Survivin基因沉默对裸鼠人卵巢癌细胞移植瘤凋亡的影响

目的探讨survivin基因沉默对人卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法将重组survivin shRNA plasmid转染人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,通过裸鼠移植瘤实验比较survivin基因沉默对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测与凋亡密切相关的cytochrome-c、caspase-9和caspase-3基因的表达。结果裸鼠移植瘤实验显示,与对照组(空载体组和未转染组)相比,survivin shRNA plasmid转染组人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长速度减慢,肿瘤体积缩小(P<0.05);荧光定量PCR和蛋白印迹法结果都显示,与对照组相比,survivin shRNA plasmid转染组cytochrome-c、caspase-9和caspase-3的表达明显升高(P<0.05)。结论 survivin基因沉默可通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长。     

shRNA沉默IDO基因的表达对裸鼠卵巢癌种植瘤生长的影响

目的 研究短发夹RNA(shRNA)沉默吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因表达对裸鼠卵巢癌种植瘤生长的影响.方法 shRNA沉默IDO基因表达质粒和空白质粒分别稳定转染至人卵巢癌细胞株SKOV-3中,应用Western blot检测IDO在SKOV-3、SKOV-3/Mock和SKOV-3/shIDO细胞中的表达,MTT检测肿瘤细胞体外生长速度,观察各组裸鼠体内卵巢癌种植瘤的生长速度.结果 IDO蛋白在SKOV-3和SKOV-3/Mock细胞中有表达,而在SKOV-3/shIDO细胞中表达明显被抑制.SKOV-3、SKOV-3/Mock和SKOV-3/shIDO细胞在体外生长速度无统计学差异(P＞0.05).与SKOV-3和SKOV-3/Mock细胞比较,SKOV-3/shIDO细胞接种的肿瘤生长缓慢(P＜0.05).结论 应用shRNA沉默IDO基因表达质粒稳定转染SKOV-3细胞,对卵巢癌细胞体外生长速度无影响,但可抑制裸鼠皮下卵巢癌种植瘤的生长.因此,IDO有望作为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

靶向生存素基因的shRNA抑制膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长

目的 观察稳定转染靶向生存素(survivin)基因短发夹RNA(shRNA)对膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 将靶向生存素基因的shRNA真核表达载体转染人膀胱癌细胞T24并获得稳定的单克隆细胞,实时定量PCR检测转染后生存素mRNA表达的变化;分别将转染和未转染细胞种植于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况;通过免疫组化检测肿瘤组织生存素蛋白表达的差异.结果 RNA干扰使T24细胞生存素表达下调92.86%;未转染组在20～29 d均形成体积超过2000 mm3的肿瘤,转染组在43 d时经病理证实3只裸鼠形成肿瘤,最大体积62.5 mm3;免疫组化显示转染组形成的肿瘤生存素蛋白表达明显减弱.结论 靶向生存素基因的shRNA明显下调了生存素表达,并抑制了膀胱癌细胞T24裸鼠移植瘤的生长.     

RNA干扰沉默Ki67基因对裸鼠肾癌细胞移植瘤生长及凋亡的影响

目的应用RNA干扰(RNAi)技术沉默Ki67基因,探讨其对裸鼠人肾癌细胞移植瘤细胞生长及凋亡的影响。方法建立裸鼠人肾癌细胞移植瘤模型,随机分组,于肿瘤内分别注射生理盐水0.2 ml(C组)、pSilencer空质粒20μg/只(P组)、pSilencer-Ki67重组质粒20μg/只(PK组),每隔2天注射一次,共7次。取肿瘤测量体积,免疫组化染色检测Ki67的表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果 PK组移植瘤体积明显小于C、P组,移植瘤细胞Ki67表达率也明显降低,肿瘤细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论应用RNAi技术沉默Ki67基因可以降低人肾癌细胞裸鼠移植瘤Ki67基因表达,同时引起细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。     

Her-2/neu siRNA表达质粒对前列腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察Her-2/neu siRNA表达质粒对前列腺癌裸鼠移植瘤生长的影响.方法 40只裸鼠皮下接种人前列腺癌PC-3M细胞,分成4组,每组10只.于形成的肿瘤内分别注射转染试剂FuGene HD与Her-2/neu siRNA表达质粒(A组)或无关非同源性序列质粒(B组)的复合物、转染试剂FuGene HD(C组)及生理盐水(D组),每周给药1次,连用4周.首次给药4周后取出肿瘤,测量肿瘤长短径及重量,流式细胞术检测肿瘤细胞周期及细胞凋亡,免疫组化方法 检测肿瘤组织中核增殖抗原(Ki67).结果 A组裸鼠移植瘤体积及重量均明显低于其它三组,凋亡指数显著高于其它三组(P<0.05).A组肿瘤细胞增殖指数显著低于C组(P<0.01).A组肿瘤组织中Ki67阳性的细胞数明显少于其它三组(P<0.01).结论 Her-2/neu siRNA表达质粒对裸鼠前列腺癌移植瘤的生长有抑制作用,并显著促进移植瘤细胞的凋亡.     

慢病毒介导的细胞分裂周期相关蛋白 2基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨应用慢病毒介导小干扰核糖核酸(siRNA)沉默细胞分裂周期相关蛋白2(CDCA2)基因对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blotting)法分别检测人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A与乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA及蛋白表达.构建慢病毒表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞,实验分为对照组、Lv-NC组、Lv-siRNA-CDCA2组.采用噻唑蓝(MTT)实验及克隆形成实验检测沉默CDCA2表达对细胞增殖能力的影响;采用流式细胞仪检测沉默CDCA2表达对细胞凋亡能力的影响.Western blotting法检测细胞周期素D1(Cyclin D1)、CDK4、P21、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)蛋白表达.采用裸鼠移植瘤实验观察Lv-siRNA-CDCA2对移植瘤体积及体质量的影响.结果 乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA[(2.18±0.13)、(1.56±0.09)、(1.83±0.10)比(1.02±0.06)]及蛋白表达水平[(1.13±0.15)、(0.56±0.08)、(0.79±0.11)比(0.23±0.04)]与MCF-10A相比显著升高(P<0.05),乳腺癌MCF-7细胞中CDCA2的表达水平升高最为显著;与Lv-NC组相比,Lv-siRNA-CDCA2组MCF-7细胞增殖活性与克隆形成率显著降低(P<0.05),而细胞凋亡率显著升高(P<0.05),可促进P21、Bax表达(P<0.05),而抑制Cyclin D1、CDK4、Bcl-2表达(P<0.05);与Lv-NC组比较,Lv-siRNA-CDCA2组移植瘤体积和体质量均显著降低(P<0.05).结论 慢病毒介导的CDCA2基因沉默可乳腺癌细胞细胞增殖,诱导细胞凋亡,并抑制肿瘤生长.     

顺铂联合8-硝基白杨素对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的 研究顺铂联合8-硝基白杨素对人卵巢癌COC1细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法 建立人卵巢癌COC1细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,每组5只：生理盐水组、8-硝基白杨素组、顺铂组、8-硝基白杨素+顺铂组。观察各组裸鼠移植瘤体积、重量及裸鼠体质量的变化;裸鼠血清乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、肌酐值和外周血白细胞计数的变化;FCM测定瘤组织细胞凋亡率;Western blot分析瘤组织细胞凋亡的可能分子生物学机制。结果 与顺铂组和8-硝基白杨素组相比,顺铂联合8-硝基白杨素联合作用COC1细胞裸鼠移植瘤后,移植瘤的体积、移植瘤的重量均明显降低(P<0.05);与顺铂组相比,顺铂联合8-硝基白杨素联合组裸鼠体质量无明显差异(P>0.05),裸鼠血清乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、肌酐值和外周血白细胞计数无明显差异(P>0.05);顺铂和8-硝基白杨素联合作用COC1细胞16 d后,COC1细胞发生凋亡,同时bcl-2蛋白表达降低,caspase-3蛋白表达增高。结论 顺铂联合8-硝基白杨素通过降低bcl-2蛋白表达,活化caspase-3蛋白表达来抑制人卵巢癌COC1细胞裸鼠移植瘤生长。     

重组质粒白细胞介素-24对人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤的生长及血管生成的抑制作用研究

目的探讨基因重组质粒白细胞介素(IL)-24对人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤的生长及血管生成的抑制作用。方法对4周龄裸鼠注射人宫颈癌细胞株Hela细胞建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型,把造模成功的裸鼠分为磷酸盐缓冲液(PBS)、空载质粒、基因重组质粒IL-243组,分别向瘤内注射PBS、pDC316+Lipofec-tamine2000、pDC316-hIL-24+Lipofectamine2000,比较干预后各组移植瘤的体积及微血管生成的情况。结果 IL-24基因成功转染入实验组肿瘤细胞并在其中成功表达,移植瘤的质量组间比较差异有统计学意义(P<0.01),PBS组、空载质粒组的移植瘤质量高于基因重组IL-24组(P<0.01),PBS组、空载质粒组移植瘤质量差异无统计学意义(P>0.05);PBS组、空载质粒组微血管密度显著高于重组IL-24组(P<0.01),但PBS、空载质粒组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-24能够抑制宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤的生长,抑制肿瘤新生血管生长是抑制肿瘤生长的机制之一。     

AQP1基因沉默对前列腺癌PC-3细胞的影响

目的:探讨水通道蛋白1(AQP1)基因沉默对在前列腺癌PC-3细胞的作用.方法:培养PC-3细胞至对数生长期,随机分为质粒转染组和质粒空白组.针对AQP1基因设计合成小片段RNA,并构建高效表达载体.利用转染试剂Lipo-fectamineTM2000用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染入PC-3细胞.RT-PCR检测PC-3细胞AQP1mRNA的表达情况及激光共聚焦观察室观察、拍照AQP1表达的情况,转染后72h.将鼠龄为6周的60只BALB/C-nu/nu雄裸鼠随机分成两组,其中正常对照组30只,转染组30只.转染组把转染后的前列腺癌PC-3细胞注射裸鼠腋窝处皮下;对照组把未经转染的前列腺癌PC-3细胞注射到裸鼠腋窝处皮下.每日观察肿瘤生长及体重情况,裸鼠饲养6周处死,完整取出移植瘤瘤体测量体积和重量.结果:与质粒空白组相比,转染组应用RNA干扰技术后AQP-1在前列腺癌PC-3细胞系中mRNA的水平降低,与对照组相比,转染组裸鼠移植瘤体积为(573.39±175.24) mm3明显小于对照组(1482.50±327.86) mm3,(P＜0.05).转染组肿瘤重量为(0.55±0.11)g明显小于对照组(1.31±0.29)g,差别具有统计学意义(P＜0.05).结论:AQP-1广泛的表达在正常前列腺组织和前列腺癌组织中,对内环境稳态起着重要的作用.更多的AQP-1促进了前列腺癌细胞的增长,抑制AQP-1的表达可以使前列腺癌移植瘤生长减慢,体积减小.     

HER-2/neu基因沉默对子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞增殖及其对孕激素敏感性的影响

目的研究shRNA表达质粒稳定转染,靶向沉默HER-2/neu基因对子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞增殖及其对孕激素敏感性的影响。方法根据HER-2/neumRNA的序列设计和合成两条shRNA.分别将其与质粒(pSilencer4.1CMV neo,Ambion)连接,并将连接好的质粒通过LipofectamineTM2000(invitrogen)转染Ishikawa细胞株。应用含有250μg·mL-1G418的DMEM培养基筛选稳定转染克隆。用RT-PCR法及Western blot分别检测稳定转染细胞HER-2/neumRNA及p185蛋白表达水平,用Annexin-V检测细胞凋亡率。用10μg.μL-1孕激素培养细胞72小时后,用MTT法分别检测转染细胞及未转染细胞的增殖率。结果转染特异性shRNA表达质粒组Ishikawa细胞HER-2/neumRNA及p185蛋白表达水平明显低于对照组细胞。细胞增殖率明显降低而细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。用10μg.μL-1孕酮培养细胞72小时后,转染特异性shRNA的细胞组细胞增殖率明显低于未转染细胞组(P<0.05)。结论RNA干扰可以明显降低Ishikawa细胞株HER-2/neumRNA及185蛋白的表达,从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。HER-2shRNA还可以增加Ishikawa细胞株对孕激素的敏感性,与孕激素存在协同效应。     

诺斯卡品逆转人卵巢癌裸鼠移植瘤对顺铂耐药的作用及机制

目的：探讨微管抑制剂诺斯卡品（ NOS ）逆转人卵巢癌细胞株 SKOV3/DDP 裸鼠皮下移植瘤对顺铂（ DDP）耐药的作用及其机制。方法建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,分为对照组、DDP组、NOS组、NOS与DDP联合组,每组6只。观察各组裸鼠饮食和精神状态,测量裸鼠的体重及移植瘤的体积,并绘制肿瘤生长曲线。用网搓法制备单细胞悬液,采用流式细胞术检测移植瘤细胞周期和细胞凋亡率的变化,细胞中X链锁凋亡抑制蛋白（ XIAP ）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和生存素（Survivin）蛋白表达。结果联合组裸鼠移植瘤体积明显小于对照组和其他用药组（ P ＜0ⅱ．05）。与对照组和DDP组比较,联合组皮下移植瘤细胞凋亡率显著增加（ P ＜0．05）,G2/M期细胞比例增多（ P ＜0．05）,细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白表达降低（ P ＜0．05）, Caspase-3蛋白表达升高（ P ＜0．05）。结论 NOS增加了移植瘤细胞对DDP的敏感性,逆转其对DDP的多药耐药,其机制可能与XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白表达的下调,Caspase-3蛋白表达的上调有关。     

大肠癌裸鼠移植瘤实验模型的建立及T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1封闭载体的治疗作用

目的 通过建立大肠癌SW620细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1( Tiam1)封闭载体在动物体内的治疗作用.方法 构建编码一条短发夹RNA的Tiam1质粒表达封闭载体,并用之转染SW620细胞;应用Hoechst 33342荧光染色技术观察细胞形态学变化.将皮下接种SW620细胞的裸鼠分为3组,每组8只,在接种后第2周分别瘤内注射生理盐水(对照组)、HK错配链(HK组)和Tiam1封闭载体(Tiam1组).第16天处死各组裸鼠,取出移植瘤移重.结果 通过DNA测序证实封闭载体构建成功.SW620细胞经Tiam1封闭载体转染后,细胞核可见凋亡小体.对照组平均移植瘤重量(2.84±0.27)g,HK组(2.89±0.18)g,Tiam1组(1.47±0.20)g,Tiam1组与其他2组比较差异有统计学意义(P＜0.01),而HK组和对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 所构建的Tiam1封闭载体能有效抑制大肠癌裸鼠皮下移植瘤生长.     

白细胞介素-24联合顺铂对宫颈癌裸鼠移植瘤抑制及化疗增敏作用研究

目的探讨基因重组质粒pDC316-hIL-24、顺铂(DDP)单独及联合应用对人宫颈癌裸鼠移植瘤抑制及化疗增敏作用。方法将人宫颈癌Siha细胞株接种BALB/c雌性裸鼠,建立动物模型。随机将造模成功的裸鼠分为:PBS组、空质粒组、白细胞介素(IL)-24组、半量顺铂组、全量顺铂组、IL-24+半量顺铂组、IL-24+全量顺铂组共7组。观察裸鼠一般状况及肿瘤生长情况,实验结束后采用聚合酶链反应(PCR)法测定移植瘤中IL-24mRNA的表达,免疫组织化学染色法观察移植瘤增殖细胞核抗原(PCNA)的变化。结果①IL-24基因成功转染及表达。②IL-24+全量顺铂组、IL-24+半量顺铂组、IL-24组、全量顺铂组抑瘤率分别为74.0%、63.9%、33.9%、36.3%高于PBS、空质粒、半量顺铂组(P<0.01),其中IL-24+全量顺铂组、IL-24+半量顺铂组抑瘤率明显优于其他组,且IL-24+半量顺铂组其生命活动和体重无明显改变,后3组抑瘤率差异无统计学意义(P>0.05)。③PBS组、空质粒组、IL-24组、半量顺铂组、全量顺铂组、IL-24+半量顺铂组、IL-24+全量顺铂组裸鼠肿瘤组织中PCNA指数分别为0.774±0.087、0.749±0.064、0.589±0.017、0.731±0.076、0.641±0.101、0.462±0.039、0.400±0.091(P<0.01)。结论 IL-24、顺铂联合应用可提高抗宫颈癌裸鼠移植瘤生长作用,其作用可能与协同抑制了肿瘤组织内PCNA的表达有关。     

Omi/HtrA2短发夹RNA在大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用及机制

目的探讨Omi/HtrA2短发夹RNA(shRNA)对缺氧/复氧诱导大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡的作用及机制。方法细胞分为5组:正常组(常规培养),模型组(缺氧/复氧组)、HK组(转染重组质粒Pgenesil-1/HK)、shRNA1组(转染Pgenesil-1/Omi/HtrA2shRNA1)、shRNA2组(转染Pgenesil-1/Omi/HtrA2shRNA2)。用荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,Westernblot检测各组Omi/HtrA2、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)-3/-9蛋白表达,比色法测定caspase-3/-9的活性。结果在荧光显微镜下,转染组细胞均可见绿色荧光,未转染组未见绿色荧光。与模型组相比,shRNA1组和shRNA2组Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达明显减少(P<0.01)。模型组和HK组、shRNA1组和shRNA2组之间Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达差异无统计学意义。与正常组相比,模型组Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达明显增强(P<0.01)。结论Pgenesil-1/Omi/HtrA2shRNA1和Pgenesil-1/Omi/HtrA2shRNA2能明显减少缺氧/复氧诱导的NRK-52E中Omi/HtrA2蛋白的表达。通过抑制procaspase-9的活化,进而减少了下游procaspase-3的激活,最终减轻了缺氧/复氧诱导的NRK-52E的凋亡程度。     

重组人促红细胞生成素对卵巢癌细胞EPOR表达及肿瘤增殖的影响

目的通过检测卵巢癌细胞中的促红细胞生成素受体（EPOR）表达，以及r—HuEPO对卵巢癌细胞增值的影响，探讨r—HuEPO在癌性贫血治疗中的意义。方法RT—PCR方法检测人卵巢癌细胞株HO-8910EPOR mRNA的表达及卵巢癌细胞增值影响。结果卵巢癌细胞表面有EPOR的表达。r—HuEPO干预后卵巢癌细胞增值受到抑制（P〈0．01）。结论EPOR在卵巢癌细胞株HO8910有表达，r—HuEPO可抑制卵巢癌细胞的增值发生，提示r—HuEPO可用于卵巢癌伴发的贫血的治疗。     

Rb对HepG2肝癌细胞系增殖的影响

目的研究Rb基因及其产物对HepG2肝癌细胞系增殖的影响。方法转染pRb质粒进入HepG2肝癌细胞系,用MTT法检测转染前后细胞增殖的变化,并将转染pRb质粒的HepG2肝癌细胞接种在裸鼠皮下建立肝癌裸鼠种植瘤模型,观察转染pRb质粒前后裸鼠体内种植瘤生长的变化。结果转染pRb质粒的HepG2肝癌细胞与未转染pRb质粒者相比细胞增殖受到抑制。成功建立HepG2肝癌细胞裸鼠体内种植瘤模型,转染pRb质粒的HepG2肝癌细胞的裸鼠体内种植瘤生长受抑制。转染组种植瘤体积第4周(429.7±114.987)mm3,第5周(657.90±187.27)mm3,第6周(892.56±258.73)mm3。结论Rb在体内和体外均能抑制肝癌细胞的增殖。     

米非司酮对乳腺癌细胞系MCF-7/ADM裸鼠移植瘤耐药逆转作用

目的：探讨米非司酮对乳腺癌细胞系MCF-7/ADM裸鼠移植瘤耐药逆转作用。方法：以人乳腺癌细胞系MCF-7/ADM建立耐阿霉素人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,将成瘤裸鼠随机分为空白对照组,米非司酮组（MIF组）,阿霉素组（ADM组）,米非司酮联合阿霉素组（MIF＋ADM组）。测量裸鼠移植瘤横径与短径,计算移植瘤体积,绘制生长曲线。结果：对裸鼠干预处理4周后,MIF＋ADM组移植瘤体积[（232.5149±309.2377）mm3]最低,ADM组[（508.9648±16.2609）mm3]次之,均低于空白对照组移植瘤体积[（962.2309±261.1313）mm3],差异有统计学意义（P〈0.05）;MIF＋ADM组移植瘤体积较单独用药的MIF组及ADM组低,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：米非司酮有逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADM裸鼠移植瘤耐药性的作用。