肺炎衣原体Cpn0147基因的克隆、表达与定位及其重组蛋白的生物信息学分析

目的重组表达肺炎衣原体Cpn0147基因,并对表达的内源性蛋白进行细胞内定位,对重组蛋白进行生物信息学分析。方法使用PCR方法从肺炎衣原体菌株AR39基因组中扩增第0147段开放读码区基因,使用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切目的片段和载体PGEX-6P2,T4连接酶连接后转化入大肠埃希菌感受态XL-Blue,并诱导表达融合蛋白GST-Cpn0147。用融合蛋白免疫小鼠,制备抗体,应用IFA方法对衣原体感染细胞内Cpn0147基因表达的内源性蛋白进行定位。利用软件Expasy对重组蛋白进行生物信息学分析。结果克隆出肺炎衣原体基因Cpn0147,全长450 bp,编码蛋白分子质量单位为14.727 ku,表达的融合蛋白GST-Cpn0147分子质量单位约为43 ku;用制备的抗体做IFA,显示现该蛋白定位于肺炎衣原体包涵体膜上。生物信息学分析该蛋白含2个抗原决定簇,具有良好的抗原性和亲水性。结论肺炎衣原体Cpn0147基因编码蛋白为一包涵体膜蛋白,抗原性和亲水性较好。     

肺炎嗜衣原体Cpn0797蛋白的生物信息学分析及其单克隆抗体的制备和鉴定

摘 要： 目的 生物信息学分析肺炎嗜衣原体Cpn0797蛋白的结构,制备特异性的抗Cpn0797蛋白的单克隆抗体。 方法 用ProtParam、SignalP、NPS@ 、和PSORT等软件对Cpn0797蛋白的理化参数、信号肽、二级结构、蛋白亚细胞定位进行分析;原核表达纯化GST-Cpn0797融合蛋白,以其为免疫原免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的亚类和特异性。 结果 生物信息学分析表明Cpn0797蛋白二级结构以无规则卷曲为主;成功地建立了能稳定分泌抗Cpn0797蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体能特异性的识别Cpn0797内源性蛋白。结论 成功制备特异性的Cpn0797单克隆抗体,为进一步探究Cpn0797蛋白的生物学功能提供实验基础。     

肺炎嗜衣原体Cpn0425重组蛋白的克隆与表达及抗原性研究

目的构建重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,在E.coli BL21中进行诱导表达,纯化获得重组融合蛋白Cpn0425,并评价其抗原性。方法 PCR扩增肺炎嗜衣原体Cpn0425蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0425重组质粒,测序正确后在E.coli BL21中诱导表达,用SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定。结果构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,并在E.coli BL21菌中高效表达出Mr约为50kDa的GST-Cpn0425目的蛋白,超声裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达,经采用默克Novagen的GST纯化树脂纯化获得纯度在95%以上的重组蛋白。结论获得了Cpn0425基因片段,并在E.coli BL21中成功表达,GST-Cpn0425具有良好的抗原性。     

肺炎衣原体与动脉粥样硬化

近年来发现肺炎衣原体与心血管疾病有关，尤其是与动脉粥样硬化密切相关。人群中肺炎衣原体感染很普遍，其抗体检出率为40％～60％；在成年人中，男性肺炎衣原体抗体的阳性率高于女性，这与男性易患动脉粥样硬化的结论相一致。动脉粥样硬化患者肺炎衣原体抗体的阳性率明显高于对应的正常人群，在动脉粥样硬化病变中尤其是斑块中可以找到肺炎衣原体原体。经鼻接种肺炎衣原体的新西兰白兔喂正常饲料可以形成动脉粥样硬化病变。本文从诸多方面综合近五年的研究成果，讨论二者相关的证据并在此基础上推测肺炎衣原体致动脉粥样硬化可能的机制。     

肺炎衣原体肺炎临床诊治体会

本文主要总结了肺炎衣原体肺炎的临床表现、实验诊断及治疗，重在提高社区医生对肺炎的诊断和鉴别诊断水平，科学地实施治疗。     

344例发热患者肺炎衣原体感染的临床分析

为了解传染性非典型肺炎(SARS)流行期间发热患者肺炎衣原体感染情况，加强传统的非典型性肺炎的诊断及治疗，我们对344例住院患者行血清肺炎衣原体特异性的IgM、IgG抗体检测，并对其临床表现进行了观察。     

肺炎衣原体与动脉粥样硬化

肺炎衣原体是新认识的人类呼吸系统重要病原菌，可引起急、慢性感染，尤其是近年来发现其慢性感染与动脉粥样硬化有密切的关系。本文从血清流行病学、分子形态学。分子生物学等方面综述这种关系，并简要阐明肺炎衣原体慢性感染诱发动脉粥样硬化的可能机制。     

新生儿消眼衣原体肺炎30例临床分析

近年来 ,沙眼衣原体 (CT)肺炎的发病率呈上升趋势。2 0 0 1年 2～ 9月 ,我们采用聚合酶链反应 (PCR)方法对 15 0例感染性肺炎新生儿行鼻咽分泌物 (NPS)检测 ,现将结果报告如下。临床资料 :本组患儿日龄 14～ 2 7(发病平均日龄 17)天 ;足月儿 2 8例 ,早产儿 2例 ,其中大于胎龄儿 5例 ;阴道分娩 2 6例 ,剖宫产 4例 (其中 2例胎膜早破 ) ;妊 1产 1为 4例 ,妊 2产 1为 12例 ,妊 3产 1为 9例 ,妊 4产 1为 4例 ,1例不详 ;从发病到入院时间平均 4 (2～ 12 )天 ;其母来自农村 10例 ,城市6例。主要临床表现为咳嗽 2 6例 (阵咳 2 0例 ,单咳 6例 ) …     

衣原体肺炎的化疗

由于衣原体肺炎诊断的不明确性和混合感染的存在 ,有关肺炎衣原体的治疗尚处于经验积累的过程。衣原体的体外培养需在细胞内进行 ,肺炎衣原体的体外药敏试验的资料也是有限的 ,已有资料表明衣原体在体外对大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类、利福平和新的抗菌药物酮内酯敏感。大环内酯类抗生素中以克拉霉素对肺炎衣原体的抗菌作用最强 ,其 MIC在0 .0 0 4～ 0 .2 5 μg/ml,高于红霉素 (0 .0 1～ 0 .5 μg/ml)、罗红霉素 (0 .0 5～ 2μg/ml)和阿奇霉素 (0 .0 1～ 2μg/ml) ,四环素类的米诺霉素 (MIC为 0 .0 16～ 0 .0 6 μg/ml)和多西环素 …     

美洲大蠊泛素基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆美洲大蠊（Periplaneta americana）泛素基因,并对序列进行相关分析。方法依据其他物种泛素基因的保守区设计1对简并引物,对美洲大蠊cDNA模板进行RT-PCR扩增,产物纯化后行T-A克隆、测序和酶切鉴定,运用相关生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行分析和预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果从美洲大蠊体中克隆了泛素基因的编码区,被GenBank收录,登录号为EF101563。生物信息学分析结果表明,美洲大蠊泛素基因编码区的长度为228 bp,编码的多肽由76个氨基酸残基组成,相对分子质量单位为8.53 ku,理论等电点为6.56,与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有96%以上的相似性,二级结构中α-螺旋占26.3%,无规则卷曲占47.3%,延伸串占26.3%。结论成功克隆了美洲大蠊泛素基因,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究泛素在美洲大蠊机体内的作用奠定了基础。     

日本血吸虫MBLAC1基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆日本血吸虫金属β内酰胺酶结构域蛋白1(Metallo-beta-lactamases domain-containing protein 1,MBLAC1)基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法 以成虫虫体cDNA为模板,利用PCR技术扩增SjMBLAC1基因,并通过生物信息学技术分析该基因编码蛋白的结构特征。结果 SjMBLAC1扩增基因片段大小为711 bp,编码236个氨基酸,预测蛋白质分子量约为26 kD,理论等电点为4.84。该蛋白的第7~222位氨基酸为保守结构域,属于MBL超级家族;不存在跨膜结构域及信号肽;具有一个N-糖基化位点,在第186位氨基酸;二级结构中包含α-螺旋8.90%、β-折叠27.97%、无规则卷曲区域63.14%,推测SjMBLAC1蛋白具有9个优势B细胞抗原表位。结论 成功克隆了SjMBLAC1基因并对其编码蛋白进行了生物信息学分析,从而为开展该蛋白的生物学功能研究及筛选抗血吸虫病疫苗候选分子提供了基础。     

淡色库蚊氨肽酶N基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆淡色库蚊Bt毒素受体氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)基因,并对基因及编码蛋白进行生物信息学分析.方法 提取淡色库蚊RNA,通过RT-PCR扩增氨肽酶N基因的全长cDNA序列,纯化PCR产物连接至pMD19-T载体,阳性重组质粒经PCR鉴定后进行基因测序.生物信息学分析APN基因的序列同源性及编码蛋白的结构特征.结果 该基因cDNA序列全长为1 383 bp(含终止密码子),编码460个氨基酸,与致倦库蚊XM_001862270.1序列的同源性为100%.预测蛋白质分子量为52.9 kDa,等电点为4.98.前21个氨基酸为N-末端的信号肽,存在2个N-糖基化位点( 93NLT95和¹⁶⁹NVS¹⁷¹).具有肽酶家族M1的序列特征,锌结合位点HEXXH和谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN.结论 成功克隆了淡色库蚊氨肽酶N基因并对APN蛋白进行生物信息学分析,为进一步探讨淡色库蚊APN的功能及Bt毒素作用机制奠定了基础.     

隐孢子虫Ga1/Ga1NAc特异性凝集素P30基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆隐孢子虫Ga1／Ga1NAc特异性凝集素P30基因并测序,对其进行生物信息学分析。方法采用聚合酶链（PCR）技术,从微小隐孢子虫基因组中扩增P30基因,然后将其克隆入pMD18-T载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并对获得的P30基因进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的微小隐孢子虫P30基因,测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank上提交的序列同源性分别为98％-100％和99％-100％。结论成功克隆出序列正确的微小隐孢子虫P30基因,预测的P30蛋白具有9个潜在的抗原表位,为其相关研究奠定了基础。     

脓肿分枝杆菌硝基还原酶基因的克隆表达及生物信息学分析

目的 克隆表达脓肿分枝杆菌中的硝基还原酶（nitroreductase, Nrd）基因,并对其对应的蛋白质进行生物信息学分析。方法 利用PCR技术从脓肿分枝杆菌中扩增Nrd的全基因序列,采用原核表达系统进行体外表达。采用生物信息学方法对Nrd蛋白的理化性质、结构和功能等重要参数进行了预测和分析,对其三级结构进行了同源建模。结果 从脓肿分枝杆菌中扩增出660 bp的目的片段,体外表达获得了大小约为30 kDa的带有His标签的重组蛋白。生物信息学分析显示Nrd蛋白有219个氨基酸组成,理论分子量和等电点分别为24.38 kDa和6.52,是一种不稳定的亲水性蛋白质（不稳定系数为54.52,总平均亲水性为-0.244）;二级结构以α 螺旋、β 折叠和无规卷曲为主要构件;该蛋白的氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%,以3gr3蛋白A链为模板构建了[WTBX]Nrd[WTBZ]蛋白的三维结构分子模型。结论 成功表达并纯化了脓肿分枝杆菌中的Nrd蛋白。预测结果显示该蛋白是硝基还原酶家族成员之一,这提示Nrd蛋白在脓肿分枝杆菌中可能执行还原对硝基苯甲酸的功能。     

弓形虫SAG3基因克隆及生物信息学分析

目的克隆弓形虫表面抗原SAG3基因,对其结构和功能进行生物信息学分析,为进一步研究奠定基础。方法提取虫体总RNA,RT-PCR扩增SAG3基因并用生物信息学方法对SAG3蛋白的理化性质、结构和功能进行预测。结果扩增出的基因片段约1158bp,与预期相符。预测SAG3蛋白分子质量单位约41.7732ku,PI为6.75,为两亲性蛋白,有2个保守结构域和功能域。结论成功克隆出SAG3基因,为深入研究该基因结构和功能奠定了基础。     

非特异性间质性肺炎相关基因筛选和生物信息学分析

目的通过生物信息学的方法筛选非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia, NSIP)的致病基因,为进一步研究提供靶点。 方法从GEO数据库下载基因芯片数据集GSE110147、GSE21369、GSE40839,使用limma包分析工具筛选正常组织与NSIP的差异表达基因。通过clusterProfiler包对差异表达基因进行GO分析和KEGG通路富集分析,找到NSIP发病过程中差异表达基因主要参与的生物功能及其集中的信号通路。利用STRING数据库和CYTOSCAPE软件构建蛋白相互作用网络,使用MCODE软件提取蛋白相互作用网络中的子网络模块。 结果3个数据集的差异表达基因做韦恩图得到3个共同差异表达基因。GO富集分析表明NSIP中上调的差异表达基因主要影响RNA剪接、抗病毒感染、对肽的细胞反应等相关的生物过程,富集的分子主要参与细胞组分的囊腔合成分泌、剪接复合体,富集的分子功能主要参与ATP酶活性,受体配体活性及DNA结合转录激活因子活性。NSIP中下调的蛋白主要涉及转移酶活性调节的生物过程。KEGG通路分析表明NSIP中上调的差异表达基因主要参与PI3K-Akt、人类乳头瘤病毒感染及MAPK等信号通路。 结论利用生物信息学筛选出差异表达基因,可能是NSIP发病机制的新靶点,对诊断治疗NSIP具有临床意义。     

Coronavirus genomics and bioinformatics analysis

The drastic increase in the number of coronaviruses discovered and coronavirus genomes being sequenced have given us an unprecedented opportunity to perform genomics and bioinformatics analysis on this family of viruses. Coronaviruses possess the largest genomes (26.4 to 31.7 kb) among all known RNA viruses, with G + C contents varying from 32% to 43%. Variable numbers of small ORFs are present between the various conserved genes (ORF1ab, spike, envelope, membrane and nucleocapsid) and downstream to nucleocapsid gene in different coronavirus lineages. Phylogenetically, three genera, Alphacoronavirus, Betacoronavirus and Gammacoronavirus, with Betacoronavirus consisting of subgroups A, B, C and D, exist. A fourth genus, Deltacoronavirus, which includes bulbul coronavirus HKU11, thrush coronavirus HKU12 and munia coronavirus HKU13, is emerging. Molecular clock analysis using various gene loci revealed that the time of most recent common ancestor of human/civet SARS related coronavirus to be 1999-2002, with estimated substitution rate of 4×10(-4) to 2×10(-2) substitutions per site per year. Recombination in coronaviruses was most notable between different strains of murine hepatitis virus (MHV), between different strains of infectious bronchitis virus, between MHV and bovine coronavirus, between feline coronavirus (FCoV) type I and canine coronavirus generating FCoV type II, and between the three genotypes of human coronavirus HKU1 (HCoV-HKU1). Codon usage bias in coronaviruses were observed, with HCoV-HKU1 showing the most extreme bias, and cytosine deamination and selection of CpG suppressed clones are the two major independent biological forces that shape such codon usage bias in coronaviruses.     

基于生物信息学方法分析雌激素受体相关基因在女性结核病患者中的表达及意义

目的　探索女性结核病患者雌激素受体相关联的基因并进行实验验证。方法　下载GSE114911、GSE54992、GSE83456 3个数据集的基因表达谱。使用R软件探索来自女性的结核组织样本与正常组织样本之间的差异基因。在线数据库DAVID用于差异基因的富集分析。使用相互作用基因/蛋白质检索的搜索工具和Cytoscape软件对雌激素受体基因和差异基因进行网络构建。取我院女性肺结核患者肺结核组织和正常肺组织标本,运用实时定量PCR、Western blot检测关键基因在肺结核组织和正常肺组织中的表达水平。结果　3个数据集的交集显示了24个差异基因。使用GO功能注释将24个差异基因分为生物学过程、分子功能和细胞组分3个类别。随后进行了KEGG分析,总共有10个差异基因和雌激素受体密切相关。其中,CCL20、CXCR3与雌激素受体关联最为密切的基因。运用实时定量PCR发现,肺结核组织样本中的CCL20 mRNA表达水平为2.56±0.34,低于配对的正常肺组织的7.88±0.51（t=-2.375,P=0.003）,CXCR3 mRNA表达水平为8.35±1.76,高于配对的正常肺组织的1.24±0.34（t=1.384,P=0.008）;Western blot验证结果与实时定量PCR结果趋势一致。结论　本研究通过多个数据库对CCL20、CXCR3进行生物信息学分析,发现雌激素受体相关基因可能在女性结核病中发挥作用,为结核病的分子机制提供新的见解。