拉米夫定和阿德福韦酯双重耐药HBV株临床检出特点与表型特性分析

目的分析拉米夫定(lamivudine,LAM)和阿德福韦酯(adefovir,ADV)双重耐药HBV株临床检出特点和表型特性,为临床优化抗病毒方案提供参考。方法回顾性分析26 553例慢性HBV感染者血清样本中HBV反转录酶区与LAM和ADV耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对双重耐药HBV株进行鉴定,采用表型耐药方法分析强效核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]对双重耐药HBV的抑制效果。结果 26 553例慢性HBV感染者的血清样本中,LAM/ADV双重耐药HBV突变株的检出率为0.6%(147/26 553),主要突变类型为rt L180M+A181V+M204V(65.3%)和rt A181V+M204I(10.2%)。多数患者经历了LAM→ADV(40.8%)或LAM→ADV→ETV(38.8%)单药序贯/联合治疗,平均抗病毒时间为63个月。其中2例代表性LAM和ADV双重耐药患者的动态血清样本克隆结果显示,在恩替卡韦(entecavir,ETV)+ADV联合挽救治疗期间,随着获得完全病毒学应答后维持时间的延长,病毒准种池中LAM/ADV双重耐药株逐渐消失,病毒株以单一NAs耐药株或野生株为主。体外表型结果显示,各种双重耐药HBV突变株的体外复制力均低于野生株,ETV+ADV联合、替诺福韦酯(tenofovir,TDF)单独或TDF+ETV联合可有效抑制野生株复制(抑制率为98.5%~99.5%),而对各种LAM/ADV双重耐药突变株的抑制率分别为80.6%~92.5%、86.1%~97.9%和89.2%~97.5%。结论长期LAM和ADV单一序贯治疗可促进LAM/ADV双重耐药HBV发生,ETV+ADV联合、TDF单独或TDF+ETV联合均可有效抑制LAM/ADV双重耐药HBV复制,而基于TDF的挽救治疗效果更佳。     

阿德福韦耐药乙型肝炎病毒毒株生物学特性的研究

目的 体外研究阿德福韦(ADV)耐药相关变异对于HBsAg产生及HBV复制等生物学特性的影响.方法 收集12例在ADV治疗过程中出现病毒学突破的慢性乙型肝炎患者血清,对其HBV反转录(RT)区进行PCR扩增和测序分析.对其中4例患者的HBV进行全基因扩增、测序、序列分析及克隆.将优势株的HBV全基因插入PHY106载体,构建成1.1拷贝HBV基因组表达载体,进而转染Huh7细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg及HBeAg水平,了解不同ADV耐药相关变异类型对HBsAg分泌的影响.抽提转染细胞内病毒核心颗粒HBV DNA,实时荧光定量PCR方法 检测HBV DNA水平.将rtA181T/sW172*变异株与rtA181非变异株质粒按不同比例混合,共转染Huh7细胞,检测上清液中HBsAg及细胞内病毒核心颗粒HBV DNA水平.结果在12例出现病毒学突破的患者中,10例出现ADV耐药相关位点变异,以rtA181变异为主,其中5例有rtA181T变异,4例为rtA181T/S+rtN236T变异.将含rtA181T/sW172*变异的质粒转染细胞后,上清液中不能检测到HBsAg,而含其他变异类型的质粒转染细胞后,上清液中HBsAg和细胞内病毒核心颗粒HBV DNA水平与非变异株相似;含不同变异的HBV临床分离株转染后的细胞内核心病毒颗粒HBV DNA水平未见明显差异.将rtA181T/sw172*变异株及rtA181非变异株的质粒共转染后.随着rtA181非变异株比例的增加,上清液中HBsAg水平也逐渐增高,但细胞内核心病毒颗粒HBV DNA水平无明显差异.结论 rtA181变异是ADV耐药相关性变异的主要类型,rtA181T变异较多见.rtA181T/sW172*变异株可引起HBsAg分泌障碍,但rtA181非变异株可纠正rtA181T/sW172*变异株的HBsAg分泌障碍.不同类型的ADV耐药相关变异对HBV的复制能力无显著影响.     

阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效和耐药率

在拉米夫定(LAM)长期治疗慢性乙型肝炎(CHB)中,耐药发生率随时间延长而增加,患者常因耐药毒株的出现,导致乙型肝炎复发和恶化.阿德福韦酯(ADV)能有效抑制LAM耐药变异株,减缓LAM耐药患者的乙型肝炎进程[1].本文通过观察ADV单药初治和LAM耐药后改用联合ADV或单用ADV治疗患者的HBV DNA、AL,T、HBeAg、抗-HBe的血清转换率,评价ADV单药治疗的效果,同时检测HBV核酸序列的变化,分析ADV耐药相关性变异和耐药率.     

对阿德福韦酯自然变异耐药与抗病毒后耐药的慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因序列比较

目的 通过对慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶RT区序列分析,观察对阿德福韦酯(ADV)自然变异耐药及继发耐药的异同.方法 PCR产物直接测序法检测78例对ADV耐药患者外周血HBV RT区基因序列.其中曾用ADV治疗患者30例(治疗组),未抗病毒治疗48例(未治疗组),并对两组ADV相关耐药变异位点发生频数进行比较.结果 未治疗组ADV耐药的主要变异类型为rtAl81V/T 10例(20.8％),rtN/H238T/D/S 10例(20.8％)和rtV214A变异13例(27.1％);而治疗组发生的ADV耐药变异主要为rtA181V/T 16例(53.3％),没有发现rtN/H238T/D/S变异,仅发现l例rtV214A变异.结论 CHB患者中存在相当严重的ADV自然变异耐药变异,主要变异类型为rtN/H238T/D/S及rtV214A,而抗病毒治疗后该变异位点发生频数反而相对减少.rtAl81V/T变异既可以为自然变异也可以由ADV抗病毒治疗而诱发.     

LAM耐药后ADV序贯治疗再耐药HBV变异株的动态变化

目的:观察阿德福韦酯(ADV)单药序贯治疗拉米夫定(LAM)耐药慢性乙型肝炎(CHB)出现再耐药患者HBV变异株的动态变化.方法:28例初始LAM治疗的CHB患者, 出现LAM耐药后换用ADV单药序贯治疗再次出现不充分病毒学应答或病毒学突破. 采用实时荧光定量PCR检测DNA, 分析HBV DNA动态变化; 采用直接PCR产物测序法检测耐药变异,分析变异模式变化. 对其中2例患者系列血清进行基因克隆分析其HBV耐药株动态变化.结果:28例入选患者HBV DNA载量随耐药变异株的消长而波动: 基线为(7.65±1.04)Log10copies/mL, LAM疗程中最低值中位数为3.68 Log10copies/mL; 出现病毒学突破或/和耐药变异时为(6.87±1.16) Log10copies/mL, 患者换用ADV后最低值中位数为3.78 Log10copies/mL; 患者出现耐药变异模式改变或再次病毒学突破时为(6.04±0.93) Log10copies/mL. 治疗基线及两次病毒突破3个时点HBV DNA载量均数逐渐下降, 且两两之间差异均有统计学意义. 28例患者LAM治疗后24例发生rtM204I/V伴或不伴rtL180M等变异, 4例无耐药变异; 换用ADV单药序贯治疗出现病毒学突破后, 进行测序检测耐药发现: LAM耐药变异13例(包括3例多重耐药), ADV耐药变异11例(包括3例多重耐药), 无耐药变异7例. 其中11例ADV耐药患者: rtA181V变异6例、rtA181T变异3例、rtN236T变异和rtA181V+rtN236T联合变异各1例. 对2例患者血清TA克隆发现ADV耐药准种出现和LAM耐药准种消失的过程, 同时发现对ADV耐药的rtI233M变异和对替诺福韦耐药的rtA194T变异.结论:ADV单药序贯治疗LAM耐药CHB出现再耐药患者HBV变异株动态变化存在5种形式, 且克隆分析可观察耐药株动态变化过程和发现预存的耐药准种.     

阿德福韦酯联合拉米夫定治疗拉米夫定耐药慢性乙型肝炎59例临床观察

目的 探讨阿德福韦酯(ADV)联合拉米夫定(LAM)治疗LAM耐药慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床疗效.方法 选择LAM耐药的HBeAg阳性的CHB患者114例,随机分成两组:ADV +LAM(A组)59例,予ADV10mg/d联合LAM 100 mg/d口服;ADV组(B组)55例,予ADV 10 mg/d 口服.分别观察完成24、48、96和144周治疗时血清肝功能,HBV DNA水平,HBV血清学标志及不良反应.结果 治疗96、144周A组ALT复常率较B组显著升高(P＜0.05);治疗96、144周A组HBV DNA水平较B组显著下降(P＜0.05);治疗96、144周A组HBV DNA转阴率较B组显著升高(P＜0.05);治疗96、144周A组新的耐药变异率显著低于B组(P＜0.05);治疗96、144周A组HBeAg转阴率显著高于B组(P＜0.05).两组均未发现与药物相关的不良反应.结论 ADV联合LAM治疗LAM耐药CHB患者有显著的抗病毒效果,能有效减少HBV耐药变异的发生,安全性良好.     

ADV-dpv对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的治疗

阿德福韦(ADV)为核苷类药物,ADV-dpv(Adefovir Dipivoxil)即ADV的前体,为一亲脂性口服制剂。在前临床及Ⅱ期临床研究中,ADV-dpv显示有效的抗HBV活性,对拉米夫定耐药株亦有治疗作用。     

ADV-dpv对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的治疗

阿德福韦(ADV)为核苷类药物，ADV-dpv(Adefovir Dipivoxil)即ADV的前体．为一亲脂性口服制剂。在前临床及Ⅱ期临床研究中．ADV-dpv显示有效的抗HBV活性．对拉米夫定耐药株亦有治疗作用。     

乙型肝炎病毒突变与阿德福韦酯临床耐药的关系

阿德福韦酯（Adefovir dipivoxil,ADV）为5＇-单磷酸脱氧腺苷（5＇-dAMP）的无环磷酸化嘌呤类核苷酸类似物,口服后在血浆或组织内迅速转化为游离ADV,在细胞激酶作用下磷酸化为有活性的代谢产物ADV二磷酸盐,在乙型肝炎病毒（HBV）复制中,与天然的三磷酸脱氧腺苷竞争结合HBV多聚酶,并能结合到HBVDVA链上,阻止其延伸,终止病毒复制。体外试验表明,HBV野毒株和YMDD突变株对ADV同样敏感,对已发生拉米夫定（Lamivudine,LAM）耐药的病例,改用或加用ADV对降低血清病毒水平有效。虽然ADV治疗期间出现病毒耐药突变的机率较LAM低,但鉴于核苷类药物需长期应用,ADV治疗引起的HBV多聚酶／反转录酶基因突变可累积增加,对于HBV突变引起的临床耐药及出现耐药后的补救治疗等问题仍是临床常见问题。     

阿德福韦酯治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的生化学应答预测因素分析

阿德福韦酯(ADV)对HBV野生株和拉米夫定耐药变异株均有活性,且耐受性好,不易出现耐药[1].但临床中ADV治疗慢性乙型肝炎(CHB)时,有的疗效较好,有的疗效欠佳,而影响疗效的因素主要包括宿主及病毒.TNF-α是具有广泛生物活性的细胞因子,其单核苷酸多态性反映了不同种族和个体之间的遗传差异[2];而HBV基因型是否影响ADV疗效,相关研究也未得出较一致的结论.为此,本研究同时分析宿主和病毒因素,探讨ADV治疗HBeAg阳性CHB患者48周生化学应答的预测因素,以期提高疗效.     

乙型肝炎病毒C型重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建乙型肝炎病毒（HBV）中国株及其拉米夫定耐药相关变异株的重组杆状病毒.方法将1.2倍HBV基因组（血清adr型、基因C型）连接至杆状病毒的转移载体pFastBacI上,然后转化入DH10Bac菌株中,在细菌内的辅助质粒辅助作用下与杆状病毒基因组Bacmid发生位点特异性转座,形成含有HBV基因组的重组Bacmid,转染昆虫sf9细胞后,包装产生HBV重组杆状病毒vAcHBVc.采用连续聚合酶链反应（PCR）引入方法进行定点突变,构建YVDD变异株质粒,并按照上述方法构建HBV YVDD变异株重组杆状病毒vAcHBVYVDD,扩增并滴定.为便于观察重组杆状病毒的转染和扩增效率及病毒滴度测定,同时构建了含绿色荧光蛋白（GFP）的HBV重组杆状病毒vAcGFPHBVc.结果 HBV野毒株和变异株重组杆状病毒均构建成功,通过免疫空斑及TCID50定量测定病毒滴度为106～108pfu/ml左右.结论应用Bac to Bac杆状病毒表达系统可有效快速地构建HBV C型重组杆状病毒,以用于HBV体外复制系统的建立,为HBV野毒株及变异株生物学特性的研究及抗病毒药物的筛选提供技术平台.     

乙型肝炎病毒耐药突变产生的分子病毒学机制

乙型肝炎病毒(HBV)以逆转录方式进行基因组的复制,容易发生病毒突变;同时,在宿主体内特定的压力下,包括内源性的(宿主免疫清除)、外源性的(疫苗和抗病毒药物),各种逃逸突变株被选择产生,尤其是在核苷(酸)类似物治疗中出现的耐药株,已成为目前限制抗病毒治疗疗效的主要因素.     

乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药相关变异的研究进展

目前口服核苷酸类似物阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)仍是我国临床治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的主要抗病毒药物之一。但是,长期服用ADV可能导致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)产生耐药变异。经典的ADV耐药变异形式为rt A181V和rt N236T,新鉴定的ADV原发耐药变异为rt A181S、rt E218G和rt N236V。此外,rt A181T、rt V214A、rt Q215H/P/S、rt L217R/P、rt I233V和rt N238T/D/H等位点变异与HBV对ADV耐药仍存在争议,尚需进一步明确。     

替诺福韦酯对阿德福韦酯应答不佳患者的挽救治疗研究进展

阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)作为常用抗HBV治疗药物,与拉米夫定(lamivudine,LAM)、替比夫定和恩替卡韦无交叉耐药,且价格相对低廉,长期以来用于初治患者和LAM耐药患者的挽救治疗。然而由于ADV耐药基因屏障较低且临床用药剂量较低,临床长期应用累积了较多ADV应答不佳患者。替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)作为ADV应答不佳患者的挽救治疗方案之一,对ADV初治应答不佳患者和LAM耐药的ADV应答不佳患者的临床疗效略有差异。然而多项体外研究显示TDF对ADV耐药病毒株抑制作用减弱。ADV应答不佳的患者换用TDF是否会引起或加重肾损害值得临床关注。本文就TDF对ADV应答不佳患者挽救治疗的国内外研究进展作综述,为提高耐药HBV感染防治的管理提供帮助。     

乙型肝炎病毒聚合酶变异及其耐药的产生和监测

乙型肝炎病毒(HBV)以逆转录方式进行基因组的复制,易发生病毒突变;同时,在宿主体内特定的压力下,包括内源性免疫清除、外源疫苗和抗病毒药物等,各种逃逸突变株被选择产生,其中在核苷(酸)类似物治疗中出现的耐药株可导致HBV DNA水平再次升高、丙氨酸转氨酶(ALT)反弹和HBV e抗原(HBeAg)血清学转换的逆转,已成为目     

联用与改用阿德福韦治疗拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎疗效分析

目前拉米夫定（LAM）应用后所导致的耐药性已是临床治疗慢性乙型肝炎中常见的问题。阿德福韦酯（ADV）不仅对HBV野毒株有效，对LAM耐药的HBV变异株也有显著的抑制作用，临床上ADV已广泛用于治疗对拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者，但由于经济等原因，临床上有些对LAM耐药的患者不愿接受LAM联合ADV治疗，只接受改用ADV治疗。本研究对我院42例LAM耐药的患者联用和改用ADV治疗的临床疗效报道如下。     

阿德福韦抗乙型肝炎病毒研究进展

阿德福韦(Adefovir,ADV)是新一代具有广谱抗病毒活性的腺嘌呤核苷类似物,其口服制剂为阿德福韦二吡呋酯(Adefovir dipvoxil,bis—POM PMEA),化学名:92-[2-[双(新戊酰氧甲氯基)磷酰甲氯基]乙基]腺嘌呤。ADV对于野生型和拉米夫定(3TC)等耐药性HBV都有显著抑制作用,有望成为解决HBV核苷类似物耐药问题的有效药物。目前国外正进行Ⅲ期临床试验,本文就有关的研究进展作一综述。     

ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtA181V变异

目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异- rtA181V变异的快速检测方法．方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株(rt181 A)PCR产物中含有Blp Ⅰ酶切位点(5’GCTNAGC3’),而变异株(rt181V)无此限制性酶切位点．选取4份应用ADV治疗1 a以上出现HBV DNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清,经PCR扩增、Blp Ⅰ酶切、30 g／L琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析．并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各一例进行 HBV RT区基因序列分析及对照质粒的构建．结果:自4份血清标本中检测到2例rtA181V变异．所建立的ntPCR—RFLP方法灵敏度高,可以检测到103 copies／L的HBV DNA;特异性强,其 RFLP分析结果与DNA测序结果一致．结论:应用ntPCR-RFLP方法检测rtA181V 变异具有灵敏、特异、简便的优点,适用于 ADV耐药变异的临床监测工作．     

抗乙型肝炎病毒新药——阿德福韦

阿德富韦(简称:ADV)是一种新的核苷类抗病毒药物,Adefovir dipivoxil(前称:bisPOMPMEA;化学名:9-[2-(双特戊酰氧甲基磷酸双甲氧乙酰)腺嘌呤)]是它的前体。在体外和体内实验中具有很强抑制乙型肝炎病毒(HBV)增殖的作用。 1.Omg/kg或3.Omg/kg ADV静脉注射,测得血药浓度