测定GITR和GITRLELISA的建立及其临床初步应用

目的建立测定糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）及其配体（GITRL）的定量酶联免疫吸附试验（ELISA）,并探讨GITR及GITRL定量测定在类风湿性关节炎（RA）及肿瘤疾病的诊断或病情监测中的临床应用。方法以鼠抗人GITR、GITRL单克隆抗体为包被抗体,以生物素-辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP）检测系统,建立GITR和GITRL定量检测的双抗体夹心ELISA。测定105例RA患者、54例肿瘤患者及100名健康体检者的血清GITR、GITRL含量,并探讨其与疾病的关系。结果建立的测定GITR、GITRL定量ELISA线性相关系数的平方（r2）分别为0.94和0.90。RA组血清中GITR、GITRL含量均明显高于正常对照组（P均〈0.001）;肿瘤组GITR高于正常对照组（P〈0.001）,GITRL与正常对照组差异无统计学意义（P〉0.05）。结论本研究成功建立了GITR、GITRL定量ELISA,血清GITR、GITRL含量测定可能会成为RA新的辅助性诊断指标和病情监测指标。     

肿瘤及多种疾病患者血清P53蛋白和抗体检测

目的检测不同疾病患者血清P53蛋白和抗体的阳性率。方法采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清P53抗体,夹心ELISA法检测P53蛋白。结果血清P53蛋白总阳性率为3．73％,抗体总阳性率为12．98％。恶性肿瘤、良性肿瘤、非肿瘤性疾病患者的P53蛋白阳性率分别为4．20％、0％及3．74％;P53抗体阳性率分别为14．23％、4．41％及13．02％。卵巢癌阳性率最高（41．67％）,其次为鼻咽癌（33．33％）、白血病（24．24％）。肝硬化、慢性乙型肝炎、慢性胆囊炎、结肠息肉、慢性阑尾炎等患者中也发现有血清P53蛋白和抗体阳性。结论血清P53蛋白和抗体作为一种无创性检测指标可用于肿瘤的辅助诊断及早期发现,但其实际应用价值尚需进一步评价。     

Survivin蛋白的原核表达及在肿瘤诊断中的初步应用研究

目的实现Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达,建立基于Survivin蛋白的Survivin抗体检测方法,为survivin的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从食管癌细胞Eca109中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出Survivin基因;用PCR将Survivin克隆至载体pET32a( );用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPTG诱导Survivin蛋白表达,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Western blot鉴定;建立基于重组融合蛋白的Survivin抗体检测方法,并对肿瘤和癌前病变患者血清进行检测。结果构建了Survivin蛋白原核表达载体pET32a( )/Survivin/BL21,实现了Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达;建立了检测Survivin特异性抗体的间接ELISA,对44份健康血清1、42份肿瘤患者血清1、86份癌前病变患者血清进行了检测,结果显示:anti-Survivin在肿瘤患者中的检出率为32%,特异性为88%;anti-Survivin阳性率与年龄和性别无关(P>1.0,P>0.912);在69例消化系统肿瘤中,血清anti-Survivin阳性率32%;186例癌前病变患者anti-survivin阳性率31.7%,AFP和CEA阳性率分别为10.8%和16.7%(χ2=28.0705,P<0.005);在消化性溃疡患者,anti-survivin和CEA阳性率均为33.3%;在直肠息肉中anti-survivin阳性率33.3%,CEA阳性率仅为5.6%(χ2=34.309,P<0.005);在慢性结肠炎患者,anti-survivin阳性率40%,CEA阳性率20%(χ2=13.41,P<0.005)。结论本研究获得的Survivin蛋白和建立的Survivin抗体检测方法,为survivin作为肿瘤标志物的深入研究奠定了重要基础。     

免疫PCR方法检测乳腺癌患者血清抗P53蛋白抗体

[目的]建立血清抗p53蛋白抗体免疫聚合酶链反应（Immuno—polymerase chain reaction，免疫PCR）检测新方法，探讨乳腺癌患者血清中抗p53蛋白抗体与组织中p53蛋白表达之间的关系及临床意义，旨在为临床乳腺癌血清学诊断提供实用的新方法。[方法]用免疫PCR方法检测乳腺癌患者、非癌患者和正常人血清中的抗p53蛋白抗体，采用免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）方法测定组织中的p53蛋白表达状况，进一步研究血清抗p53蛋白抗体与组织p53蛋白表达的相关性。[结果]1．以免疫PCR方法检测86份乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体阳性率为39．5％，40份非癌患者和120份正常人血清抗p53蛋白抗体均为阴性，乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体检出率明显高于非癌患者和正常人（P〈0．05），非癌患者与正常人之间无显著性差异（P〉0．05），免疫PCR方法检测血清抗p53蛋白抗体特异性为100％，敏感性为39．5％。2．53份p53蛋白阳性患者血清抗p53蛋白抗体阳性率为64．2％，显著高于p53蛋白阴性对照组（0％），血清抗p53蛋白抗体测定与p53蛋白表达密切相关P〈0．01）。[结论]血清抗p53蛋白抗体测定与组织p53蛋白表达相关。免疫PCR方法检测血清抗p53蛋白抗体与传统的免疫组化染色法相比较，取材更方便，创伤性小且检测方法简便易行，因此检测血清抗p53蛋白抗体是检测组织p53蛋白理想的替代工具。     

克隆酶均相免疫技术测定胃癌患者血清和粪便P53蛋白的研究

目的评价检测P53蛋白的克隆酶均相免疫分析方法的可行性。方法通过基因重组技术构建β半乳糖苷酶亚单位EA、ED及EDP53融合蛋白的原核表达质粒,建立克隆酶均相免疫技术,测定胃癌、非胃癌和正常对照组血清、粪便P53蛋白含量,并与酶联免疫吸附试验(ELISA)比较。结果31例胃癌患者的血清、粪便P53蛋白阳性率高于39例非胃癌患者和17名健康献血员(均P<001)。11例胃癌患者血清P53和免疫组化均阳性,且免疫复合物均以P53IgG形式存在,对5例胃癌血清动态观察表明,术后1周P53蛋白仍阳性,术后1个月显著下降,并在术后3个月消失。检测10份不同浓度的样本,表明克隆酶均相免疫法与ELISA具有较好的相关性。结论建立的克隆酶均相免疫技术可用于P53蛋白的测定,P53蛋白可作为判断胃癌预后的一项辅助诊断指标。     

用兔抗人分化抑制因子3抗体建立双抗体夹心ELISA法及初步临床应用

目的 制备兔抗人分化抑制因子3（Id3）多克隆抗体,建立检测血清Id3的双抗体夹心ELISA技术。 方法 用纯化的Id3重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗Id3多克隆抗体,通过多肽亲和层析柱去除非特异性成分,免疫细胞化学染色、免疫双向扩散及间接ELISA法检测抗体特异性和效价。制备辣根过氧化物酶（HRP）标记抗Id3,以纯化Id3重组蛋白为标准抗原制备标准曲线,建立定量检测人Id3的双抗体夹心ELISA法。 结果 免疫细胞化学染色显示,制备的兔抗血清能与人Id3蛋白特异性结合,所得兔抗血清效价分别为1 ∶ 8（琼脂双向扩散）和1 ∶ 8 000（ELISA）。ELISA法的包被抗体和酶标记抗体的工作浓度分别为5 μg/ml和1 ∶ 4 000,标准曲线为Y= 0.079 3+0.018 8X,r=0.997。检测线性范围为2～64 U/ml,平均回收率为98.2%, 批内平均变异系数（CV）为4.4%, 批间平均CV为7.2%。该方法可用于人血清Id3含量的检测。 结论 兔抗人Id3多克隆抗体的制备及夹心ELISA法的建立为今后研究Id3蛋白的功能及其在临床和基础医学中的应用奠定了基础。     

肿瘤患者血清P53抗体的测定分析

目的：探讨P53抗体在肿瘤辅助诊断中的临床应用价值。方法：采用ELISA法对90例恶性肿瘤患者术前血清P53抗体浓度进行定量检测,以90例正常体检者为对照进行结果分析。结果：90例恶性肿瘤患者中P53抗体阳性者36例,其中肺癌18例、肝癌10例、胃癌5例、乳腺癌3例,总阳性检出率为40%,正常对照组均为阴性。经统计学处理,恶性肿瘤患者中P53抗体阳性检出率与正常对照组有统计学差异（P〈0.05）。结论：血清P53抗体作为一种间接指标可反应P53基因突变情况,使用ELISA检测血清P53抗体具有操作简单、快速、不需要特殊仪器、便于基层推广等特点,对于肿瘤诊断及预后监测具有一定意义。     

与α-烯醇化酶相关的抗内皮细胞抗体ELISA的建立及临床初步应用

目的建立与α-烯醇化酶（ENOI）相关的抗内皮细胞抗体（AECA）的酶联免疫吸附试验（ELISA）,并探讨ENOI-AECA与自身免疫性疾病的关系。方法人工合成获得人ENOI基因编码序列并克隆该片段构建pUC57-ENOI重组质粒,再将重组质粒亚克隆入原核表达载体pET28（a）,回收酶切产物并经T4DNA连接酶连接,获得的重组表达质粒pET28（a）-ENOI,在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达蛋白,Ni NTA亲和层析纯化重组ENOI蛋白。以纯化的重组蛋白为包被抗原,并对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测ENOI-AECAELISA并作分析性能评价。用建立的方法分别检测健康人及系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）患者血清中的ENOI-AECA。结果获得了相对分子质量为47 000的高纯度人ENOI重组蛋白。ELISA抗原最佳包被浓度为5μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶50。以免疫印迹法为参照,所建方法的敏感性和特异性分别为76.0%和90.2%。SLE和RA患者血清中ENOI-AECA的阳性率分别为23.1%和57.1%;RA组ENOI-AECA阳性率与健康对照组比较,差异有统计学意义（P=0.000）。结论以人ENOI重组蛋白为抗原建立的检测ENOI-AECA的ELISA有较高的敏感性和特异性,可用于ENOI-AECA的检测。ENOI-AECA阳性提示患者可能患有自身免疫性血管炎。     

梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的克隆、表达梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白Tp0453，建立间接ELISA法，探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法构建重组质粒pQE32／Tp0453，IPTG诱导表达，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达结果；Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测人血清中特异性IgG抗体。结果成功构建了重组质粒pQE32／Tp0453；SDS-PAGE检测诱导产物显示有一分子量约为32000的特异蛋白带，免疫印迹检测其只与Tp IgG抗体具有阳性反应；重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Tp阴阳性参比血清，特异度和灵敏度均为100％；检测患者血清中特异性IgG抗体结果与TPPA法符合率为98．2％。结论表达的Tp043重组蛋白具有较好的免疫反应活性，可望用于梅毒的血清学诊断。     

双抗体夹心ELISA测定人广泛型线粒体肌酸激酶方法的建立

目的建立测定人血清广泛型线粒体肌酸激酶（uMtCK）浓度的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法应用原核表达的uMtCK重组蛋白免疫小鼠获得7株单克隆抗体,采用棋盘格滴定法筛选出最佳双抗体组合,其中抗体19F11进行辣根过氧化物酶（HRP）标记作为检测抗体,抗体3C1作为俘获抗体,建立检测人uMtCK双抗体夹心ELISA方法,并进行方法学评价。同时采用该法检测50名健康体检者和85例肿瘤标志物[甲胎蛋白（AFP）或癌胚抗原（CEA）]阳性患者的血清。结果通过筛查获得配对抗体,建立检测人uMtCK的双抗体夹心ELISA方法。该法的检测限为28．8ng／mL,批内变异系数（CV）为4．5％～7．7％,批间CV为8．2％～13．5％,平均回收率为97．1％。用该法检测50名健康体检者血清uMtCK浓度,结果均为阴性;85例肿瘤标志物阳性患者中有15例检出uMtCK,浓度为52．8～1442．2ng／mL。结论建立的双抗体夹心ELISA可以用于测定人血清uMtCK浓度。     

早期类风湿性关节炎患者血清抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体的水平变化意义

目的探讨血清抗突变型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体水平在诊断类风湿性关节炎（RA）中的意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定73例RA患者血清抗MCV抗体水平,并同步分别应用ELISA、放射免疫分析法及增强比浊法检测抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和类风湿因子（RF）水平,与35例非RA患者和40名健康体检者进行对照比较。结果RA组血清抗MCV抗体水平显著高于健康对照组（P〈0.01）;非RA组与健康对照组间差异无统计学意义。抗MCV抗体对RA诊断的敏感性为83.56%（61/73）,特异性为96.00%（72/75）,均高于抗CCP抗体及RF;相关分析显示RA患者抗MCV抗体水平与抗CCP抗体、TNF-α及RF呈显著正相关（r=0.531、0.243、0.347,P均〈0.01）。结论抗MCV抗体与RA联系密切,为一高度敏感的、新的RA标记物,临床上检测血清抗MCV抗体水平对于筛查和辅助早期诊断RA具有重要意义。     

重组人胱抑素C及其多克隆抗体的制备

目的探讨重组人胱抑素C（Cys C）及其多克隆抗体的制备。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计Cys C编码基因序列,人工合成目的基因,并将其在大肠埃希菌中表达,目的蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔;采用Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测兔血清重组人Cys C及其多克隆抗体。结果制备的重组人Cys C纯度达90%以上,抗重组人Cys C抗体具有很好的结合效价和特异性。结论制备的重组人Cys C及其抗体可用于进一步的实验研究和临床应用。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

高尔基体蛋白73诊断原发性肝癌的临床评价

目的评价新的肿瘤标志物高尔基体蛋白73（GP73）对原发性肝癌的临床诊断价值。方法用ELIAS法对40例原发性肝癌患者（肝癌组）、40例慢性肝病患者（肝病组）与40名健康体检者（对照组）血清标本进行GP73测定,然后对结果进行统计学分析,并与病理结果（＂金标准＂）比较,分析灵敏度、特异性和符合率。结果①肝癌组血清GP73水平（中位数：299.4）明显高于肝病组（中位数：83.4）和对照组（中位数：53.2）,差异具有统计学意义（P均〈0.01）;②与＂金标准＂病理结果比较,敏感度为90.0%、特异性为70.0%和符合率为76.7%。结论 GP73是诊断原发性肝癌较为敏感的肿瘤标志物,其敏感性高于AFP,具有广泛的临床应用价值。     

ITP患者血清IL-2、4、6、10及TNF-α、IFN-γ测定的临床意义分析

目的观察特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者治疗前、后血清白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与γ-干扰素(IFN-γ)水平的变化。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定53例ITP患者治疗前、后及50名正常对照者血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平,并对检测结果进行分析。结果 53例ITP患者治疗前血清IL-2 IL-6、TNF-α及IFN-γ水平明显高于治疗后及正常对照组(P<0.05、P<0.01);血清IL-4、IL-10水平明显低于治疗后及正常对照组(P<0.01)。ITP患者治疗后除IL-6外,其余各项指标均恢复至正常对照组的水平(P>0.05)。结论 ITP作为一种自身免疫性疾病,存在多种细胞因子的异常,有效治疗后则多数细胞因子恢复至正常。因此,临床上对ITP患者应定期观察其血液中IL、TNF-α和IFN-γ水平变化,以判断其病情变化、治疗效果及其预后。     

P53上游凋亡调节蛋白在依托泊苷诱导直肠癌细胞凋亡中作用机制的研究

目的 研究P53上游凋亡调节蛋白(PUMA)在直肠癌细胞HCT116中的表达及其关联性作用机制.方法 应用依托泊苷诱导直肠癌细胞HCT116,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞仪测定依托泊苷作用前后细胞HCT116的凋亡情况;蛋白印迹法(Western blot)测定PUMA、P53蛋白的表达水平.结果 依托...