胃癌患者p53基因突变的检测及其临床意义

目的:探讨胃癌患者癌组织及外周血p53基因突变表达情况,评价p53基因作为胃癌患者术后预后判定、转移监测及指导临床治疗的应用价值。方法:利用聚合酶链反应单链构像多态性分析法(PCRSSCP)和银染技术检测32例胃癌患者外周血、癌旁正常组织、癌组织中p53基因外显子5、6、7、8位点及20例健康人外周血p53基因的突变情况,并比较不同组织类型、不同分期、有无淋巴结转移胃癌患者p53基因的突变率。结果:32例胃癌患者癌旁正常组织和20例正常人外周血中未检出p53基因突变;胃癌患者癌组织中的p53基因突变率为37.5%(12/32),与癌旁正常组织无相比差异有统计学意义(P<0.05);有淋巴结转移患者的胃癌组织p53基因突变高于无淋巴结转移患者(P<0.05);胃癌患者外周血p53基因突变率为15.6%(5/32),外周血中p53基因突变阳性者其相应癌组织p53基因突变均为阳性,经过3个月随访,其中有1例确诊为肝转移。不同组织类型不同分期胃癌患者p53基因突变率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:p53基因突变对胃癌患者术后预后判定、转移监测及指导临床治疗有一定的意义。     

β-连环蛋白在胃癌组织中的表达

目的了解β-连环蛋白(β-catenin)基因在胃癌组织中的突变情况及其作用。方法以35例新鲜胃癌标本和10例癌旁组织中提取的DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)法对β-catenin的exon3基因突变进行筛选,对筛选阳性标本进行DNA序列测定。采用PV-9000免疫组化两步法检测β-catenin蛋白表达。结果 1例分化不良型胃癌组织中检测到β-catenin exon3基因突变,表现为编码C处单碱基插入突变。癌旁组织β-catenin蛋白连续性表达于细胞膜上;胃癌组织中β-catenin蛋白在细胞膜表达明显减弱甚至消失,7例(20%)在胞浆、胞核内异常蓄积。结论β-catenin基因突变可能不是胃癌肿瘤演进过程中主要的事件。     

应用非同位素aPCR-SSCP法检测P53基因突变

建立一种非同位素的不对称聚合酶链反应－单链构象多态性技术（ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ）：通过不对称ＰＣＲ（ａＰＣＲ）获得单链，普通ＰＡＧＥ电泳分离，经银染快速准确检出突变；应用这种方法，研究了４株鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１，ＣＮＥ２，ＨＫ１和ＳＵＮＥ１中肿瘤抑制基因Ｐ５３基因突变，证实ＣＮＥ１，ＣＮＥ２在第８外显子，ＨＫ１在第５外显子有突变，并发现新建立的细胞株ＳＵＮＥ１存在第８外显子的突变。     

用PCR-SSCP及DNA测序法研究胃癌p53基因突变

目的 探讨p53基因突变与人类胃癌发生的关系。方法 运用PCR、PCR－SSCP结合银染法对25例胃癌组织p53基因第4、第5－6和第7外显子进行突变检测;运用双脱氧链终止法对第7外显子阳性突变标本进行DNA测序。结果 在25例胃癌组织中检出突变5例,突变率为20％;在第7外显子阳性突变标本中发现了18bp的大片段缺失。结论 p53基因突变与人类胃癌的发生具有明显相关性,并且这种突变可能不仅仅局限于点突变,大片段缺失也是p53基因突变方式之一。     

急性非淋巴细胞白血病N－ras基因突变的研究

目的：探讨Ｎ－ｒａｓ基因突变在急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）中的作用及其意义。方法：用聚合酶链反应－单链构像多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＮ）分析法检测３５例ＡＮＬＬ患者Ｎ－ｒａｓ基因突变。结果：初发ＡＮＬＬ４／１５例、复发ＡＮＬＬ３／１０例、缓解ＡＮＬＬ１／１０例有Ｎ－ｒａｓ基因突变。结论：Ｎ－ｒａｓ基因突变与ＡＮＬＬ发生和发展有一定相关性。初步随访表明Ｎ－ｒａｓ基因突变可作为一种分子生物学标志，用于ＡＮＬＬ患者疗效预测和微小残留病（ＭＲＤ）检测。     

中国先天性心脏病患者TBXl基因突变的研究

目的 检测中国先天性心脏病患者TBX1基因突变以探讨TBX1基因突变与非综合征心脏畸形发生的相关性.方法 应用聚合酶链反应-单链构像多态性(PCR-SSCP)技术对73例先天性心脏病患者和70例健康人样本的TBX1基因进行突变分析.结果 先天性心脏病患者和对照组中均检测到928G→A核苷酸变异和933A→G核苷酸变异,经X2检验,928G→A和933A→G核苷酸变异的频率在先天性心脏病患者和对照组之间差异均无统计学意义.结论 在非综合征心脏畸形的发病机制中,TBX1基因突变可能不占主导地位.     

人原发性食管癌组织中多种抑癌基因的研究

应用ＰＣＲ扩增与直接测序技术，分析１０例食管癌和癌旁组织标本中多个抑癌基因ｐ５３、Ｒｂ、ＡＰＣ和ＭＣＣ的突变与丢失。结果：１０例中６例有ｐ５３基因突变；５例有Ｒｂ基因改变；３例有ＡＰＣ改变；３例有ＭＣＣ基因改变；８例食管癌标本中至少有一种抑癌基因有改变；６例至少有两种或多种抑癌基因改变，１例癌旁组织中也有两个抑癌基因改变。结果表明，食管癌癌变与多个抑癌基因变化的累积有关。     

人乳头瘤病毒感染、p53 基因突变与子宫颈癌的相关性研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）、单链构像多态性（ＳＳＣＰ）分析银染色法检测了６１例子宫颈癌、５例子宫颈间变、１４例慢性子宫颈炎组织中１６、１８型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ１６、１８）感染及ｐ５３基因５、６、７、８外显子的变异。结果显示，子宫颈癌、子宫颈间变及慢性子宫颈炎组织中ＨＰＶ１６、１８阳性率分别为８２％、４０％及１４．３％（Ｐ＜０．０５），子宫颈癌组织中ｐ５３基因突变阳性率为２０％，而子宫颈间变及慢性子宫颈炎组织中未见有突变，其中１２例突变阳性的癌组织中９例呈ＨＰＶ阴性，３例呈ＨＰＶ阳性。提示ＨＰＶ１６、１８感染在子宫颈癌发生中起重要的病因学作用；ｐ５３基因变异可能是部分子宫颈癌变的一个重要原因；高危ＨＰＶ除了通过Ｅ６／ｐ５３蛋白复合物形成使ｐ５３蛋白失活的致癌途径外，可能还存在通过ｐ５３基因突变的致癌途径。     

肿瘤抑癌基因PTEN在骨及软组织肿瘤中的突变

目的：探讨肿瘤抑癌基因PTEN在骨及软组织肿瘤发生中的作用。方法：应用聚合酶链反应（PCR）分析骨及软组织肿瘤患者110例肿瘤标本,3个肿瘤细胞系PTEN基因第4-9外显子有无纯合性缺失。应用单链构象多态性分析（SSCP）及基因测序技术观察有无基因突变。对照为瘤旁正常组织。结果：PTEN基因第4-9外显子经扩增后均有产物,无基因纯合性缺失改变。SSCP分析未发现变异带,无基因突变。但外显子8表现出两种不同带型,该基因存在多态性,6例肿瘤在内含子8距拼接部32bp处存在两种不同碱基,基因型为g/t。结论：在DNA水平肿瘤抑癌基因PTEN在骨及软组织肿瘤的发生中不起作用;该基因在国人中存在多态性。     

用PCR—SSCP方法探讨ras基因,p53基因突变与喉癌的关系

目的：研究ｒａｓ基因、ｐ５３基因突变与喉鳞状细胞癌发病的关系。方法：应用多聚酶链反应－单链构像多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法分析４０例喉鳞状细胞癌Ｈ－ｒａｓ,Ｋ－ｒａｓ,和Ｎ－ｒａｓ基因的第１２密码子,ｐ５３基因第５,７外显子中点突变的情况。结果：Ｈ－ｒａｓ基因突变９例,突变率为２２．５％（９／４０）;Ｋ－ｒａｓ基因突变８例,突变率为２０％（８／４０）,Ｎ－ｒａｓ基因突变５例,突变率为１２．５     

胃癌组织中多种癌基因变异的观察

目的 探索胃癌癌变过程中多种癌基因和抑癌基因变异的规律。方法用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＰＣＲ／ＳＳＣＰ和ＤＮＡ测序技术，检测３３例胃癌手术标本中原癌基因ｃ－ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｈａ－ｒａｓ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＡＫＴ-２的扩增和重排，以及抑癌基因ｐ５３、ｐ１６、ｎｍ２３－Ｈ１的突变和缺失。结果大多数胃癌组织（７０％）存在１个或１个以上的基因改变。不同个体基因异常的种类和方式不同。其中ｃ－ｍｅｔ基因重排２／３３例（６％），扩增８／３３例（２４％）。ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增１／３３（３％），ＡＫＴ－２扩增２／１８例（１１％）。抑癌基因ｐ１６的纯合性缺失６／３３例（１８％），ｎｍ２３－Ｈ１和ｐ５３的杂合性缺失分别是５／１７例（２９％）和２／１３例（１６％）。ｐ５３第５～８外显子点突变的检出率为２０／３３例（６１％）。癌基因的扩增和重排多发生于胃癌进展期，而ｐ５３基因的点突变可发生于癌变各期。结论胃癌癌变是多基因异常累积所引起的渐进性过程，基因改变的数目、种类及方式与肿瘤的恶性表型密切相关。     

原发性散发性肾透明细胞癌患者癌组织中抑癌基因VHL突变的研究

目的 探讨国人原发性散发性透明细胞癌中ＶＨＬ抑癌基因突变及其意义。方法 采用聚合酶链反应及单链构像多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和测序等方法,分析了２０例原发性散发性肾透明细胞癌中Ｖon Hippel-Lindau(VHL）抑癌基因突变的情况。结果 ２０例癌组织中１１例有ＶＨＬ基因突变,突变率为５５％。这些突变主要发生在第１,２,３号外显子的后１／３区,其中６例缺失,２例插入３例误义突变。结论 国人原发性散发性肾透明细胞癌中存在ＶＨＬ基因的突变。ＶＨＬ基因可作为临床诊断指标,并可望成为肾透明细胞癌基因治疗的重要目的基因。     

胃癌患者血浆DNA p53基因突变的检测

目的:探讨胃癌患者血浆循环核酸p53基因突变检测的可行性,研究基因突变与胃癌的发生、发展、预后的关系。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增p53基因外显子7,用变性高效液相色谱技术(DHPLC)对产物进行突变分析,再与各生物参数进行相关性研究。结果:在34例胃癌患者中11例(32.4%)发生p53基因突变,突变率与组织类型、组织分化程度有关(P<0.05),与临床分期、淋巴结转移及远处转移无关(P>0.05)。结论:检测胃癌患者血浆循环核酸p53基因突变,对胃癌的恶性程度、预后评估有一定的临床价值。而DHPLC可作为一种快速简便的基因检测手段。     

脑胶质瘤组织PTEN mRNA表达及其基因突变SSCP分析

目的：探讨PTEN基因表达水平及其基因突变与脑胶质瘤的发生及恶性进展的关联性。方法：选取脑胶质瘤组织15例,以4例非胶质瘤脑组织为对照,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测脑胶质瘤组织PTEN mRNA表达水平,采用单链构象多态性分析法（SSCP analysis）快速筛查脑胶质瘤组织PTEN基因突变状况。结果：RT-PCR结果,脑胶质瘤组织PTEN mRNA表达水平(0.063±0.006)较对照组(0.126±0.015)明显降低（P<0.05）。经单链构象多态性分析, 脑胶质瘤组织PTEN基因外显子8、9未检测到突变,但其中1例PTEN基因外显子5的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示电泳带飘移,考虑可能为杂合子突变。结论：PTEN基因低表达及基因突变可能对胶质瘤发生、发展有促进作用。     

胃癌中p16INK4a和RB基因甲基化状况及其表达

目的:研究胃癌组织中p16INK4a和视网膜母细胞瘤易感基因(RB)启动子区域的甲基化状况,并探讨基因异常甲基化与蛋白表达及其临床病理指标的关系.方法:采用甲基化特异性PCR方法对81例胃癌和10例正常胃黏膜中p16INK4a和RB启动子区域甲基化状况进行检测,并采用免疫组织化学方法对p16INK4a和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)表达情况进行相应检测.结果:胃癌中p16INK4a和RB基因的甲基化率分别为37%(30/81)和42%(34/81);胃癌p16INK4a蛋白和pRb表达阳性率分别为54%(44/81)和90%(73/81).10例正常胃黏膜中均未检测到p16INK4a和RB异常甲基化,而且其相应蛋白表达均为阳性.p16INK4a甲基化状况与其蛋白表达有相关性,但p16INK4a甲基化状态与肿瘤分化程度、淋巴结转移、性别及年龄均不相关.RB甲基化状态与pRb表达、肿瘤分化程度、性别及年龄无相关性,但与淋巴结转移相关.结论:p16INK4a和RB异常甲基化是胃癌细胞常见的分子事件,可能参与了胃癌的发生发展过程.RB异常甲基化与胃癌淋巴结转移相关,提示RB甲基化检测对于分析胃癌淋巴结转移情况可能有一定参考价值.p16INK4a基因启动子区域高甲基化是其蛋白表达抑制的重要机制.     

外源性PTEN基因诱导人乳腺癌MDA468细胞凋亡

目的 研究外源性PTEN基因依赖其磷酸酶活性诱导人乳腺癌MDA468细胞凋亡。方法 应用分子克隆技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN,以脂质体转染法转染人乳腺癌细胞株MDA468,对照组为pcDNA3．1(-)空载体质粒转染组和未转染组。应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因的表达;在表皮生长因子(EGF)的诱导下,采用Western印迹方法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB／Akt)的表达及细胞在黏附和失黏附状态下的黏着斑激酶的表达;膜联蛋白V-FITC和P1双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 RT-PCR、Western印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及PTEN蛋白表达,且在EGF的诱导下,p-Akt及p-FAK蛋白表达下调。流式细胞术则显示其凋亡率达21．68％。结论 外源性PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导人乳腺癌MDA468细胞凋亡。     

胃癌中PTEN基因异常甲基化的检测

目的探讨抑癌基因第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白(PTEN)启动子区域甲基化状况与胃癌的关系。方法采用甲基化特异的PCR(MSP)法检测70例胃癌组织及相应癌旁组织中PTEN启动子区域甲基化状态。结果胃癌组织检测到程度不等的甲基化,其中低分化胃癌甲基化发生率为62.5%,与高中分化胃癌甲基化发生率(20.0%、22.2%)有显著性差异(P<0.05)。并且有淋巴结转移的19例胃癌组织中,有12例PTEN基因启动子甲基化,远高于无淋巴结转移组(P<0.05)。癌旁正常组织未检测到甲基化。结论PTEN基因启动子的甲基化与胃癌的发生、转移有关。PTEN甲基化是胃癌患者诊断及预后的候选标志物之一。     

胃肠恶性肿瘤及其切缘组织中p53基因突变和p53蛋白表达

目的 探讨胃肠道恶性肿瘤及其切缘组织中p53基因突变和p53蛋白表达与手术切缘的安全性关系。方法 用PCR－SSCP和免疫组化S－P方法检测20例胃癌和10例大肠癌标本和切缘组织中p53基因突变和p53蛋白表达情况。结果 （1）胃肠道恶性肿瘤组织中有很高的p53基因突变率（63％）和p53蛋白阳性表达率（53．33％）。（2）肿瘤组织中p53蛋白表达是切缘组织中p53蛋白表达的前提。（3）p53基因突变和p53蛋白表达随肿瘤切缘距离的增加而呈现极显著的递减趋势。结论 就p53基因突变和p53蛋白表达而言,距离肿瘤边缘5cm可定为肿瘤的分子切缘。