携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带小鼠白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体,研究肝脏Hepa l石细胞的IDO基因mRNA及蛋白表达情况.方法 酶切含有小鼠全长IDO cDNA的IDO质粒,亚克隆至穿梭载体pAdTrack.ALB上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,生成并筛选阳性克隆,测序、鉴定正确后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,检测病毒滴度,RT-PCR和荧光显微镜鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达.重组腺病毒进一步感染Hepa 1-6细胞,RT-PCR和WesternBlot法分别检测IDO基因在细胞内表达情况.结果 经酶切及测序证实携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,病毒感染滴度为2.9×10~6pfu/ml.感染Hepa 1-6细胞后,RT-PCR和Western Blot可以检测到IDO mRNA水平和蛋白水平表达.结论 构建了携带白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体.     

重组腺病毒介导Fas基因转染瘢痕疙瘩细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的　制备含人Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后 ,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白 ,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法　Fas基因自PcDNA3 1 Fas质粒中切取 ,应用PDC315载体系统构建携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞 ,检测Fas蛋白的表达及功能。结果　成功地构建了携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染后瘢痕疙瘩成纤维细胞能稳定表达的有功能的Fas蛋白。结论　利用重组腺病毒转染可以重建被阻断的瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas死亡信号传导通道 ,并再次估证了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系 ,为瘢痕疙瘩基因治疗展示了一条新途径     

表达人骨形成蛋白4的非复制型腺病毒的构建与鉴定

目的构建含有人骨形成蛋白4（human bone morphogenetic protein4,hBMP-4）的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4并检测其表达。方法酶切质粒pCS2（＋）/hBMP-4获得目的基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,再亚克隆至pShuttle-CMV,电转化至含有pAdEasy-1骨架质粒的E.coliBJ5183/p中进行同源重组,重组质粒转染HEK293细胞包装成含有hBMP-4基因的非复制型腺病毒。病毒颗粒感染HEK293和HeLa细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western-blot检测。结果获得了含有目的基因hBMP-4的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4,酶切鉴定提示构建正确,RT-PCR检测到hBMP-4基因的转录,Western-blot检测到hBMP-4蛋白表达。结论将目的基因hBMP-4克隆至非复制型腺病毒表达载体中,为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定基础。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

人TIMP-2重组腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建含人TI MP-2(hTI MP-2)基因的重组腺病毒载体并在大鼠主动脉平滑肌细胞中表达,为血管疾病基因治疗提供实验基础。方法:利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pTrack-CMV-hTI MP-2共转化BJ5183受体菌,并在其中发生同源重组,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子;重组腺病毒质粒AdhTI MP-2经过293细胞的包装,扩增和纯化后,测定病毒滴度。腺病毒体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测hTI MP-2的mRNA。并收集细胞上清,进行Western blot检测TI MP-2蛋白。结果:得到了携带hTI MP-2基因的重组腺病毒,纯化后滴度为4×1011efu/ml,在感染VSMC后24h即检测到hTI MP-2的表达。结论:成功地构建了携带hTI MP-2的重组腺病毒载体并体外转染VSMC,为下一步应用于血管疾病基因治疗提供了基础。     

大鼠ETFβ基因过表达对NADPH氧化酶基因表达的影响

目的:构建大鼠ETFβ的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达和对NADPH氧化酶的影响。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码ETFβ的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,测序正确后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR方法检测空载体组和重组质粒转染组的NADPH氧化酶各亚基mRNA水平的表达变化。结果:(1)测序结果证实PCR扩增得到编码ETFβ的cDNA序列正确;(2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,ETFβ融合蛋白成功表达;(3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的NADPH氧化酶5个亚基中的NOX3,NOX4的mRNA表达降低(P<0.05),空载体组和重组质粒转染组之间比较NOX1,NOX2,NOX5的mRNA表达差异无统计学意义。结论:成功构建大鼠ETFβ的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达,并且降低了NADPH氧化酶NOX3,NOX4的mRNA表达水平。     

绿色荧光蛋白和Nel1型蛋白基因共表达腺病毒载体的构建及体外转染大鼠BMSCs的初步实验研究

目的构建同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因和人类Nel1型蛋白[homo sapiens NEL-like1,NELL1)]基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-NELL1,并转染大鼠BMSCs,观察其表达情况,为进一步研究NELL1蛋白的成骨作用提供理论基础。方法设计特异性引物从NELL1质粒中扩增NELL1,将测序正确的片段用XhoI/BglII酶切处理,定向插入至pShuttle-GFP-CMV(-)TEMP重组穿梭载体,然后将验证正确的重组穿梭质粒中的插入片段转移至pAdxsi载体构建重组腺病毒载体质粒,用PacI限制性内切酶线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,半数组织培养感染量法测定重组腺病毒滴度。培养大鼠BMSCs,采用流式细胞仪鉴定表面标志物,并行成骨、成脂诱导鉴定。用构建的pAdxsi-GFP-NELL1及空病毒pAdxsi-GFP(作为对照)转染鉴定正确的BMSCs,RT-PCR检测NELL1的表达,免疫荧光检测GFP基因及NELL1的表达情况,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测对细胞增殖的影响。结果成功构建同时表达NELL1和GFP基因的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NELL1),纯化后获得滴度达1×1011pfu/mL的重组腺病毒。成功分离获得大鼠BMSCs并传代、纯化,经流式细胞仪鉴定表面标志物及成骨、成脂诱导鉴定为BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1转染BMSCs后,RT-PCR检测示NELL1mRNA阳性表达,荧光显微镜观察示细胞爬片GFP阳性表达,NELL1抗体免疫荧光观察示NELL1蛋白阳性表达。CCK-8法鉴定显示转染后对BMSCs生长无明显影响。结论构建并纯化后的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NELL1)可高效转染大鼠BMSCs,并稳定表达NELL1和GFP两种基因,为进一步研究新的成骨基因NELL1的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。     

可调控表达人骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体系统的构建

目的构建可调控人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因表达的重组腺病毒载体系统,为骨缺损的修复提供新思路。方法基因测序验证pcDNA3．1－hBMP2质粒的准确性,将酶切得到的hBMP2基因片段亚克隆到穿梭载体质粒pTRE—Shuttle2的多克隆位点,将pTRE—Shuttle2-hBMP2线性化并连接至腺病毒骨架质粒Adeno—XSystem 1 Viral DNA上,构建重组的Adeno—X－pTRE—hBMP2载体;用PacI酶将其线性化后脂质体法（Lipofectamine 2000）转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,收集病毒上清进行hBMP2基因PCR鉴定;将包含rtTA激活因子的Adeno—X Tet—Onvirus Stock感染HEK293细胞包装扩增病毒。结果hBMP2基因被成功定向克隆到腺病毒骨架质粒Adeno—X System 1 Viral DNA上,转染HEK293细胞后获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。结论本研究成功构建了hBMP2基因的腺病毒Tet—On表达系统,为实现hBMP2基因在靶细胞水平上的调控表达提供前期实验基础。     

大鼠Uqcrfs1重组质粒的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK 293T细胞,使用RT-PCR、Western Blot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。