检测。结果:成功包装出腺病毒Ad5/35-EVP1,滴度为5.4×109PFU/ml。腺病毒Ad5/35-EVP1-293细胞系统能有效表达融合蛋白EVP1;MOI=11时,融合蛋白EVP1的表达量为(1 613.94±24.65)ng/ml。蛋白EVP1与高表达EGFR的A431细胞和高表达HER2的人卵巢癌SK-OV-3细胞有良好的结合能力,与抗原EGFR、HER2、VEGF结合的亲和力常数Kd分别为4.55、18.70和0.63 nmol/L。结论:成功制备多靶向融合蛋白EVP1,它能高效结合VEGF、EGFR受体家族成员,具有良好的抗肿瘤临床应用价值。     

3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及其siRNA结合活性与穿膜功能的鉴定

目的： 构建3TAT-DRBD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其siRNA结合活性和穿膜功能进行初步验证。 方法： 采用基因合成技术获取靶基因 3TAT-DRBD, 并克隆到原核表达载体pET-44b中;用IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,凝血酶切除标签,Western blotting鉴定。凝胶迁移阻滞实验验证DRBD和siRNA的结合能力,激光共聚焦显微镜观察TAT的穿膜能力。 结果： 限制性酶切和基因测序表明重组质粒pET-44b-3TAT-DRBD构建成功;IPTG诱导后3TAT-DRBD融合蛋白（含Nus标签和S标签）在大肠杆菌中高效表达,可溶性蛋白占菌体总蛋白约80%;成功切除融合标签并纯化了无标签的融合蛋白,经Western blotting鉴定其相对分子质量约为17 000;凝胶迁移阻滞实验证明,融合蛋白3TAT-DRBD 能有效结合靶向survivin基因的siRNA（survivin-siRNA）;激光共聚焦显微镜下可见,在TAT的介导下survivin-siRNA穿透胞膜进入前列腺癌PC3细胞的效率明显增高。 结论： 成功表达并纯化了具有siRNA结合活性与穿膜功能的3TAT-DRBD融合蛋白,为进一步3TAT-DRBD的功能研究及临床应用奠定了基础。     

RBPJ与KyoT2真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有myc-RBPJ(R218H)(recombination binding protein-J)、myc-KyoT2融合基因片段的质粒,并在真核细胞中表达、鉴定。方法:由本科室保存质粒酶切分别得到RBPJ(R218H)和myc-KyoT2基因片段,将RBPJ(R218H)基因插入载体PCMV-myc中,获得融合基因myc-RBP-J(R218H),将myc-RBPJ(R218H)和myc-KyoT2插入真核表达载体pIRES2-EGFP,构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP、myc-KyoT2-IRES2-EGFP。以其瞬时转染HEK293细胞,应用免疫印迹与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。结果:正确获得myc-RBPJ(R218H)融合基因,DNA序列分析表明所构建的含myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的质粒与设计相同,myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合蛋白与绿色荧光蛋白均正确表达。结论:成功构建了含有myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究慢性粒细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

Design,expression, purification,and characterization,in vitro and in vivo,of an antimelanoma single-chain Fv antibody fused to the toxin gelonin

We constructed a single-chain anti-gp240 antibody (designated MEL sFv) and fused this to the recombinant toxin gelonin (rGel). MEL sFv-rGel was produced in bacterial expression plasmid (pET-32), and the protein composition was confirmed by both DNA sequencing and Western analysis. Inhibition of cell-free protein synthesis by the fusion construct demonstrated an IC(50) of 100 pM, comparable with that for native gelonin (104 pM). The MEL sFv-rGel fusion toxin bound to antigen-positive but not antigen-negative cells as assessed by ELISA. Internalization into A-375 target cells was demonstrable by 1 h after exposure. Against A-375 cells, MEL sFv-rGel demonstrated an IC(50) of approximately 8 nM, which was 250-fold lower than that for free rGel (2000 nM). The cytotoxic effects of the construct did not involve apoptosis because terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling assays of treated cells were negative. (125)I-labeled MEL sFv-rGel demonstrated biphasic clearance of the construct from plasma (t(1/2) alpha and t(1/2) beta were 0.46 and 7.2 h, respectively). At 72 h after administration, xenograft studies showed that the tissue:blood ratio was highest for tumor followed by spleen, kidney, and liver. Groups of tumor-bearing nude mice were treated with fusion toxin at either 2 or 20 mg/kg. Compared with saline-treated controls, for which mean tumor burden increased 6-fold, the groups treated with the high and low doses of fusion construct showed no increase or only a 2-fold increase, respectively. These studies suggest that this recombinant fusion construct has potent cytotoxic activity both in vitro and in vivo and is an excellent candidate for clinical development.     

重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达

目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。