成人退变性椎间盘髓核细胞体外培养及形态学观察

目的通过对成人退变椎间盘髓核细胞的体外培养和形态学观察,进一步研究细胞因素在椎间盘退变中的作用机制。方法取5例患椎间盘突出症并行椎间盘摘除手术的成人髓核,分离后在培养基中进行髓核细胞培养,细胞染色、逆转录聚合酶链式反应、免疫荧光检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达。结果椎间盘髓核细胞可在体外培养,30d后方可进行传代,最佳的培养条件为胎牛血清/培养基体积分数为10%～20%,pH值7.0。髓核细胞中出现Ⅰ型胶原,并具有较高的表达,Ⅱ型胶原表达微弱。结论成人退变髓核细胞体外培养时间较长,细胞增殖能力低下,特定培养条件的摸索是成功与否的关键。     

pH值对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

[目的]观察不同pH值对体外培养人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为椎间盘退变的预防与治疗提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用甲苯胺蓝和番红O染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用普通培养基(pH值7.4)、酸性培养基(pH值6.8)和酸性培养基(pH值6.8)+Cucl_2(酸质子受体抑制剂)培养24 h,用流式细胞仪测定细胞凋亡,计算细胞凋亡率。[结果]细胞染色结果均为阳性,证明实验中所培养的细胞为髓核类软骨细胞。普通培养基组的凋亡率为(8.86±0.20)%,酸性培养基组的凋亡率为(11.23±0.77)%,酸性培养基+Cucl_2组的凋亡率为(9.60±0.49)%。与其他两组相比,酸性培养基组的凋亡率明显增加(P0.05)。[结论]在低pH值的环境下,人退变椎间盘髓核细胞的凋亡率增加。     

人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察

[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.     

细胞移植治疗椎间盘退行性变的研究概况

目的 综述细胞移植治疗椎间盘退行性变疾病的研究现状. 方法 查阅近年来有关细胞移植治疗椎间盘退行性变疾病的国内外相关文献.进行回顾及综合分析. 结果 将椎间盘源性细胞或BMSCs通过单纯细胞移植、复合胶原蛋白支架移植等方法移植入退变椎间盘内,均能够表达类髓核细胞表型,增加ECM合成,缓解甚至抑制椎间盘进一步退变. 结论 细胞移植是目前治疗椎间盘退行性变疾病较为理想的方法.     

脊索细胞与椎间盘退变关系研究进展

随着年龄的增长,椎间盘退行性变是一类患病率很高、严重影响牛活质最的疾病.椎间盘组织以大量基质为主要组成结构,少最细胞散在分布于其质中.蛋白多糖和胶原是构成椎间盘基质的丰要蛋白质,决定基质结构和功能的完整性,凶而它们的损耗是椎间盘退变的重要因素.脊索细胞埘细胞外基质的合成有重要作用,与椎间盘退变密切相关.笔者着晕从脊索细胞的生物学特性和其促进椎间盘髓核细胞外基质合成的机制等研究进展作一综述.     

大鼠骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养对白介素1β致髓核细胞退变的影响

目的 :观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与髓核细胞(NPCs)共培养对白介素1β(IL-1β)致NPCs退变的影响。方法:在体外分别分离培养大鼠NPCs和BMSCs,分别传至第3代,采用流式细胞仪鉴定BMSCs纯度,分别测定CD29、CD31、CD45、CD90表型。取第3代NPCs分为3组:A组,无IL-1β干预,不与BMSCs共培养,设为对照组;B组,用IL-1β干预NPCs后不与BMSCs共培养;C组,用IL-1β干预NPCs后与BMSCs细胞借由transwell小室间接共培养。IL-1β干预时间和BMSCs共培养时间均为24h,之后取出transwell,将3组NPCs通过实时定量荧光PCR(RT-PCR)观察其解聚蛋白样金属蛋白-4(ADAMTS-4)、解聚蛋白样金属蛋白酶-5(ADAMTS-5)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)基因表达量,同时通过Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)凋亡试剂盒和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)试剂盒观察3组NPCs凋亡情况。结果 :流式细胞鉴定结果显示90%以上的BMSCs表现为CD29、CD90阳性,小于5%的BMSCs表现为CD31、CD45阳性,细胞纯度较好。3组NPCs中ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-13的基因相对表达量:A组为0.98±0.19、1.10±0.08、1.21±0.24,B组为5.23±0.25、6.92±2.33、23.39±0.09,C组为2.31±0.26、3.33±1.52、12.68±0.11,与A组比较,B、C组均明显升高(P0.05),C组与B组比较均明显降低(P0.05)。Caspase-3活性相对表达量A组为1.20±0.18,B组为5.92±0.93,C组为2.33±0.52,与A组比较,B、C组明显升高(P0.05),C组与B组比较明显降低(P0.05)。细胞凋亡率A组为4.2±2.2,B组为17.1±3.7,C组为10.5±2.4,与A组比较,B、C组明显升高(P0.05),C组与B组比较明显降低(P0.05)。结论:与BMSCs共培养可有效降低IL-1β致NPCs退变相关因子的基因表达,减少细胞凋亡;BMSCs可作为种子细胞对椎间盘炎性环境起到"治疗"作用。     

成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定

[目的] 建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观察其形态;测定其细胞周期,探讨传代后髓核细胞生长不佳的原因.[方法] 取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎问盘组织,分离出髓核组织,胰酶和胶原酶消化,DMEM/12培养基培养.倒置相差显微镜观察其形态学特征,流式细胞分析仪检测原代和P2细胞周期.[结果] (1)原代髓核细胞生长良好,7 d后贴壁生长的细胞可达90%.(2)原代细胞凋亡率为(38.10±11.7)%,P2代凋亡率为(44.74±17.6)%,原代S期细胞(7.88±2.1)%,P2 S期细胞(2.76±0.7)%.[结论] 传代后的髓核细胞凋亡率增高,S期细胞减少明显.     

中药促进髓核细胞自噬延缓椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是引发腰痛常见的一种退变性疾病,IDD发生发展的主要原因是髓核细胞受损,自噬作为一种自然的、受机体调节的溶酶体降解途径,通过去除受损的蛋白质和功能失调的细胞器发挥保护作用,对髓核细胞的功能发挥极其重要。近年来,自噬相关基因、蛋白及相关通路陆续被发现和命名,以此更好地引导IDD的治疗进展。越来越多研究发现,中药防治IDD优势明显,疗效确切,调节髓核细胞自噬水平已成为中药防治IDD新的研究方向。因此,本文参考最新相关文献,对中药促进髓核细胞自噬延缓椎间盘退变的研究进展进行综述,为将来临床的诊治和预后研究提供新的思路。     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

人胚椎间盘细胞体外培养模型的建立和鉴定

目的通过建立人胚椎间盘细胞体外培养模型,进一步研究细胞因素在椎间盘退变中的作用机制。方法取4例人体胚胎腰椎间盘,在改良Eagle培养基中建立椎间盘细胞模型,细胞染色、逆转录聚合酶链式反应、免疫荧光检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达进行鉴定。结果椎间盘细胞可在体外培养并进行传代,细胞中Ⅰ、Ⅱ型胶原具有较高的表达,细胞具有较高的分化状态。结论源自胚胎的髓核细胞于体外环境中可以较长时间维持其表型不变,且表型与正常髓核细胞很接近。     

水凝胶人工髓核应用于椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变是造成下背部疼痛的重要原因,其发病机制复杂,应用髓核假体可以较好的模拟自身正常的髓核组织,在临床上取得了较好的短期效果。水凝胶因其出色的力学特性以及不发生免疫排斥反应等优点而成为髓核假体的热门材料。而应用干细胞复合可降解水凝胶再造髓核,也为椎间盘退变的治疗提供了新的思路。     

转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1对体外培养人退变髓核细胞生物学活性的影响

目的：观察在体外培养条件下转化生长因子β1（TGF-β1）和胰岛素样生长因子1（IGF—1）对人退变髓核细胞生物学活性的影响。方法：体外培养人退变髓核细胞，台盼蓝染色法测定活细胞率。将每份髓核细胞样本分为对照组、TGF-β1组和TGF-β1＋IGF—1组。采用考马斯亮蓝法测定TGF—β1和IGF—1干预后第0、2、4、6天细胞内总蛋白含量。采用免疫组织化学和免疫荧光化学染色方法测定细胞在TGF-β1和IGF-1干预后0～6d合成Ⅱ型胶原的情况。结果：体外培养人退变髓核细胞的活细胞率为90％～95％。干预后第4、6天TGF-β1组和TGF-β1＋IGF—1组与对照组比较、TGF-β1＋IGF—1组与TGF-β1组比较细胞内总蛋白含量均显著增加（P〈0.05），TGF—β1＋IGF—1组Ⅱ型胶原的合成较对照组显著增加（P〈0．05）；干预后第6天TGF—β1组和TGF-β1＋IGF—1组与对照组比较、TGF-β1＋IGF—1组与TGF-β1组比较Ⅱ型胶原均显著增加（P〈0.05）。结论：一定浓度的TGF-β1能够促进人退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原，改善其生物学活性，合用TGF-β1和IGF—1上述作用更加明显。     

BMP-2对人退变椎间盘髓核细胞影响的实验研究

[目的]探讨BMP -2对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变推间盘髓核细胞分为2组.A组:加入100 ng/ml BMP -2,B组:加入200 ng/mlBMP -2,C组:对照组,不加干扰因素.通过对试验组和对照组髓核细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.ELISA检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原含量,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖含量.[结果]髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达水平实验组均高于对照组.[结论] BMP-2蛋白可促进退变腰椎间盘细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原,增加细胞活性,恢复椎间盘的功能和活性,因此运用BMP-2椎间盘内注射有望成为椎间盘退变疾病生物治疗的方法之一.     

细胞移植治疗椎间盘退行性变研究进展

目前认为椎间盘退行性变是引起腰背痛的主要原因,也是骨科治疗的难点。临床上常采用椎管减压、腰椎融合或单纯髓核摘除手术治疗,可纠正脊柱不稳,改善临床症状,但无法使退变的椎间盘恢复正常的生理功能。应用细胞疗法治疗椎间盘退行性变,近年已成为生物学治疗领域的热点。多项研究显示,将自体椎间盘细胞或间充质干细胞作为种子细胞植入退变的椎间盘中,可有效地补充细胞数量,增加细胞外基质含量,从而延缓椎间盘退变进程,甚至修复受损的椎间盘。     

细胞移植治疗椎间盘退变的研究进展

椎间盘退变性疾病的发病率随着人口老龄化逐年增加,给个人和社会都带来巨大的负担.传统的治疗方式无论是保守治疗还是手术治疗都无法从根源上解决退变的问题.为减轻退变椎间盘内的炎性环境、减少髓核细胞凋亡,细胞移植为治疗椎间盘退变带来新的思路.通过将髓核细胞或多种来源的间充质干细胞植入退变的髓核内,可达到减缓椎间盘退变进程的目的...     

兔髓核组织中BNIP3表达与椎间盘退变的关系

目的:探讨兔椎间盘髓核组织中BNIP3表达量与椎间盘退变的相关性。方法:健康1月龄新西兰白兔24只,随机分为4组,每组6只。在每只动物的L4/5、L5/6和L6/7椎间盘进行纤维环穿刺术,建立椎间盘退变模型,作为实验椎间盘;穿刺椎间盘近端3个椎间盘(L1/2、L2/3、L3/4)作为正常对照椎间盘。分别于术后即刻、2、4、8周对椎间盘进行MRI及组织学评分,应用Real-time PCR定量检测髓核组织BNIP3 mRNA表达,免疫组织化学染色半定量髓核组织BNIP3表达,同时分析同一椎间盘BNIP3表达与MRI评分、组织学评分之间的相关性,并与正常椎间盘进行对照。结果:正常及手术后即刻实验椎间盘在MRI T2加权像上呈高密度,评分为1.0±0.0;手术后2周实验椎间盘信号呈不均一的高密度,评分为2.9±0.4;手术后4周实验椎间盘信号呈不均一中低密度,评分4.2±0.3;手术后8周实验椎间盘信号呈低密度,评分4.9±0.1,各时间点MRI评分比较有显著性差异(P<0.05)。组织学染色显示正常及手术后即刻椎间盘结构整齐,髓核与纤维环交界清晰,组织学评分4.0±0.0;手术后2周实验椎间盘纤维环出现小裂隙,髓核与纤维环交界轻度不清,组织学评分7.5±0.2;手术后4周实验椎间盘纤维环出现较大裂隙,髓核与纤维环交界中度不清,组织学评分10.0±1.0;手术后8周实验椎间盘正常结构丧失,髓核组织纤维化,组织学评分11.8±0.2,各时间点间组织学评分比较有显著性差异(P<0.05)。手术后即刻、2周、4周及8周实验椎间盘BNIP3 mRNA表达是正常组的1.0±0.3倍、2.0±0.1倍、2.8±0.3倍和4.2±0.2倍,与椎间盘MRI退变评分呈显著性正相关(r=0.92,P<0.01)。正常及手术后即刻实验椎间盘髓核组织BNIP3灰度值分别为55.3±6.2和60.7±4.4;而手术后2周、4周及8周实验椎间盘分别为150.4±13.4、176.0±35.1和173.6±7.9,其灰度值与椎间盘组织学评分呈显著性正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:兔椎间盘髓核组织中BNIP3 mRNA表达量与椎间盘退变相关,BNIP3表达上调可能在椎间盘退变过程中发挥了重要作用。     

兔腰椎间盘髓核细胞的培养及形态观察

目的：通过对兔腰椎间盘髓核细胞的培养,观察细胞内的演变,探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素。方法：取兔腰椎间盘髓核细胞,在加10％灭活胎牛血清的F12－DMEM液中培养,建立体外髓核细胞培养模型。通过光镜、电镜观察,同时进行细胞活力测定。结果：（1）原代细胞生物学性状最接近体内细胞,传代后细胞呈现衰老现象。（2） 活力测定提示随着培养时间的延长及传代,活力逐渐降低。（3）髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。结论：兔腰椎髓核细胞的体外培养成功为人腰椎髓核细胞的培养奠定了基础。     

上皮膜蛋白-1在人椎间盘髓核细胞中的表达

目的观察上皮膜蛋白-1(epithelia membrane protein-1,EMP-1)在人椎间盘髓核细胞中存在的表达。方法利用我们已建成的人胚椎间盘髓核细胞和退变椎间盘细胞培养体系,采用半定量反转录PCR和免疫组化方法检测EMP-1在这两种细胞中的表达情况。结果人胚及退变椎间盘髓核细胞中EMP-1均有表达,分布在不同部位,且具有一定的丰度。结论 EMP-1在正常和退变椎间盘细胞中的存在和生物学特性改变,提示EMP-1可能在椎间盘退变中担当重要角色。     

CDMP-1逆转人退变椎间盘髓核细胞的实验研究

[目的]通过CDMP-1促进退变髓核细胞外基质合成来逆转椎间盘退变.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第3代髓核细胞,应用CDMP-l分组进行干预实验.A组为对照组,B组和C组为实验组,B组加人100ng/ml CDMP-1,C组加入200ng/rnl CDMP-1.采用光学相差显微镜及透射电镜对对照组和实验组细胞形态和超微结构进行对比观察:XTT-PMS法检测各组髓核细胞12d的生长曲线,研究三组细胞间的生长动力学差异;实时荧光定量PCR检测髓核细胞,7,14,21d Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.[结果]光学相差显微镜及透射电镜示:两剂量实验组形态学上没有明显差异,与对照组相比,CDMP-1实验组能较好的维持髓核细胞生物形态学特性,延长退变髓核细胞的衰老;三实验组12d的生长曲线一致,两剂量的CDMP-1没有增加退变髓核细胞的增殖;实时荧光定量PCR示100ng/ml CDMP-1组:Ⅱ型胶原mRNA表达总体均数及3个时间点均高于另外两组任一时间点(P<0.05);糖胺多糖mRNA表达总体均数及14、21d 2个时间点均高于另外两组相应时间点(P<0.05),且Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达量随刺激时间增加而增加.200 ng/ml CDMP-1组:提高了糖胺多糖mRNA表达水平的同时,却降低了Ⅱ型胶原mRNA水平.[结论]100ng/ml的CDMP-l可以延长体外培养人退变髓核细胞的衰老,维持细胞生物形态学特性,提高退变髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达水平,在一定程度逆转了椎间盘髓核细胞退变.     

内质网应激在酸诱导的人椎间盘髓核细胞损伤中的作用机制研究

目的 :模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,研究酸诱导的内质网应激活化以及内质网应激在酸诱导的髓核细胞损伤中的作用机制。方法:体外单层培养人正常髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)系,以p H值7.4为对照,p H值7.0和6.5分别模拟正常和退变椎间盘酸性环境,培养12~72h,建立酸诱导的髓核细胞损伤模型。采用CCK8法检测髓核细胞增殖情况,透射电镜检测髓核细胞中内质网应激活化情况,免疫荧光检测内质网应激特异性标志物糖调节蛋白78(78 k Da glucose-regulated protein,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达。应用4-PBA(内质网应激阻断剂)阻断内质网应激后,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;β半乳糖苷酶染色检测细胞老化。Western blot检测LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白变化情况。结果 :与对照组相比,酸刺激下(p H6.5组)髓核细胞整体增殖力较对照组明显下降;透射电镜下可见内质网扩张明显,膜表面积增加,内质网线粒体膜结构形成,伴线粒体肿胀;细胞免疫荧光检测提示GRP78和CHOP表达明显增加(P0.05)。应用4-PBA后,细胞凋亡率增加,且能够显著增加酸诱导的G1期停滞及β半乳糖苷酶阳性染色率(P0.05)。Western blot检测发现,酸刺激下,髓核细胞LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3表达增高(P0.05),Bcl-2表达降低(P0.05);应用4-PBA后可降低LC3比值和Bcl-2表达水平,并显著升高GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3(P0.05)。结论:酸性微环境能够活化内质网应激,在酸诱导的人髓核细胞急性损伤中起保护作用。