甲醛对HepG2细胞游离胆固醇代谢的影响

目的：研究甲醛（FA）对人肝癌细胞株HepG2细胞游离胆固醇（FC）含量的影响及其作用机制。方法：分别采用0.004、0.02、0.1 mmol/L FA处理人肝癌细胞株HepG2细胞24和48 h,以完全培养基为阴性对照,过氧化物酶法测定HepG2细胞内FC含量;采用Western blot法检测HepG2细胞固醇调节元件结合蛋白-2（SREBP-2）、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）、胆固醇酰基转移酶（ACAT）和低密度脂蛋白受体（LDLR）的蛋白表达水平。结果：与阴性对照组相比,各浓度的FA染毒24 h或0.02和0.1 mmol/L FA染毒48 h后,HepG2细胞内FC含量均明显增加（P均 < 0.05）;FA染毒24和48 h后细胞内HMGCR蛋白表达水平均明显增加（P < 0.05）;FA染毒24 h后,ACAT和LDLR表达水平均明显降低（P均 < 0.05）;FA染毒48 h,LDLR蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）,ACAT蛋白表达水平在0.02和0.1 mmol/L FA组明显降低（P < 0.05）。结论：甲醛染毒可使HepG2细胞内FC含量增加,可能与胆固醇的从头合成增加和胆固醇酯化水平降低有关。     

脂联素通过AMPK/mTOR/4EBP1通路对子宫内膜癌细胞迁移及侵袭的影响

背景与目的：脂联素（adiponectin，APN）被认为是一种强有力的抑制肿瘤细胞生长的抗癌因子，但APN调节细胞转移的作用机制尚不清楚。探讨在子宫内膜癌HEC-1B细胞中，APN能否通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/磷酸化真核启动因子4E结合蛋白1（4E binding protein 1，4EBP1）通路抑制细胞迁移及侵袭。方法：实验设计为4组：① APN组：20 μg/mL APN作用于细胞30 min；② 抑制剂组：10 μmol/L复合物C（AMPK抑制剂）作用于细胞30 min；③ APN+抑制剂组：10 μmol/L复合物C预处理细胞30 min后，加入20 μg/mL APN作用30 min；④ 对照组：仅加入无血清DMEM培养基。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技术检测4组细胞中B细胞淋巴瘤-2（B- cell lymphoma 2，Bcl-2）和基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）的mRNA表达；蛋白质印迹法（Western blot）检测4组细胞中Bcl-2、MMP-9及AMPK信号通路中AMPK、mTOR、4EBP1蛋白水平；Transwell及划痕实验检测4组HEC-1B细胞的迁移能力。结果：Bcl-2和MMP-9 mRNA的表达水平在APN组中分别为0.64±0.08和0.68±0.02，均明显低于APN+抑制剂组（分别为0.98±0.11和0.96±0.08；P=0.02和0.03)。APN组中，HEC-1B细胞Bcl-2、MMP-9蛋白水平分别与对照组、抑制剂组、APN+抑制剂组比较，差异均有统计学意义（P=0.00）。APN组中，HEC-1B细胞AMPK、mTOR、4EBP1蛋白水平分别为1.49±0.02、0.48±0.00、0.19±0.00。与对照组比较，蛋白水平明显升高（P=0.00）。APN组穿膜细胞数为（78.72±10.74）个，APN+抑制剂组为（131.45±9.11）个，对照组为（131.91±12.29）个，APN组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.00），APN+抑制剂组与对照组相比，差异无统计学意义（P=0.12）。APN组中，HEC-1B细胞迁移率为（19.27±1.14）%，与其余3组比较，4组组间差异均有统计学意义（P=0.00），其余3组组间差异无统计学意义（F=2.78，P=0.39）。结论：APN可经AMPK/mTOR/4EBP1信号通路发挥抑制子宫内膜癌细胞迁移及侵袭的效应，达到抗肿瘤作用。     

HIF-1α对人肝癌 HepG2 细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人肝癌细胞株HepG2体内生长的影响,并探讨其可能机制.方法将HIF-1α转入人肝癌细胞HepG2中,建立人肝癌裸鼠模型,观察其生长.切除瘤灶、称瘤重.标本用免疫组化和western-blot检测HIF-1α和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果HepG2细胞对HIF-1α敏感,细胞生长速度加快.结论 HIF-1α体内可促进肝癌HepG2的生长,其机制可能与其促血管生成有关.     

甲醛对人肝癌细胞株HepG2内质网应激相关Bip和CANX mRNA及蛋白表达水平的影响

目的：研究甲醛（FA）染毒是否会诱导人肝癌细胞株HepG2内质网应激相关基因Bip和CANX mRNA和蛋白表达水平的改变,引起内质网应激反应。方法：用Hoechst 33258进行核染色,以观察不同浓度（0、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mmol/L）FA分别染毒肝细胞株24和48 h 后的细胞核形态学变化。再分别用0.004、0.02、0.1 mmol/L的FA处理人肝癌细胞株HepG2细胞24 h和48 h后,采用荧光定量PCR（qPCR）和Western blot检测内质网应激相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）及钙连蛋白（CANX） mRNA和蛋白的表达水平。结果：Hoechst 33258染色结果表明,染毒24和48 h后,0.5、2.5、12.5 mmol/L FA 组出现大量核呈固缩状态或颗粒状荧光死亡细胞,阴性对照组和0.1 mmol/L及以下剂量组细胞核荧光染色较浅,细胞核未固缩,故后续试验采用0.1 mmol/L及以下剂量。经0.004、0.02和0.1 mmol/L FA处理细胞24和48 h后,qPCR检测结果显示,甲醛各剂量染毒组Bip和CANX的mRNA表达量与阴性对照组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果表明,染毒24 h,不同剂量甲醛处理组与阴性对照组相比,Bip和CANX蛋白表达量均无显著差异（P>0.05）;染毒48 h,与阴性对照组相比,各FA处理组Bip蛋白表达量升高,0.02和0.1 mmol/L FA处理组CANX蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论：甲醛染毒可诱导HepG2细胞内质网应激相关蛋白Bip和CANX表达水平升高,引起肝细胞发生内质网应激反应。     

缺氧时肝癌HepG2细胞HIF-1α对GLUT-1表达的影响及机制探讨

目的探讨缺氧状态下肝癌HepG2细胞中HIF-1α表达对GLUT-1的影响。方法 HepG2人肝癌细胞株,以DMEM培养基加胎牛血清培养,分为常氧对照组(21%O2),缺氧组(1%O2),常氧加吲哚美辛组,缺氧加吲哚美辛组。收获细胞后,分别行免疫荧光法检测细胞内HIF-1α的表达和核转位;Western blot检测各组的HIF-1α、GLUT-1蛋白表达;RT-PCR检测各组的GLUT-1mRNA含量。结果缺氧时HIF-1α(蛋白:68.25±11.72)和GLUT-1(mRNA:0.7424±0.1127;蛋白:70.33±12.83)在肝癌HepG2细胞中的表达增高(P<0.05);缺氧时以吲哚美辛抑制HIF-1α蛋白(36.34±9.50)稳定和积聚后,GLUT-1 mRNA(0.3710±0.1016)及蛋白(38.46±12.20)表达受到抑制(P<0.05)。结论缺氧可以上调HIF-1α和GLUT-1在肝癌HepG2细胞中的表达;HIF-1α可以调控其下游靶基因GLUT-1的转录和表达,影响糖酵解和细胞能量的产生。     

缺氧对喉癌Hep-2细胞HIF-1α、GLUT-1、MMP-2表达的影响

目的 探讨缺氧对喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭以及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响。方法 MTT法检测缺氧不同时间点细胞增殖状况;Transwell和划痕实验分别检测缺氧对喉癌Hep-2细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测缺氧后不同时间点HIF-1α、GLUT-1、MMP-2蛋白及mRNA表达的情况。结果 在缺氧条件下（1％O2、5％CO2和94％N2）,Hep-2细胞的存活率随缺氧时间的延长逐渐升高,迁移和侵袭能力增强;随缺氧时间延长,Hep-2细胞HIF-1α蛋白表达水平明显增加,mRNA水平变化不明显;随缺氧时间延长,GLUT-1、MMP-2的mRNA水平和蛋白水平均明显增加。 结论 缺氧环境下,喉癌肿瘤细胞通过上调HIF-1α、GLUT-1、MMP-2的表达,强化其增殖、侵袭、转移的能力,促进喉癌的发展。     

GPC3基因转染的树突状细胞对人肝癌HepG2细胞杀伤作用的观察

目的:以GPC3基因转染人外周血单个核细胞来源的树突状细胞(DCs),诱导CTL产生特异性抗肝癌免疫.方法:从HLA-A2正常健康成人外周血分离单个核细胞,经GM-CSF和IL-4诱导产生DCs;通过脂质体转染法将携带人GPC3基因的质粒pEF-hGPC3转染DCs,蛋白质印迹法检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表达,流式细胞仪检测DCs表型的变化;MTT法检测DC诱导CTL对人肝癌细胞HepG2的特异性杀伤.结果:经细胞因子诱导产生了具有典型形态学的DCs,经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激成熟后可高表达CD80、CD86及CD83,而转染GPC3基因对协同刺激因子在DCs中的表达的影响并不显著.转染GPC3基因后,DCs可促进CTL特异性杀伤HepG2细胞,在不同效靶比的杀伤率:100∶1为(38.90±0.95)%,50∶1为(30.83±1.24)%,10∶1为(20.84±0.65)%,明显高于空载体组和对照组,P＜0.05.结论:GPC3基因转染人外周血单个核细胞来源的DCs可诱导和促进CTL特异性杀伤肝癌细胞HepG2作用,为治疗肝癌提供了新的免疫靶点.     

稳定转染HBx基因的HepG2细胞对raf-1表达的影响

 【摘要】　目的　探讨乙型肝炎病毒x（HBx）蛋白致癌变的分子机制。方法　构建HBx 基因真核表达载体pCDNA3.1(+)-x，脂质体转染入HepG2 细胞（HepG2X 细胞），以pCDNA3.1空载体为对照（HepG2X0细胞），G418选择培养，克隆扩增转染细胞，并用Western blot检测X蛋白的表达；MTS实验检测细胞增生情况；流式细胞仪检测细胞周期变化；检测转染组及对照组raf-1的表达变化。结果　转染组X细胞在相对分子质量为21×103位置有X蛋白的表达，而对照组HepG2X0细胞及未处理的HepG2细胞未见X蛋白的表达。MTS结果显示X细胞增生能力显著高于其他两株细胞（P＜0.01）。流式细胞仪结果显示转染后的细胞系凋亡率增高，G1／G0期细胞减少，G2期细胞增多。Western blot结果示转染组X细胞raf-1表达明显较其他两组细胞增高。结论　HBx 有推进细胞周期的作用，使细胞快速进入G2期。其机制可能是HBx增加细胞周期蛋白raf-1的表达。     

转录因子XBP1S对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨人剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein1spliced,XBP1S)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用衣霉素(tunicamycin,Tm)和毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)建立HepG2细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。将XBP1S真核表达载体pcDNA3.1(-)-XBP1S和靶向XBP1S的RNA干扰质粒pSUPER-XBP1S转染HepG2细胞,MTT法检测细胞的增殖能力,荧光显微镜下观察细胞的形态学变化,FCM法检测细胞凋亡率,Western印迹法检测caspase12的表达。结果:转染pSUPER-XBP1S可有效抑制细胞增殖,而转染pcDNA3.1(-)-XBP1S可促进细胞增殖。荧光显微镜下可见Tm处理组细胞出现细胞凋亡的形态学改变,进一步下调XBP1S的表达可使这一改变增强。对照组、Tm组、Tm+pSUPER-XBP1S转染组和Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组细胞的凋亡率分别为5.21%、41.51%、52.15%和35.87%,差异有统计学意义(P<0.05)。HepG2细胞中caspase12的表达,Tm组高于对照组,Tm+pSUPER-XBP1S转染组高于Tm组,Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组低于Tm组。结论:XBP1S可以促进肝癌HepG2细胞增殖,抑制或促进XBP1S表达可调节ERS介导的细胞凋亡。     

SREBP-1c基因过表达细胞模型的构建及对HepG2细胞脂滴含量的影响

目的：构建SREBP-1c过表达HepG2细胞模型并观察其对脂滴含量的影响,为进一步深入研究肝癌脂滴代谢异常机制提供细胞模型。方法：采用DNA重组技术,将SREBP-1c基因克隆至慢病毒表达载体pLenti 6.3/V5中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-SREBP-1c共转染293T细胞,收集上清,感染HepG2细胞。通过Real-time PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。采用免疫荧光检测HepG2细胞中脂滴的数量、大小及细胞内甘油三酯的含量。结果：成功构建了过表达SREBP-1c基因的慢病毒载体pLenti6.3-SREBP-1c,转染后HepG2细胞中可见明显的SREBP-1c蛋白表达。Real-time PCR检测结果显示转染SREBP-1c基因的HepG2细胞中SREBP-1c mRNA水平较对照组升高了约11.4倍。Western blot结果显示SREBP-1c蛋白水平较对照组提高3.2倍。免疫荧光显示过表达SREBP-1c能够明显增加HepG2细胞内脂滴的数量和大小。细胞内甘油三酯定量结果显示甘油三酯含量较对照组明显升高（P < 0.01）。结论：成功构建了SREBP-1c基因过表达的重组慢病毒载体及其稳定转染细胞株。高表达SREBP-1c的HepG2细胞增加了细胞中脂滴的数量、大小和甘油三酯的含量,可用于从脂滴代谢方面对肝癌发病分子机制的研究。     

罗汉果醇通过激活AMPK信号通路调控肝细胞癌HepG2 细胞的脂代谢

[摘要] 目的：研究罗汉果醇(MO)对肝细胞癌HepG2 细胞脂代谢的调控作用及其分子机制。方法：采用油酸(OA)诱导肝细胞癌HepG2 细胞脂肪累积,建立脂肪变性细胞模型。运用CCK-8 法检测MO对HepG2 的细胞毒性,筛选其无明显细胞毒性的实验工作浓度。不同工作浓度MO作用后运用油红O染色法观察模型细胞内脂质累积情况,测定细胞内甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）含量。运用高通量转录组测序方法筛选参与脂代谢的关键基因,运用qPCR检测模型及给药细胞SREBP-1c、FASN mRNA的表达、WB法检测p-AMPKα、SREBP-1c、FASN等蛋白的表达水平。结果：运用OA诱导的模型HepG2 细胞内脂质大量累积,TG、TC含量显著升高。OA诱导后参与肝癌细胞脂代谢的关键基因SREBP-1c、FASN mRNA表达升高;p-AMPKα 蛋白表达降低,SREBP-1c、FASN等蛋白的表达显著升高。工作浓度MO干预后,细胞内脂质累积显著减少、TG和TC含量降低,SREBP-1c、FASN mRNA表达降低,p-AMPKα 蛋白表达升高而SREBP-1c、FASN等蛋白的表达明显降低。结论：MO能够通过激活HepG2细胞中AMPK信号通路相关因子SREBP-1c、FASN的表达抑制脂肪酸合成,从而发挥调节脂代谢的作用。     

甲醛对雌性大鼠卵巢储备功能的影响

目的：在亚慢性染毒的条件下,研究甲醛对SD雌性大鼠卵巢储备功能的影响。方法：将40只SD雌性大鼠随机分为正常对照组和3个不同浓度（0．2、2．0、20．0mg／kg）的甲醛染毒组。腹腔注射甲醛染毒,每天1次,连续染毒14d,14d后称体质量,并采用股动脉放血处死受试动物,取血清,用化学发光法测定血清雌二醇（E2）浓度;用酶联免疫方法测定抑制素B（inhibin B）浓度;用放射免疫方法测定卵泡刺激素（FSH）和黄体生成激素（LH）的浓度。并解剖摘取卵巢称重,计算脏器系数。结果：甲醛染毒组与对照组比较,各染毒剂量组大鼠血清E2、Inhibin B水平明显降低（P〈0．05）,FSH水平显著升高（P〈0．05）;高、中剂量组大鼠血清LH水平均有所升高,但差异无统计学意义（P〉0．05）。各染毒剂量组卵巢脏器系数显著降低（P〈0．05）。结论：在亚慢性染毒条件下,甲醛对SD雌性大鼠卵巢储备功能有一定损害作用。     

羟基磷灰石纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG 2细胞及对其生长的影响

目的研究羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)纳米颗粒载体携带人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor, hGM-CSF)基因转染HepG 2细胞,以及其对细胞生长的影响,为基因修饰的肝癌肿瘤疫苗的临床研究奠定基础.方法采用MTT法检测HA纳米颗粒载体对HepG 2细胞生长的影响;采用HA纳米颗粒载体转染技术,将携带有hGM-CSF基因的表达质粒导入HepG 2细胞中,G 418筛选抗性细胞,限制性稀释法挑选单克隆;RT-PCR法鉴定hGM-CSF的整合和表达,ELISA法测定细胞培养液中的hGM-CSF分泌量和持续的时间;FCM法分析hGM-CSF基因对HepG 2细胞生长的影响.结果MTT结果提示HA纳米颗粒混悬液浓度在80 μg/mL以下对HepG 2细胞生长的影响与对照组比较差异无统计学意义.RT-PCR结果显示hGM-CSF基因在HepG 2细胞中已整合并稳定表达.ELISA检测结果显示转入hGM-CSF基因的HepG 2细胞能稳定分泌hGM-CSF,其分泌量为(216.22± 45.78) ng/106 cells每24 h.FCM检测结果则显示hGM-CSF基因不促进细胞凋亡,且对细胞的生长周期无明显影响.结论HA纳米颗粒载体可以安全地将目的基因hGM-CSF导入HepG 2细胞中且稳定表达,其对细胞的生长无明显影响,为基因修饰的肝癌疫苗的后继研究提供了实验基础.     

水飞蓟素对缺氧人肝癌HepG⁃2细胞HIF⁃1α及MDR1 表达的影响

目的 探讨水飞蓟素(SM)对缺氧条件下人肝癌HepG‐2细胞中缺氧诱导因子‐1α (HIF‐1α)和多耐药基因1(MDR1)表达 的影响。 法 不同浓度的SM（0、10、20、40 mg/L）与浓度梯度的化疗药物(多柔比星、索拉菲尼、顺铂)处理HepG‐2细胞后应用四 甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测不同浓度SM对HepG‐2细胞化疗药物敏感性的影响；在缺氧条件下，分别用0、10、20、40 mg/L 的 SM处理HepG‐2细胞8 h后，应用RT-PCR检测不同浓度SM对HepG‐2细胞的HIF‐1α及MDR1 mRNA表达水平的影响，利用蛋白 质印迹法检测不同浓度SM对HepG‐2细胞的HIF‐1α及P‐糖蛋白（P‐Gp)蛋白表达水平的影响。结果 随着SM浓度的增加，HepG‐2 细胞对化疗药物多柔比星、索拉菲尼和顺铂的敏感性逐渐增强；与对照组相比，10、20、40 mg/L SM处理的HIF‐1α mRNA表达量 差异无统计学意义（P>0.05)，而MDR1 mRNA表达量呈浓度依赖性降低（P<0.05)，10、20、40 mg/L SM处理的HIF‐1α与P‐Gp蛋白 表达水平呈浓度依赖性降低（P<0.05)。结论 SM可能通过在转录后水平抑制HepG‐2细胞HIF‐1α的蛋白表达而降低MDR1的mRNA 与蛋白表达，从而降低肝癌细胞的耐药性。     

喹乙醇诱导HepG2 细胞自噬的实验研究

目的： 研究喹乙醇对HepG2细胞自噬的影响。方法：分别用不同浓度 (0、200、400、800 μg/mL)喹乙醇染毒HepG2细胞24 h后,进行单丹磺酰尸胺 (monodansylcadaverine,MDC)染色,分别通过荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞自噬发生情况。另外,分别用不同浓度喹乙醇 (0、200、400、800 μg/mL)染毒HepG2细胞24 h和400 μg/mL喹乙醇染毒HepG2细胞不同时间 (0、1、3、6、12、24 h)后,采用Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin 1的表达。结果：随着喹乙醇染毒剂量增加,MDC阳性细胞的荧光强度及细胞内MDC荧光颗粒数目明显增加。流式结果显示,与对照组相比,200、400和800 μg/mL染毒组MDC阳性细胞百分比均显著增加 (P<0.05或P<0.01)。随着喹乙醇染毒浓度和时间的增加,LC3-Ⅱ和Beclin 1表达量均明显增加,其中400 μg/mL 喹乙醇染毒细胞24 h组与对照组相比,LC3-Ⅱ和Beclin 1的表达量均明显上调 (P<0.01)。结论：喹乙醇诱导了HepG2细胞的自噬反应。     

Novel camptothecin analogues that circumvent ABCG2-associated drug resistance in human tumor cells

Irinotecan (7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin; CPT-11) is a widely used potent antitumor drug that inhibits mammalian DNA topoisomerase I (Topo I); however, overexpression of ABCG2 (BCRP/MXR/ABCP) can confer cancer cell resistance to SN-38, the active form of CPT-11. We have recently demonstrated that plasma membrane vesicles prepared from ABCG2-overexpressing PC-6/SN2-5H cells transported SN-38 and its glucuronide conjugate in an ATP-dependent manner (Nakatomi et al., Biochem Biophys Res Commun 2001;288:827-32). In the present study, we have characterized a total of 14 new camptothecin (CPT) analogues with respect to both the inhibition of Topo I and the substrate specificity of ABCG2. All of the tested CPT analogues, which have different substitutions at positions 10 and 11, strongly inhibited the Topo I activity in a cell-free system, as did SN-38. Their antitumor activities in the SN-38-resistant PC-6/SN2-5H2 cell line greatly varied, however, being correlated with intracellular accumulation levels. We have examined ATP-dependent transport of those CPT analogues by using plasma membrane vesicles prepared from both PC-6/SN2-5H2 cells and ABCG2-transfected HEK-293 cells. Based on the substrate specificity of ABCG2 thus evaluated, it is strongly suggested that CPT analogues with high polarity are good substrates for ABCG2 and are therefore effectively extruded from cancer cells. In this context, to circumvent ABCG2-associated drug resistance, low-polarity CPT analogues are considered to be potent lead compounds. The present study provides a practical approach to discover new CPT-based drugs for the chemotherapy of drug-resistant human cancer.