应用双重PCR技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 应用敏感、快速的双重聚合酶链反应（PCR）技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。方法 临床分离得葡萄球菌,挑取单个菌落,用碱煮沸法制备DNA模板,进行双重PCR反应,以扩增femA基因和mecA基因。结果 100株葡萄球菌中,38株凝固酶阳性的葡萄球菌,其femA基因均为阳性,而mecA基因阳性者为30株,占78．9％（30,38）,mecA基因阴性8株,占21．1％（8／38）。62株凝固酶阴性的葡萄球菌femA基因均为阴性,mecA基因阳性48株,占77．4％（48／62）,mecA基因阴性14株,占22．6％（14／62）。结论 应用双重PCR技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是一种敏感敏感、快速、特异的实验诊断方法,可防止临界MRSA漏检为MSSA。     

多重PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的建立一种直接、快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的多重PCR方法。方法设计3对引物,在同一反应管中同时扩增检测mecA、femA和IS431基因,扩增产物经凝胶成像系统分析。结果9株MRSA菌株mecA、fe-mA和IS431均阳性,5株凝固酶阴性的耐甲氧西林的葡萄球菌mecA和IS431阳性,7株甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌femA和IS431阳性,11株甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌IS431阳性,而大肠杆菌、肺炎链球菌等非葡萄球菌mecA、femA和IS431均阴性;当MRSA茵浓度达102CFU／ml时就可检出。结论通过同时扩增mecA、femA和IS431基因的多重PCR技术,能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。     

头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌的临床应用

目的以PCR检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）mecA基因为金标准,评价头孢西丁纸片扩散法检测MRS的临床应用。方法收集各种细菌感染性标本分离到的葡萄球菌,细菌的鉴定采用法国梅里埃全自动微生物分析系Vitek-60,分别采用PCR扩增mecA法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和抗青霉素结合蛋白2a（抗PBP2a）胶乳凝集法检测葡萄球菌中MRS。结果经PCR检测mecA证实西安地区SA中MRSA的发生率为69．2％（54／78）,CNS中MRCNS的发生率为67．7％（65／96）;其余三种方法检测SA中的MRSA发生率分别为67．9％,57．7％,66．7％,CNS中MRCNS的发生率分别为64．6％,58．3％,63．5％。头孢西丁纸片扩散法与mecA基因法结果相比较检测MRSA,其灵敏度和特异度分别为98．1％和100．0％,两者符合率为98．7％;MRSCoN的灵敏度和特异度分别为95．4％扣100．0％,两者符合率为96．9％。结论头孢西丁纸片扩散法检测MRSA的敏感度和特异度高于苯唑西林纸片扩散法,与PCR检测mecA法具有较好的一致性,可作为临床实验室常规检测MRS的常规方法。     

聚合酶链反应诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的临床价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)在细菌和真菌性中枢神经系统感染快速诊断中的临床价值。方法收集137例中枢神经系统感染患者留存的脑脊液进行DNA提取,采用细菌和真菌通用引物扩增病原体DNA并进行序列测定,对比同期脑脊液培养方法与PCR方法的检测结果。结果 137份脑脊液标本中PCR检测到细菌50株,真菌6株,脑脊液培养检测到细菌38株,真菌5株;PCR检测法灵敏度为40.9%,特异度为100%,阳性预测值为100%,阴性预测值为38.2%,诊断效率为56.7%;传统培养法则分别为31.4%、100%、100%、34.7%、44.4%。PCR的灵敏度、阴性预测值和诊断效率均明显优于传统培养方法,特异度和阳性预测值与培养法相当,两方法鉴定菌种的符合率为97.7%。结论通用引物PCR扩增法具有快速、特异、灵敏、准确等特点,对细菌和真菌性中枢神经系统感染的病原学快速诊断具有重要的应用价值。     

头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌

目的以PCR法检测葡萄球菌的mecA基因(mecA基因法)为标准，评价头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和苯唑西林盐平板法检测葡萄球菌中耐甲氧西林葡萄球菌的灵敏度和特异性。方法PCR扩增葡萄球菌的特异性mecA基因片段，头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林纸片扩散法和苯唑西林盐平板法检测葡萄球菌中耐甲氧西林葡萄球菌，药敏试验方法按标准K—B(Kirby-Bauer)法进行。结果在190株临床分离的葡萄球菌中金黄色葡萄球菌(金葡菌)138株，表皮葡萄球菌30株，溶血葡萄球菌22株，经。PCR法检测mecA基因，金葡菌中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和凝固酶阴性葡萄球菌中耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的发生率分别为81.2％(112／138)、96．1％(50／52)。头孢西丁纸片扩散法检测金葡菌中MRSA和CNS中MRCNS的发生率分别为81.2％(112／138)、94．2％(49／52)，与mecA基因法结果相比较，头孢西丁纸片扩散法检测葡萄球菌中MRS的灵敏度和特异度分别为99．4％(161／162)、100．0％(28／28)，两者符合率为99．5％(189／190)。2种方法所获得的结果经统计学处理，两者差异无显著性。结论头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌具有很高的灵敏度和特异度，适合在临床微生物实验室中进行推广。     

多重PCR同时检测病原菌及其耐药基因

目的建立一种多重PCR方法,在同一扩增体系内同时检测病原菌及其β-内酰胺类耐药基因,探讨采用多重PCR同时鉴定病原菌及其耐药基因的可行性。方法根据细菌基因序列和对β-内酰胺类抗生素耐药特点,设计一对细菌鉴定通用引物和三对β-内酰胺类耐药基因引物,并在同一扩增体系内行PCR扩增。结果 MRSA和大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的产酶标准菌株的bla mecA、blaTEM、blaSHV和16S-23S rRNA基因间隔区（ISR）多重扩增均为阳性,对本实验室内保存的50株多重耐药的葡萄球菌（包括40株表型筛查为MRS菌株及10株非MRS菌株）及30株ESBLs阳性的大肠埃希菌及30株肺炎克雷伯菌的多重PCR结果显示：MRS阳性菌株均同时扩增出了葡萄球菌特有的多态性及blamecA指纹图谱,而多重耐药的非MRS菌株也都扩增出了blamecA,ESBLs表型阳性的大肠埃希菌多以blaTEM为主,而肺炎克雷伯菌多以blaSHV为主。结论多重PCR与传统的培养及药敏试验相比敏感、特异、迅速,对于解决难培养或不能培养的微生物的鉴定和药敏试验,是一种很有前景的方法。     

院内传播耐甲氧西林葡萄球菌的 DNA 指纹图谱分析

目的对医院内传播的12株耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）作DNA指纹图谱分析,寻找传播途径,控制院内感染。方法纸片琼脂扩散（K—B）法检测细菌耐药性,聚合酶链反应（PCR）法检测mecA基因携带情况,采用ERIC—PCR作DNA指纹图谱分析。结果12株分离菌耐药表型和基因型相同,均对万古霉素和替考拉宁敏感,对其他13种抗菌药物耐药,mecA基因全部阳性。12株不同来源菌株的DNA同源性达100％。患者家属及医护人员的手和病房物体表面被污染情况严重。结论MRS对抗菌药物呈多重耐药性。患者家属及医护人员手部卫生意识薄弱,这是引起MRS医院内传播的主要原因。应加强监控．防止MRS的医院内感染。     

应用DNA探针检测甲氧西林耐药葡萄球菌

目的建立一种快速检测葡萄球菌和甲氧西林耐药葡萄球菌的斑点杂交技术。方法设计金黄色葡萄球菌nuc基因、甲氧西林耐药mecA基因、葡萄球菌tuf基因的特异引物,用聚合酶链反应合成其特异DNA探针,并用生物素标记,分别与固定在硝酸纤维素膜上的标准菌株和临床分离株模板DNA杂交,观察其敏感性和特异性。结果3对引物分别扩增出270bp、310bp、370bp3种DNA探针,均具有高度特异性。50株金黄色葡萄球菌tuf、nuc基因均为阳性：mecA基因阳性者22株。30株表皮葡萄球菌tuf基因均为阳性,nuc基因均为阴性,mecA基因阳性者9株。而其他非葡萄球菌与3种DNA探针杂交结果均为阴性。该方法可检测出1 ng细菌DNA。结论斑点杂交技术检测耐甲氧西林葡萄球菌快速、有效,具有较高的应用价值。     

头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌的临床应用评价

目的用PCR法检测葡萄球菌的mecA基因为参比方法,评价头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的临床应用价值。方法临床分离的163株葡萄球菌,分别用头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法、PCR法检测mecA基因,以PCR扩增法检测mecA基因作为参比方法进行比较。结果163株临床分离的葡萄球菌经PCR法检测mecA基因,阳性率为81.0%,其中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的发生率分别为74.1%和83.8%。头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法用于检测MRSA与PCR法检测mecA基因有很好的一致性,其敏感性和特异性均为100.0%,而对于凝固酶阴性葡萄球菌,头孢西丁纸片扩散法比苯唑西林纸片扩散法检测MRS的敏感性和特异性高,敏感性分别为100.0%和94.3%,特异性分别为96.0%和88.0%。结论头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌具有很高的灵敏度,但对于mecA基因阴性的凝固酶阴性葡萄球菌,用头孢西丁纸片法检测,约有5%菌株要误报为MRCNS。由于头孢西丁纸片扩散法操作简单,较苯唑西林纸片扩散法检出MRS的敏感度和特异性高,结果与PCR法检测mecA基因有很好的相关性,不需特殊仪器设备,可在临床微生物实验室常规开展。     

头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林葡萄球菌

目的:评价头孢西丁纸片法筛选耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的方法.方法:采用2004年NCCLS推荐的30μg/片头孢西丁纸片法检测MRS,以PCR方法检测mecA基因为"金标准".结果:在60株临床分离的葡萄球菌中,金黄色葡萄球菌36株,凝固酶阴性葡萄球菌24株.用PCR方法检测mecA基因阳性43株(金黄色葡萄球菌25株,凝固酶阴性葡萄球菌18株),阴性17株(金黄色葡萄球菌11株,凝固酶阴性葡萄球菌6株);用头孢西丁纸片法筛查MRS耐药(+)41株(金黄色葡萄球菌23株,凝固酶阴性葡萄球菌18株),敏感(-)19株(金黄色葡萄球菌13株,凝固酶阴性葡萄球菌6株).以PCR检测mecA基因法为"金标准",头孢西丁纸片法的敏感度和特异度分别为95.3%(41/43)、100%(17/17).准确度为96.7%(58/60).结论:头孢西丁纸片法筛查MRS与mecA基因检测法具有很好的一致性,该方法适合在临床微生物实验室中推广使用.     

多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌

目的应用一种敏感快速的多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）,检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）和凝固酶阴性葡萄球菌（ＭＲＣＮＳ）。方法临床分离的北京地区金黄色葡萄球菌１２３株,ＭＲＣＮＳ１２２株,用溶壁素和蛋白酶Ｋ制备模板ＤＮＡ,设计葡萄球菌甲氧西林耐药的决定基因,金黄色葡萄球菌独有的一个辅助基因和细菌中均有的１６ＳｒＲＮＡ基因引物,通过多重ＰＣＲ技术对标本进行扩增。结果１２３株金黄色葡萄球菌的ｆｅｍＡ基因１００％（１２３／１２３）阳性,ｍｅｃＡ基因阳性的占１８．７％（２３／１２３）,１２２株ＭＲＣＮＳ的ｆｅｍＡ１００％（１２２／１２２）阴性,ｍｅｃＡ阳性的占２４．６％（３０／１２２）。１６ＳｒＲＮＡ基因片断在多重ＰＣＲ中作为内部参照避免了假阴性结果的出现。结论建立的多重ＰＣＲ技术检测ＭＲＳＡ和ＭＲＣＮＳ具有敏感、快速、特异的特点,是一种可靠的实验诊断手段。     

PCR快速诊断急性坏死性胰腺炎继发真菌感染的研究

探讨针对镇菌１８ｓ ｒＲＮＡ基因的通用引物合酶链反应技术诊断急性坏死亡性胰腺炎继发真菌感染的价值。方法建立ＰＣＲ方法检测常见的临床真菌分离菌株;彩和ＰＣＲ技术和常规培养方法时时检测３７例急性死性胰腺炎临床标本。结果,对于临床真菌分离菌,株,该ＰＣＲ方法增出１９７ｂｐ大小的片段,而革兰氏阳性,、阴性菌和人血白细胞呈阴性表达。１１例急性坏死胰腺炎患者的３７份坏死组织或胰周脓标本经真菌培养阳性为６份,而     

Multiplex PCR assays for the detection of clinically relevant antibiotic resistance genes in staphylococci isolated from patients infected after cardiac surgery. The ESPRIT Trial

Multiresistant staphylococci (82 Staphylococcus aureus and 114 coagulase-negative staphylococci) were characterized by testing with rapid multiplex polymerase chain reaction (PCR) assays for species identification and detection of associated antibiotic resistance genes. These 196 staphylococci were isolated from 149 adult patients who developed wound infection after elective coronary artery bypass grafts and/or valve surgery. The multiplex PCR assays allowed identification of the most common staphylococcal species with S. aureus- and Staphylococcus epidermidis-specific primers as well as the detection of the erythromycin resistance genes ermA, ermB, ermC and msrA, the aminoglycoside resistance gene aac(6')-aph(2"), the oxacillin resistance gene mecA and the penicillin resistance gene blaZ. There was a very good correlation between the genotypic analysis by PCR and the phenotype determined by standard methods of susceptibility testing and identification of staphylococcal species: 100% for erythromycin resistance, 98.0% for gentamicin resistance, 99.0% for oxacillin resistance, 100% for penicillin resistance and 100% for S. aureus and S. epidermidis species identification. This study suggests that the incidence and distribution of the tested clinically relevant antibiotic resistance genes in staphylococci associated with infections after cardiac surgery do not differ from those in strains from other infections. These multiplex PCR assays may be used as diagnostic tools to replace or complement standard methods of susceptibility testing and identification of staphylococci.     

改进的多重PCR技术鉴定白色念珠菌、新生隐球菌及烟曲霉的实验研究

[目的]建立一种快速而简便的鉴定白色念珠菌、新生隐球菌及烟曲霉的分子生物学方法。[方法]应用通用引物ITS1与ITS4，PCR扩增真菌的内转录间隔区（包含5．8SrDNA），然后将白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉的单条种特异性异物与引物ITS1结合，对通用引物的扩增产物进行多重PCR扩增，达到鉴定上述菌株的目的。[结果]实验所采用的所有致病真菌，经通用引物的PCR扩增均能扩增出特异性的条带，而非真菌菌株扩增为阴性；白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉的3种种特异性引物与ITS1结合进行的多重PCR扩增，只对目的菌株进行了有效扩增，其他菌株扩增为阴性。应用此方法对临床分离的菌株，白色念珠菌，新生隐球菌，烟曲霉进行鉴定，也得到特异性扩增条带。[结论]改进的多重PCR技术，更加经济，简单，快速，为致病真菌菌种的鉴定提供了有效手段。     

细菌革兰双检荧光定量PCR方法检测新生儿败血症

目的 建立细菌革兰阴、阳性菌双重实时荧光定量检测体系,探讨其检测败血症的临床应用价值.方法 分析细菌16SrRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和革兰阴性和阳性分型探针,选取临床较常见的35株菌株进行细菌革兰双检实时荧光定量PCR方法检测;对临床疑为败血症的512例新生患儿分别做细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养检测.结果 细菌革兰双检荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,能稳定检测到10 CFU左右细菌数.35株菌株进行细菌革兰双检荧光定量PCR检测,均为阳性,且革兰阴、阳性菌能正确分型和定量.巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA及空白对照均为阴性.对临床疑为败血症的512份新生患儿标本中,革兰双检荧光定量PCR检测血标本阳性率8.20%(42/512),血培养阳性率6.25%(32/512),前者明显高于后者,差异具有统计学意义(χ<'2>=8.10,P<0.01),30例非感染性疾病同期患儿血标本革兰双检荧光定量PER及细菌培养均为阴性.若以血培养作为对照,细菌革兰双检荧光定量PCR方法的诊断敏感度为100%,特异度为97.92%,准确性98.05%.结论 建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌革兰双检荧光定量PER方法.其检测快速、准确,具有很大的临床推广价值.     

Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis

Clinical isolates of Staphylococcus aureus (a total of 206) and S. epidermidis (a total of 188) from various countries were tested with multiplex PCR assays to detect clinically relevant antibiotic resistance genes associated with staphylococci. The targeted genes are implicated in resistance to oxacillin (mecA), gentamicin ?aac(6')-aph(2"), and erythromycin (ermA, ermB, ermC, and msrA). We found a nearly perfect correlation between genotypic and phenotypic analysis for most of these 394 strains, showing the following correlations: 98% for oxacillin resistance, 100% for gentamicin resistance, and 98.5% for erythromycin resistance. The discrepant results were (i) eight strains found to be positive by PCR for mecA or ermC but susceptible to the corresponding antibiotic based on disk diffusion and (ii) six strains of S. aureus found to be negative by PCR for mecA or for the four erythromycin resistance genes targeted but resistant to the corresponding antibiotic. In order to demonstrate in vitro that the eight susceptible strains harboring the resistance gene may become resistant, we subcultured the susceptible strains on media with increasing gradients of the antibiotic. We were able to select cells demonstrating a resistant phenotype for all of these eight strains carrying the resistance gene based on disk diffusion and MIC determinations. The four oxacillin-resistant strains negative for mecA were PCR positive for blaZ and had the phenotype of beta-lactamase hyperproducers, which could explain their borderline oxacillin resistance phenotype. The erythromycin resistance for the two strains found to be negative by PCR is probably associated with a novel mechanism. This study reiterates the usefulness of DNA-based assays for the detection of antibiotic resistance genes associated with staphylococcal infections.     

2012年度某院患者无菌体液耐药性监测的调查

目的 了解2012年度该院患者无菌体液的细菌分布和对抗菌药物的耐药性.方法 对临床送检的无菌体液标本按常规进行病原菌分离,采用Vitek2-Compact系统和ATB Express系统进行鉴定,测定抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）值,采用纸片扩散法（K-B）进行微生物敏感性试验.应用WHONET 5.6软件进行数据分析.结果 分离菌株556株,革兰阴性菌316株（57%）,革兰阳性菌226株（40%）.常见细菌分别为大肠埃希菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的检出率分别为53.3%和21.1%;检出9株金黄色葡萄球菌,其中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（66%）;耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（74%）.未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌.未发现对万古霉素耐药的肠球菌属细菌.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类耐药的检出率分别为3.8%和3.8%.结论 及时监测病原菌的菌群种类、分布和耐药变迁以指导临床合理、规范地使用抗菌药物.     

复合PCR鉴别葡萄球菌及其多重耐药基因

目的　建立既可鉴别金黄色葡萄球菌又可同时检测其耐药基因的分子诊断方法。方法　对应于femB、mecA、ileS基因的 3对引物与快速提取的单菌落模板DNA进行单管同步扩增 ,电泳观察PCR片段 ;mecA、ileS耐药基因扩增结果分别与苯唑西林、莫匹罗星药敏试验对比 ,分析菌株的耐药性。结果　检测femB基因可快速特异性地筛选出金黄色葡萄球菌 ,mecA基因的检出与常规药敏试验鉴定耐甲氧西林葡萄球菌 (MRS)的结果基本一致 ,而拥有ileS基因的全部葡萄球菌分离株对莫匹罗星耐药。结论　复合PCR可快速敏感地从葡萄球菌中区分金黄色葡萄菌 ,并同时检出MRSA和耐莫匹罗星的多重耐药菌株。