应用枯草芽孢杆菌表达系统制备肠道病毒71型VP1蛋白

目的利用枯草芽孢杆菌系统表达肠道病毒71型（EV71）病毒VPl蛋白。方法使用基因特异性引物扩增VPl开放读码框（ORF）,构建包含VP1完整开放读码框的pSac—VPl穿梭载体。根据枯草芽孢杆菌表达系统双交叉同源重组的特点,将EV71的结构抗原基因VPl整合在枯草芽孢杆菌sacA染色体,并经测序鉴定。使用VPl特异性抗体,通过蛋白印记（Western—Blot）鉴定枯草芽孢杆菌中VPl蛋白的表达情况。结果成功克隆EV71的VPl基因,长度1361bp,并将其克隆入穿梭载体pSae—Kan。测序结果显示VPl基因成功整合如sacA染色体。Western．Blot证实VPl抗原在枯草芽孢杆菌的成功表达,相对分子质量约35×10^3。结论利用枯草芽孢杆菌表达系统成功制备EV71病毒VPl抗原,为后续EV71诊断试剂、疫苗研发奠定基础。     

抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备具有中和活性的抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1的单克隆抗体.方法 人工合成SP55和SP70(分别包含VP1的第163-177,208-222位氨基酸)两段VP1的多肽,分别免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价.用分泌的单抗和EV71病毒在RD细胞上进行中和试验以检验其中和活性.结果 得到2株能稳定分泌抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,2株单抗的中和效价分别为1:8和1:16.结论 成功制备出2株具有中和活性的抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体,为其下一步应用打下基础.     

EV71 VP1人源单克隆抗体筛选

目的 通过建立新型人源化单克隆抗体制备技术平台,筛选抗EV71 VP1单克隆抗体.方法 使用耦联EV71 VP1抗原的磁珠对EV71感染者外周血淋巴细胞进行分选,得到分泌EV71VP1特异性抗体的B淋巴细胞.有限稀释后,低渗裂解细胞,采用逆转录和巢式PCR扩增免疫球蛋白重链和轻链基因,经测序鉴定后克隆到真核表达载体Cloning vector AbVec-hIgG1、Cloning vectorAbVec-hIgKappa、Cloning vector AbVec-hIgLambda中.通过瞬时转染293T细胞得到重组抗体.结果 成功筛选到1对抗EV71 VP1的人源单克隆抗体基因.结论 本研究初步成功地建立了人源化单克隆抗体的筛选方法,为手足口病早期诊断、治疗以及筛选其他人源化单克隆抗体奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌介导的基因工程菌研制现状

枯草芽孢杆菌是一种新型表达载体,它可以表达酶类和生长因子等多种蛋白,本文拟就这方面的研制现状进行综述。     

重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达

目的构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的蛋白的分泌表达,并对其酶活性进行测定。方法从pET-22b/pUOX重组质粒上PCR获得pUOX基因,然后通过重叠延伸PCR技术将pUOX与一段nprB信号肽基因相连,导入穿梭载体pP43X,构建重组载体pP43X/pUOX,运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌WB800中。结果发酵表达后胞外分泌液经SDS-PAGE检测,在约34kD处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。发酵液中该重组蛋白的酶活力达2.322U/ml。结论成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌,目的蛋白分泌表达并具有较高活性。     

EV71结构蛋白VP1的原核表达及VP1单克隆抗体的制备

目的:原核表达EV71结构蛋白VP1并制备其单克隆抗体。方法:以肠道病毒71型(EV71)P1基因为模板,设计引物扩增出目的片段VP1,将其连接至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)上,转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序。将重组表达载体pET-32a(+)-VP1转化大肠杆菌表达菌株BLgold(DE3),对该工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,表达产物以包涵体的形式存在。包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化的VP1蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体(mAb)。结果:获得了24株mAb,其中1株EV71 Westernblot法鉴定呈阳性,5株EV71间接免疫荧光法(IFA)鉴定阳性。结论:成功地制备了VP1的mAb。     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性

目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×10^11/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期（均P＜0.05）,表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.     

EV71不同接种途径对BALB/c小鼠的感染特点

目的 研究EV71 JN200804株对1日龄BALB/c小鼠的感染特点,建立EV71感染BALB/c小鼠的动物模型,为疫苗和抗病毒药物的研究提供可靠的动物评价工具.方法 EV71JN200804株分别采用口服、颅内注射、肌内注射和腹腔注射感染1日龄BALB/c小鼠,出现后肢麻痹后,做后肢电生理检测;安乐动物,采集脑、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、小肠及后肢肌肉,进行动物体内的病毒分离和RT-PCR鉴定,同时对各器官组织进行组织病理学观察.结果 接种EV71后,颅内、肌内和腹腔注射组小鼠体重增长缓慢,4～5d出现后肢麻痹,7d左右死亡.RT-PCR和病毒分离表明颅内、肌内和腹腔注射组的肌肉分离到病毒,颅内注射组脊髓也分离到病毒,经RT-PCR鉴定为EV71感染.肌电图显示颅内、肌内和腹腔注射组的时限显著增加,波幅显著降低,判断小鼠后肢麻痹可能既有神经源性损害又有肌源性损害.组织病理学观察发现,颅内、肌内、腹腔注射组小脑浦肯野细胞及颗粒细胞减少,脊髓前角白质区神经纤维肿胀,后肢肌肉组织大片坏死溶解、炎性细胞浸润,肺组织明显充血,局部心肌细胞肿胀,部分肝组织内可见巨噬样细胞及淋巴样细胞浸润,部分肾皮质中肾小球萎缩、数目减少,而口服组无明显病理变化.结论 EV71 JN200804株通过颅内、肌内和腹腔注射三种途径均能感染并导致1日龄BALB/c小鼠后肢麻痹,此动物模型可用于EV71致病机制和特异性抗病毒药物的研究及疫苗的评价.     

深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势研究

目的 研究深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势.方法 用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VP1进行扩增,所得的序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,用DNA Star、BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果 35株病毒间VP1核苷酸同源性为92.1%-100%,它们与A、B基因型代表株VP1区核苷酸同源性差异较大,为81.4%-91.1%,与C4基因型代表株接近,其核苷酸同源性在93%-97.4%之间.1998-2004年深圳地区EV71主要流行株为C4b亚型,从2003年开始逐步向C4a亚型过渡,至2006年已全部变迁为C4a亚型,且从2003年至2008年,深圳地区EV71 C4a株与安徽阜阳株FY23的核苷酸的同源性分别为：94.5%-94.7%,95.7%-95.8%,96.2%,95.4%-97.5%,96.3%-99.2%,有逐年增高的趋势.2006年两株EV71和2008年EV71代表株核苷酸序列在VP1区的第66位点,均由A→C,从而导致VP1区氨基酸的第22位点由谷酰胺变为组氨酸（Q→H）.结论 深圳地区EV71流行株逐渐由C4b亚型向C4a亚型演变,2006年部分EV71及2008年EV71 VP1第66核苷酸位点发生有义突变.     

2009年深圳地区肠道病毒71型毒株VP4基因进化分析

目的 对深圳地区手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)肠道病毒71型分离株(enterovirus 71,EV71)的VP4基因遗传进化进行分析.方法 2009年采集深圳市儿童医院就诊的HFMD患者的粪便标本491份,选取其中8份经细胞培养鉴定为阳性的EV71毒株用RT-PCR扩增VP4基因,利用MEGA4.0软件进行遗传进化分析.结果 2009年深圳地区8株EV71 VP4基因全长207 bp,编码69个氨基酸;8株EV71 VP4基因核苷酸同源性为94.2％ ～98.1％,与深圳2001至2004年分离的17株EV71毒株核苷酸同源性在89.9％ ～98.1％,与GenBank中其他EV71病毒株VP4的核苷酸同源性为79.2％～100％;其中与亚洲流行株阜阳株(EU703812)核苷酸的同源性最高(100％),其次是C4代表株及2004年深圳株(AY895144)为94.2％ ～97.1％.除了印度株和其中1株EV71的VP4编码的氨基酸在第54位(ACA)不同之外,其余7株EV71 VP4编码的氨基酸序列之间以及与GenBank报道的其他序列同源性达100％.8株EV71 VP4基因核苷酸与C4代表株相比有17处不同,除1处以外其余全在简并密码位点上;轻重症病例毒株之间VP4基因序列未见明显改变.进化树显示8株EV71均属于C4基因亚型.结论 2009年深圳市流行的EV71属于C4基因亚型,流行的EV71 VP4基因非常保守,不属于变异区段,绝大部分核苷酸的变异属无义突变,VP4基因编码的氨基酸变异几乎为0.     

携带肠道病毒71型VPl基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型（EV71）VPl基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71DNA疫苗的研发。方法利用DNA重组技术,构建表达EV71VPl蛋白的真核表达质粒VR．EV7lVPl,体外转染Vero细胞后检测目的蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027。结果酶切鉴定证实构建含EV7lVPl基因的重组质粒,体外表达目的蛋白具有较好的抗原性．并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论成功构建稳定携带肠道病毒71型VPl基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础。     

Mutations in VP2 and VP1 capsid proteins increase infectivity and mouse lethality of enterovirus 71 by virus binding and RNA accumulation enhancement

Enterovirus 71 (EV71) is a major cause of hand-foot-and-mouth disease. EV71 infection occasionally associates with severe neurological sequelae such as brainstem encephalitis or poliovirus-like paralysis. We demonstrated that mouse-adapted strain increases infectivity, resulting in higher cytotoxicity of neuron cells and mortality to neonatal mice than a non-adapted strain. Results pointed to EV71 capsid region determining viral infectivity and mouse lethality. Mutant virus with lysine to methionine substitution at VP2₁₄₉ (VP2_149M) or glutamine to glutamic acid substitution at VP1₁₄₅ (VP1_145E) showed greater viral titers and apoptosis. Synergistic effect of VP2_149M and VP1_145E double mutations enhanced viral binding and RNA accumulation in infected Neuro-2a cells. The dual substitution mutants markedly reduced value of 50% lethal dose in neonatal mice infection, indicating they raised mouse lethality in vivo. In sum, VP2_149M and VP1_145E mutations cooperatively promote viral binding and RNA accumulation of EV71, contributing to viral infectivity in vitro and mouse lethality in vivo.     

北京市2008年肠道病毒71型的RT-PCR鉴定及VP1区基因特征分析

目的 研究2008年北京市手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Human enterovirus 71,HEV71）的VP1编码区基因特征.方法 采集北京市朝阳区医院和幼儿园的HFMD患者标本共285份,进行HEV71特异性RT-PCR鉴定和病毒分离,随机选取10株HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析.结果 129份标本RT-PCR鉴定结果 为阳性,阳性率为45.26%.10株HEV71在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上的差异分别在94.6%～99.6%和95.9%～100%之间.北京朝阳HEV71分离株属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 RT-PCR法可以快速、准确地鉴定HEV71.引起本次HFMD流行的HEV71为C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,提示自1998年起,C4亚型的HEV71在中国大陆有较广泛的传播.加强对HEV71的分子流行病学监测,了解HEV71的基因特征,对预防和控制HEV71在中国的暴发具有重要意义.     

青海省分离到肠道病毒71型及其VP1区基因特征分析

目的 研究2008年青海省手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的致病病原体中肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,HEV71）的VP1区基因特征.方法 采集青海省HFMD患者的粪便、疱疹液和咽拭子标本共335份,并进行病毒分离,然后对阳性分离株病毒进行肠道病毒血清型别的分子定型.对分离到的HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增,核苷酸序列测定和同源进化分析.结果 在335份临床标本中,共分离到45株阳性病毒分离物,其中30株鉴定为HEV71（占66.7%）,是主要病原体.对30株HEV71进行VP1区核苷酸序列测定后,分析发现它们在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上有一定差异,同源性分别在95.2%～100.0%和96.6%～100%之间.它们与1998年以来在我国分离的HEV71在核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高.与其他35株各基因型和基因亚型的HEV71代表株构建的亲缘进化树中显示,青海省HEY71分离株与C4亚型代表株聚为一簇,属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 青海省从HFMD病例中分离到HEV71,也确认了青海省HFMD的病原体HEV71流行株的基因型为C4基因型中的C4a进化分支,并且存在多个传播链.     

汕头市中枢神经系统感染的肠道病毒病原学分析

对汕头市２３６例临床诊断中枢神经系统（ＣＮＳ）感染患者进行肠道病毒（ＥＶ）病原学及血清学检测，结果从２３６例的２５７份标本中分离出病毒６２株（５５例），检出率为２４．１％。５７例患者做了双份血清检测，中和抗体≥４倍增高者４８例，阳性率为８４．２％。以上患者病毒分离和／或血清学阳性而确诊者７８例，确诊率为３３．１％，患者感染的病毒型别分布及构成比分别为：脊髓灰质炎（Ｐｏｌｉｏ）病毒３３例（０．４２３１），其中Ⅰ型６例、Ⅱ型１８例、Ⅲ型４例和多型混合感染５例；柯萨奇（Ｃｏｘ）病毒２１例（０．２６９２），其中Ａ２４型６例、Ｂ１型７例、Ｂ４型２例和Ｂ５型６例；埃可（ＥＣＨＯ）病毒１１例（０．１４１０），其中７型５例、２４型２例和１１、１２、１５、２７型各１例；肠道病毒１０例（０．１２８０），其中７０型３例、７１型７例及多种病毒混合感染３例（０．０３８５）。     

Recombinant Newcastle Disease virus capsids displaying enterovirus 71 VP1 fragment induce a strong immune response in rabbits

The complete VP1 protein of EV71 was truncated into six segments and fused to the C-terminal ends of full-length nucleocapsid protein (NPfl) and truncated NP (NPt; lacks 20% amino acid residues from its C-terminal end) of newcastle disease virus (NDV). Western blot analysis using anti-VP1 rabbit serum showed that the N-terminal region of the VP1 protein contains a major antigenic region. The recombinant proteins carrying the truncated VP1 protein, VP1(1-100), were expressed most efficiently in Escherichia coli as determined by Western blot analysis. Electron microscopic analysis of the purified recombinant protein, NPt-VP(1-100) revealed that it predominantly self-assembled into intact ring-like structures whereas NPfl-VP(1-100) recombinant proteins showed disrupted ring-like formations. Rabbits immunized with the purified NPt-VP(1-100) and NPfl-VP(1-100) exhibited a strong immune response against the complete VP1 protein. The antisera of these recombinant proteins also reacted positively with authentic enterovirus 71 and the closely related Coxsackievirus A16 when analyzed by an immunofluorescence assay suggesting their potential as immunological reagents for the detection of anti-enterovirus 71 antibodies in serum samples.     

吉林省2009-2012年肠道病毒71型VP1编码区氨基酸位点的变异分析

目的分析2009--2012年引起吉林省手足口病（handfootandmouthdisease,HFMD）流行的肠道病毒71型（EV—A71）的VP1区氨基酸位点的特征性变异位点。方法对2009--2012年分离于吉林省HFMD病例的70株EV—A71分离株的VPl编码区进行逆转录．聚合酶链反应,然后对扩增产物进行核苷酸序列测定,使用Bioedit软件和MEGA4．0软件分析VPl区氨基酸位点的变异特征以及基因亲缘关系。结果2009--2012年在吉林省分离到的70株EV—A71均属于C4a基因亚型,其中69株与2008年安徽阜阳的分离株亲缘关系最近,并且这69株病毒在VPl编码区第22位氨基酸位点均由谷氨酰胺转变为组氨酸（Q—H）,与2008年安徽阜阳株一致。结论引起2009-2012年吉林省HFMD流行的EV-A71可能：来源于安徽阜阳流行株延续传播。