大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子,脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡.目的观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化,探讨其与神经细胞凋亡发生的关系,为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据.设计自身对照、相互对照动物实验.单位华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科.材料实验于2001-09/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.54只SD大鼠,雌雄不限,体质量220～250g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.方法①动物模型建立及分组将大鼠分为对照组和损伤组,对照组仅做Ts,T9椎板切除术,损伤组于4、8 h和1,2,3,7,14和21 d取材共9组,每组6只.以30 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后,按Nystrom法暴露T8,T9节段胸髓,将50 g重物通过2.2 mm×5.0 mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min,损伤后每天1000,1600和2200 3次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空.②取材及切片准备在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长,将每组4只损伤段脊髓组织块,长约8 mm,石蜡包埋,连续切片,分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick endlabeling,TUNEL)标记;每组2只在冰上处死,将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用.③检测指标以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达,以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA的表达变化,以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平,并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性.主要观察指标①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察.②免疫组化结果.③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化.④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性.结果纳入结果分析的各组动物数均为6只.①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果损伤段1 h有广泛出血;4～8 h脊髓结构开始破坏,大量的神经元死亡;24 h脊髓破坏严重;7～21 d损伤范围确定,脊髓内有空洞形成.②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达(2.1±0.5);脊髓损伤后8 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加(89.2±10.5),3 d达到高峰(189.6±12.7);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似,呈正相关(r=0.941).③逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA 4 h开始增高(0.442±0.024),48 h达到高峰(0.634±0.028),7 d后恢复正常(0.351±0.013),早于凋亡出现的时期,与神经细胞凋亡水平呈正相关(~0.622).4④rUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果对照组及4 h组仅见偶染细胞,8 h后开始出现阳性细胞,主要位于灰质中;此后阳性细胞逐渐增多,3 d达到高峰,7 d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少,主要在周围白质中,14和21 d可见少量的阳性细胞.结论在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在;大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强,8 h开始大量表达,24～48 h达到高峰,与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠,从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看,与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致,可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节.从本实验可以看出,从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗,应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48 h内应用.     

三七总皂苷干预脊髓损伤大鼠诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化

目的：观察三七总皂苷注射液对大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的作用机制。方法：实验于2005—06／1l在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。将64只SD大鼠数字表法随机分为损伤组和三七总皂苷组（n=32），2组按存活时间分为1，3，7，14d4个时间点，每个时问点8只。所有大鼠采用Allen’s法制备脊髓中度损伤模型（致伤能量为40g&;#183;cm），三七总皂苷组伤后30min腹腔注射50mg／L三七总皂苷100mg／kg，伤后2h及4h再次给予50mg／kg，以后1次／d，剂量200mg／kg，连用12d。损伤组相同时间点腹腔注射等体积生理盐水。2组均于预定对间点处死大鼠，取出伤段脊髓（以损伤处为中心，长约10mm），用苏术精-伊红染色观察损伤脊髓组织病理变化，免疫组化染色检测诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率。结果：64只大鼠全部进入结果分析。①苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂苷组明显轻于损伤组。②诱导型一氧化氮合酶阳性细胞率：三七总皂苷组在伤后1，3，7，14d均低于损伤组[（21．38&;#177;3．69）％。（36．24&;#177;3．27）％，（30．56&;#177;2．89）％．（21．64&;#177;5.31）％；（39．48&;#177;3．78）％。（58，69&;#177;5．67）％。（68．97&;#177;5．34）％，（40．35&;#177;4．36）％。t=9．692，9．701，17．893，3．171，P〈0．05]。⑧半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率：三七总皂苷组在伤后1，3，7，14d均低于损伤组[（26．29&;#177;3．21）％，（35，42&;#177;2．25）％，（48．58&;#177;2．64）％。（23．72&;#177;3．26）％：（32．43&;#177;2，69）％，（46、18&;#177;3．07）％，（60．31&;#177;5．35）％，（31，98&;#177;4、80）％，t=4．147。7．996，5．561，11．231，P〈0．05]。结论：三七总皂苷注射液能抑制脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达，从而减轻细胞损伤和凋亡。     

脊髓损伤后脊髓组织内凝血酶受体1的表达

目的：观察脊髓损伤后脊髓组织内凝血酶受体l的表达，分析表达规律与脊髓损伤程度是否具有时效性。 方法：（1）实验于2005—04／08在兰州大学基础医学院解剖学教研室实验室和甘肃省医学科学研究院动物实验中心完成。（2）选用成年健康Wistar大鼠75只，雌雄不拘。按随机抽签法将大鼠分为3组：正常对照组：只打开椎板，不损伤脊髓；模型组：打开椎板，损伤脊髓；脊髓损伤＋注全血组：打开椎板，损伤脊髓，立即自大鼠尾静脉取20μL自体血，注入骨窗中心的损伤脊髓组织中，缓慢注射，注射完毕后留置3min。（3）于术后6，24，48，72h和5d，采用免疫组织化学法检测各组脊髓组织凝血酶受体1表达。电镜观察各组术后72h神经元的超微结构变化。苏木精-伊红染色后对脊髓组织进行形态学观察。 结果：大鼠75只均进入结果分析。①凝血酶受体l阳性表达神经元数：模型组和脊髓损伤＋注全血组明显多于正常对照组（P〈0．01）；脊髓损伤＋注全血组明显多于模型组（P〈0．01）。模型组和脊髓损伤＋注全血组脊髓组织阳性细胞表达上调开始于术后6h（每400倍视野阳性细胞数分别为6．20&;#177;1．48，8．30&;#177;1．42），逐渐升高，72h达高峰（每400倍视野阳性细胞数分别为14．50&;#177;1．43，20．40&;#177;1．71），以后逐渐降低。②脊髓组织形态学观察结果：术后6h模型组和脊髓损伤＋注全血组神经细胞出现轻度水肿，术后72h神经细胞和细胞周围水肿非常明显，之后水肿情况逐渐减轻；脊髓损伤＋注全血组脊髓组织水肿较模型组重。③术后72h各组脊髓组织超微结构：模型组和脊髓损伤＋注全血组脊髓组织出现神经元凋亡。正常对照组见正常神经元。 结论：脊髓损伤后脊髓组织中神经元凝血酶受体l表达增强，其表达规律与脊髓损伤程度有一定的时效关系，凝血酶受体l的表达可能参与了脊髓组织继发性损伤.     

尿酸影响大鼠脊髓损伤后半胱氨酸蛋白酶3的表达及神经细胞凋亡

目的:观察尿酸对大鼠脊髓损伤后损伤段半胱氨酸蛋白酶3的表达及神经细胞凋亡的影响。方法:实验于2005-07/12在同济医院矫形外科实验室完成。选用雌性SD大鼠55只,按随机数字表法分为3组,空白对照组5只,脊髓损伤组和尿酸处理组各25只。脊髓损伤组和尿酸处理组大鼠用改良的Allen’s打击法造脊髓损伤模型。空白对照组大鼠单纯切除椎板,不打击脊髓。脊髓损伤组和尿酸处理组大鼠分别于术后8h,24h,72h,7d,14d取材,每时点处死5只大鼠;空白对照组大鼠于术后8h处死取材。对损伤部位脊髓进行病理形态学观察;采用原位末端标记法标记凋亡细胞,计算凋亡细胞指数=凋亡细胞核数/总细胞核数;用免疫组化染色检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。结果:纳入55只大鼠,全部进入结果分析,无脱失。①各组大鼠脊髓组织学检查结果比较:空白对照组大鼠脊髓未见出血、组织变性坏死等表现。与脊髓损伤组相比,尿酸处理组大鼠损伤脊髓出血坏死减少,炎性细胞浸润减轻。②各组大鼠脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数及神经细胞凋亡指数比较:相同时点尿酸处理组大鼠的神经细胞凋亡指数和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数均显著低于脊髓损伤组(t=3.057～6.965,P<0.05)。结论:尿酸可以抑制脊髓神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,对损伤脊髓组织具有保护作用。     

不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切半胱氨酸蛋白酶3的活性及坐骨神经损伤后的表达变化

目的：观察不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况及其在坐骨神经损伤后的表达变化，并分析其与脊髓细胞凋亡的关系。 方法：实验于2004-03／09在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。选择Wistar大鼠324只，成年、幼年、老年大鼠各108只。不同年龄组动物均随机分为对照组和手术组，对照组12只为非手术组；手术组共96只．分为术后1d，3d．1周、2周、3周、4周、5周、6周8个时间组，每组12只。各手术组大鼠均在戊巴比妥钠麻醉后，切除股方肌下缘约6mm的坐骨神经。大鼠脊髓细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪Annexin V／PI双标检测法，原位缺口末端标记阳性细胞及Annexin V阳性细胞即凋亡细胞；大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况应用免疫组化法检测；大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性应用Activity Assay试剂盒检测。 结果：所有大鼠全部进入结果分析，无脱失。①脊髓细胞凋亡情况的原位缺口末端标记及流式细胞仪Annexin V／PI双标检测结果：正常成年及老年大鼠未见明显标记的阳性细胞，正常幼年大鼠可见个别阳性标记细胞，坐骨神经损伤诱导脊髓神经细胞凋亡的高发时间为伤后2-4周，老年大鼠细胞凋亡持续时间较长。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。不同年龄大鼠Annexin V阳性细胞出现时间均早于原位缺口末端标记阳性细胞。②天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性及表达情况比较：幼年正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达及天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性均高于成年及老年大鼠（P〈0．01），损伤后各年龄组均有明显变化，幼年正常组损伤后1d天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3开始升高，升高时间早于成年及老年组。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：脊髓细胞凋亡情况与天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性测定结果有较好的相同改变趋势，提示天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标。不同年龄大鼠正常时脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达以其在坐骨神经损伤后的表达变化存在差异，说明针对不同年龄段发生的周围神经损伤，其促进神经再生调控时期不同。     

阿伐他汀调节大鼠脊髓损伤后白细胞介素1β及半胱氨酸蛋白酶3基因的表达

目的：观察阿伐他汀对脊髓损伤后SD大鼠白细胞介素1β及半胱氨酸蛋白酶3基因表达的影响。 方法：实验于2005—05／09在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科实验室完成。选择健康成年雌性SD大鼠78只，随机数字表法分为假手术组6只，阿伐他汀治疗组36只和生理盐水对照组36只，后两组每组又分损伤后1，4，12h，1，3，7d6个时相点，每个时相点6只。阿伐他汀治疗组于损伤前7d开始用阿伐他汀加生理盐水经口给药（5mg／kg，1次／d）直至处死，生理盐水对照组用相同体积的生理盐水代替。采用Allen打击法造成大鼠脊髓损伤，于术后不同时相点取伤段脊髓组织，用反转录-聚合酶链反应分析脊髓受损部位白细胞介素1β及半胱氨酸蛋白酶3mRNA表达。 结果：纳入动物78只，均进入结果分析。①阿伐他汀治疗组大鼠脊髓损伤后4h白细胞介素1βmRNA表达（A）低于生理盐水对照组（分别为0．480&;#177;0．100，2．610&;#177;0．330，P〈0．01）。②阿伐他汀治疗组大鼠脊髓损伤后1d半胱氨酸蛋白酶3mRNA表达（A）低于生理盐水对照组（分别为0．589&;#177;0．056，0．676&;#177;0．072，P〈0．05）。 结论：阿伐他汀能降低大鼠脊髓损伤后炎性细胞因子白细胞介素1β半胱氨酸蛋白酶3的基因表达。     

电针对急性脊髓损伤后Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的：观察电针治疗对大鼠脊髓损伤后神经细胞再生修复过程中Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响．并与甲基强的松龙进行阳性对照。 方法：实验于2003-04／2004-06在佳木斯医学院中心实验室进行。①将健康成年Wistar大鼠64只单纯随机分为模型组、电针组、甲基强的松龙组及假手术组4组（n=16），除假手术组外。其他3组大鼠采用改良的Allen’s捶击法（50g&;#183;cm）制成大鼠T10脊髓损伤模型，假手术组仅切除椎板。不损伤脊髓。②电针组在损伤后即刻取督脉上的大椎和命门两穴进行治疗，电针频率2Hz,疏密波形,强度2．5mA，以针刺处肌肉轻微抖动为宜，持续30min。甲基强的松龙组在损伤后即刻尾静脉内注射30mg／kg甲基强的松龙。模型组和假手术组不做治疗。③各组分别于术后6,24h各处死8只。应用免疫组织化学方法及图像定量分析法观察各组脊髓损伤早期Fas和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。 结果：经补充后61只大鼠进入结果分析。①脊髓损伤后6h：电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组（P〈0．05）。灰度值高于假手术和模型组相（P〈0．05,0．01）。②脊髓损伤后24h：电针及甲基强的松龙组Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数少于假手术组和模型组（P〈0．05），灰度值高于假手术和模型组（P〈0．05，0．01）；但电针与甲基强的松龙组组问差异不显著（P〉0．05）。 结论：电针可使Fas及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达下调，从而抑制细胞凋亡，保护神经细胞，对损伤脊髓的修复有积极的治疗作用，其效果与甲基强的松龙相似。     

低氧预处理对大鼠脑缺血再灌注B细胞淋巴瘤2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA表达的影响

目的：观察低氧预处理对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型B细胞淋巴瘤2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA表达的影响，探讨其脑保护作用及可能机制。 方法：①实验于2004—10／2005—06在苏州大学附属第一医院神经内科完成。选用清洁级成年SD雄性大鼠55只，随机分为3组：假手术组，对照组（缺血再灌注组）和低氧预处理组。②采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，假手术组只手术不插线。低氧预处理组在低氧预处理后12h制备脑缺血再灌注模型。③假手术组在缺血3h再灌注24h、对照组和低氧预处理组在缺血3h再灌注3，6，12，24，48h不同时间点，进行脑切片的苏木精一伊红染色、原位末端标记法检测细胞捅亡，免疫组化法检测B细胞淋巴瘤2水平、原位杂交染法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA表达。 结果：55只大鼠均进人结果分析。①假手术组无凋亡细胞，低氧预处理组的凋亡细胞较对照组明显减少（P〈0．05）。②低氧预处理组大鼠缺血再灌注3h可见B细胞淋巴瘤2阳性细胞数开始表达，再灌注24h达高峰，缺血再灌注6，12，24，48h均较对照组增高（101．40&;#177;2．78，68.20&;#177;1.45；137.92&;#177;2.41，81．34&;#177;9．28；172．21&;#177;289，103．12&;#177;2.61：105.68&;#177;12．67．60．12&;#177;1．47；P〈0.05）。③低氧预处理组和对照组缺血再灌注3h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA阳性细胞数的表达逐渐增加，至24h达高峰；低氧预处理组缺血再灌注12，48h阳性细胞数的表达均较对照组减少（45．96&;#177;5．02，85．48&;#177;7．88；33．84&;#177;4．67，56．31&;#177;7．02；P〈0．05）。 结论：低氧预处理的脑保护作用与其抑制神经细胞凋亡有关；而上调B细胞淋巴瘤2及下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA的表达，可能是实现保护作用、抑制凋亡的机制之一。     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Bcl-2及Bax和Bcl-xl表达的影响

背景：中枢神经系统损伤后，神经细胞的凋亡在继发性损伤中发挥重要作用。近年来有研究表明二甲胺四环素抑制凋亡对脑组织缺血有明显的神经保护功能。 目的：探讨二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和相关因子表达的影响及对损伤脊髓神经功能的保护作用。 设计：随机对照动物实验。 单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院。 材料：实验于2003—11／2004-12在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。成年雄性SD大鼠36只，随机分成4组：①空白组6只。②损伤组10只。③二甲胺四环素治疗组10只。④甲基强的松龙治疗组10只。 方法：建立脊髓损伤模型，空白组只暴露脊髓，不损伤；损伤组损伤脊髓，不治疗；二甲胺四环素治疗组大鼠伤后1h给予腹腔内注射二甲胺四环素（50ms／ks），24h后再次给予50mg,／kg剂量注射，然后再给予5d的25mg／kg的剂量治疗。甲基强的松龙治疗组大鼠伤后1h予腹腔内注射甲基强的松龙（100ms／ks）。空白组和损伤组予生理盐水注射，给药方法同二甲胺四环素治疗组。主要观察指标：①各组大鼠神经功能评估结果。②免疫组化法检测损伤脊髓神经细胞凋亡因子（Bcl-2，Bcl-xl，Bax）的表达。③各组大鼠脊髓组织细胞凋亡指数。 结果：36只大鼠均进入结果分析。①二甲胺四环素治疗组的神经功能较损伤组提高（P〈0．05），与甲基强的松龙组差异无显著性意义（P〉0．05）。②二甲胺四环素治疗组Bcl-2阳性表达细胞多于损伤组，差异有显著性[（62．53&;#177;7．76）％，（35．14&;#177;3．70）％，P〈0．05]，Bcl-xl，Bax表达与损伤组差异无显著性（P〉0．05）。③损伤组的凋亡阳性细胞多于二甲胺四环素治疗组和甲基强的松龙治疗组[（441．63&;#177;5．90）％，（32．71&;#177;5．26）％。（34．31&;#177;6．84）％，P〈0．05]。 结论：二甲胺四环素能上调Bcl-2的表达，改变Bcl-2／Bax的比值，从而抑制脊髓神经细胞凋亡，对损伤脊髓的神经功能有保护作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的抑制

目的：探讨大鼠脊髓损伤后应用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor bFGF)对脊髓损伤区细胞凋亡的影响。方法：利用Allen氏WD(Weight drop，WD)技术，以10g&;#215;2．5cm致伤力造成SD大白鼠Ts脊髓损伤模型，并于损伤平面以下蛛网膜下腔置细塑料导管。bFGF治疗组(A组)分别于术后即刻，1，2，4，8，12，24，及48h经导管注入bFGF溶液20μL(含bFGF100u），以后每周经导管注，20μL bFGF：对照组(B组)则在同时间注入等量生理盐水：损伤后1，3．7，14，28d对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测(TuNEL)，采用计算机图像分析技术进行定量分析并计算凋亡指数(AI)，AI=凋亡细胞核数，总细胞核数计算：结果：A，B两组中均发现凋亡细胞，A组损伤后不同时间段神经细胞凋亡指数分别为(4.57&;#177;0．43)，15．38&;#177;1.16)，(3．43&;#177;0．65)．(3.38&;#177;058)．(2．63&;#177;0．43)；B组分别为(7.36&;#177;0．68)，(13.96&;#177;2．74),(9．26&;#177;1．03)，(7．25&;#177;0．73)，(5．79&;#177;0．57).B组细胞凋亡率大于A组结论：bFGF能抑制脊髓损伤后脊髓损伤区的细胞凋亡。     

重组人红细胞生成素对大鼠脊髓损伤后神经细胞及其因子凋亡的影响

背景：在脊髓损伤中，除了创伤造成的直接损伤外，脊髓局部还将发生一系列的继发性病理改变。有研究显示重组人红细胞生成素能抑制细胞凋亡和炎症反应，具有神经保护作用。目的：通过观察大鼠脊髓损伤段神经细胞凋亡及相关因子的表达，探讨重组人红细胞生成素对脊髓损伤的保护作用。设计：随机对照实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨外科实验室和同济医学院病理科。对象：实验于2003-09／2004-05在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨外科实验室和同济医学院病理科进行。雌性成年SD大鼠30只，随机分成4组，①空白组6只，只暴露脊髓，不损伤。②损伤组8只，脊髓损伤，不用药物。③治疗A组8只，脊髓损伤，仅用重组人红细胞生成素。④治疗B组8只，脊髓损伤，联合应用重组人红细胞生成素和β-七叶皂甙钠。方法：①动物模型制作：24只大鼠应用改良的Allen方法致脊髓中度损伤。②给药：治疗A组于术后1，3，5，8，11d应用重组人红细胞生成素300U／（kg&;#183;d）。治疗B组应用重组人红细胞生成素剂量时间同治疗A组，β-七叶皂甙钠0．1mg／kg，1次／d，连用11d。空白组及损伤组尾静脉推注等容量生理盐水。③神经功能判断：在造模后1和12d分别由同一个实验者进行功能评分记录。行为观察：参照改良的Gale神经功能行为分析法评估，0分为严重障碍，6分为正常。斜板试验：观察大鼠抓握能力决定斜板角度的大小，反映神经功能恢复情况。④组织学检查：大鼠术后12d处死。取损伤段脊髓标本切片做苏木精-伊红染色。⑤神经细胞凋亡因子bcl-2，bax，fas检测：取标本做免疫组织化学染色，计数显微镜高倍视野内染色呈棕色的阳性细胞，计算阳性率。⑥凋亡神经细胞检测：采用原位末端标记法计算凋亡指数（凋亡细胞核数／总细胞核数）。各指标检测结果进行组内和组间比较。主要观察指标：①神经功能行为学评分及斜板实验结果。②损伤段脊髓组织学观察结果。③神经细胞凋亡因子检测结果。④凋亡神经细胞检测结果。结果：①神经功能行为学评分及斜板实验结果：1和12d空白组无显著差异。损伤组12d斜板角度显著大于1d时（P〈0．05）。治疗A和B组12d行为评分及斜板角度值均显著大于1d时（P〈0．05），且显著大于损伤组P〈0．05）。②损伤段脊髓组织学观察结果：损伤组损伤段变细，脊髓内有大部分坏死和大量胶质细胞增生；治疗A，B组大多数神经组织正常，治疗B组组织结构优于A组。③神经细胞凋亡因子检测结果：损伤组bax，fas凋亡阳性细胞明显多于治疗A，B组[损伤组（25．75&;#177;3．37）％和（41．37&;#177;2．83）％，治疗A组（19．87&;#177;3．56）和（26．00&;#177;3．29）％，治疗B组（12．00&;#177;2．97）和（17．50&;#177;2．20）％，P〈0．05]；bcl-2显著低于治疗A，B组[（9．75&;#177;1．83）％，（14．63&;#177;2．83）％，（21．63&;#177;5．34）％，P〈0．05]。④凋亡神经细胞检测结果：损伤组细胞凋亡指数明显高于治疗A，B组（50．75&;#177;5．39，34．75&;#177;3．01，24．00&;#177;3．46，P〈0．05）。结论：细胞凋亡是脊髓损伤后神经元死亡的一种重要方式。重组人红细胞生成素能抑制脊髓神经细胞凋亡，对损伤脊髓的神经功能具有保护作用。     

三七总皂甙对大鼠脊髓损伤后行为学变化及细胞凋亡的影响

目的：观察三七总皂甙对大鼠脊髓损伤细胞凋亡的保护作用并分析其可能的作用途径。 方法：实验于2005—06／11在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。实验共选取64只SD大鼠，随机分为损伤组和三七总皂甙组。每组32只，采用改良Allen’s重物打击法造成大鼠中度脊髓损伤，三七总皂甙组于伤后30min腹腔注射50g／L三七总皂甙（100mg／kg），伤后2，4h用50mg／kg，以后1次／d。剂量200mg/kg，连用12d。损伤组于伤后各时间点腹腔注射等体积生理盐水。观察比较治疗后不同时间大鼠行为评分、斜板试验、组织学检查及脊髓神经细胞凋亡指数变化。 结果：64只SD大鼠全部纳入结果分析。①三七总皂甙组和损伤组大鼠在7d时行为评分分别为2．50&;#177;0．53、1．38&;#177;0．74，14d时分别为3．25&;#177;0．89、1．75&;#177;0．71，两组比较差异有显著性（t=-3．473，-3．742，P〈0．05）。②三七总皂甙组与损伤组1，3，7，14d各时间点斜板最大角度差异均有显著性（t=-4．081，-4．235，-4．245，-4．687，P〈0．05）。③苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂甙组明显轻于损伤组。④损伤组大鼠脊髓损伤后1d在灰质及白质中均可见标记阳性细胞，损伤3d后凋亡指数渐增，7d达高峰；三七总皂甙组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数较损伤组低，高峰提前，发生在损伤后3d，以后逐渐降低。两组比较差异均有显著性（t=4．196，2.627，7．732，3．547，P〈0．05）。 结论：三七总皂甙能抑制脊髓损伤神经细胞凋亡，对损伤脊髓的神经功能具有保护作用。     

双后肢腰椎退行性变大鼠椎间盘半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达

目的：观察双后肢腰椎退行性变大鼠模型中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的表达变化。 方法：实验于2005-05／2006-03在上海中医药大学动物中心实验室完成。将20只雄性SD大鼠单纯随机分为正常组和模型组2组，各10只。模型组大鼠离断双肩关节，模拟直立行走，正常组不干预。3个月后，拉颈处死动物．取腰椎L3-4和L4-5，椎间盘，使用电镜观察腰椎间盘细胞微观形态；免疫组化法检测关节软骨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达，阳性表达为棕黄色，主要存在于细胞浆内，用平均灰度值和平均吸光度对阳性信号进行量化（灰度值越小表达信号越强，平均吸光度则反之）；反转录一聚合酶链反应法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3mRNA的表达强度。 结果：20只大鼠均进入实验结果分析，无脱失。①正常组未见有明显凋亡细胞，而模型组椎间盘出现明显凋亡。②半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：模型组明显高于正常组（平均灰度值：134．67&;#177;11．12，178、10&;#177;1．08，P＜0．01；平均吸光度：0．282&;#177;0．034，0．155&;#177;0．005，P＜0．01）。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA表达：模型组明显高于正常组（2．642&;#177;0．365．0．172&;#177;0．028，P＜0．01）。 结论：双后肢腰椎退行性变大鼠模型中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达增高，细胞凋亡增多。     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3对缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡的影响

背景：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在正常细胞中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后能够被激活从而引起细胞凋亡。 目的：通过检测脑海马组织胞质S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性及海马区神经元凋亡情况，探讨全脑缺血再灌注后脑海马神经元凋亡与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的关系。 设计：随机对照实验。 单位：解放军第三军医大学西南医院急救部。 材料：实验于1999-01／04在解放军第三军医大学西南医院完成。选取雄性Wistar大鼠182只，随机分为3组：假手术组14只，脑缺血再灌注组84只，乙酰天冬氨酰谷氨酰缬氨酰天冬氨酸乙醛（acetyl-asp-glu-valasp．aldehyde，AC-DEVD-CHO）治疗组84只，后两组均设立缺血再灌注8，24。48，72，120，168h 6个时相点，每个时相点14只大鼠。 方法：脑缺血再灌注组、AC-DEVD-CHO治疗组建立大鼠全脑缺血20min再灌注模型，分别于再灌注后8，24，48，72，120，168h处死取海马组织；假手术组施行麻醉及手术，但不夹闭颈总动脉和烧灼椎动脉，术后观察72h后处死取海马组织备检。以单位质量标本于单位时间内裂解产生的氨甲基香豆素量表示标本中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性。各组不同时相点脑组织切片封固后在荧光显微镜下于330～350nm处观察脑海马细胞凋亡情况。 主要观察指标：①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化。②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系。 结果：实验纳入182只大鼠，脱落14只，共168只大鼠进入结果分析。①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化：假手术组术后观察72时为0。与脑缺血再灌注组比较，AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24，48，72，120，168h均明显降低[（1．71&;#177;0．03），（1．22&;#177;0．03）；（2．77&;#177;0．09），（1．59&;#177;0．7）；（5．54&;#177;0．51），（2．3&;#177;0．19）；（6．28&;#177;1．71），（3.43&;#177;0．46）；（3．11&;#177;1．21），（1．73&;#177;0．14）nkat／kg；P〈0．05或0．01]。②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况：每400倍视野下，假手术组术后观察72h为（1．2&;#177;0．4）个。与脑缺血再灌注组比较，AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24，48，72，120，168h均明显降低[（6．4&;#177;1．7），（2．8&;#177;0．8）；（11．8&;#177;1．3），（5．8&;#177;1．9）；（19．8&;#177;3．1），（10．0&;#177;1．9）；（31．2&;#177;5．9），（16．4&;#177;2．4）；（19．8&;#177;2．3），（9．0&;#177;2．3）个／400倍视野；P〈均0．011。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系：脑缺血再稽注组、AC-DEVD-CHO治疗组均行直线相关分析，二者的变化呈显著正相关（r分别为0．9356及0．9800，P均〈0．01）。 结论：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活是引起海马神经元调亡的主要因素之一，在缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡中起着重要作用。     

小鼠短暂前脑缺血海马区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达形式的变化

背景：脑缺血再灌注损伤后，细胞凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达量及蛋白酶活性明显增加，针对其磷酸化与去磷酸化两种形式进行观察，了解其在脑缺血再灌注损伤时的变化情况。目的：观察脑缺血再灌注时小鼠脑海马区中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达形式的变化。设计：随机对照实验。单位：首都医科大学生物化学与分子生物学系。地点和材料：实验于2003-06在首都医科大学附属北京朝阳医院高压氧科实验室进行。按随机数字将30只雌性SPF级C57BL／6N小鼠分为假手术组、缺血再灌注6，12，24和48h5组，每组6只小鼠。方法：缺血再灌注的4组小鼠夹闭双侧颈总动脉20min后再通血流．建立前脑缺血再灌注动物模型，分别于再灌注6，12，24及48h取脑海马；假手术组不夹闭颈总动脉，24h后取脑海马。用蛋白免疫印迹法测定脑海马中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3酶原表达的变化。主要观察指标：各组小鼠脑海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原总量，及其磷酸化和去磷酸化水平比较。结果：经补充后30只小鼠进入结果分析。①脑海马区总半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原水平：缺血再灌注12，24h组显著高于假手术组（9133．1&;#177;2216．3，9355．9&;#177;1901．6，P〈0．05）。②去磷酸化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原水平：缺血再灌注24h组显著高于假手术组（7812．0&;#177;1625.1，3825.8&;#177;155．6，P〈0．05）。③磷酸化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原水平：各组与假手术组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：结果提示脑缺血再灌注损伤诱发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原表达增加；其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原去磷酸化水平升高明显，说明脑缺血再灌注损伤可能诱发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原去磷酸化，继而促进其转化为活性形式。     

碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤后bcl-2及bax基因表达的影响

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对脊髓损伤后bcl-2和bax基因表达的影响。方法：利用Allen WD法以25gcf致伤SD大鼠脊髓制作损伤模型，经蛛网膜下腔导管于术后即刻，0.5，1．2，3，4，6,12，24，48h导管注入bFGF20μL(含bFGF200U)；对照组相同时间点注入等量生理盐水作对照。术后2，6，12，24，48h取损伤脊髓组织，采用免疫组化和原位杂交方法分别检测Bcl-2、Bax蛋白和bcl-2 mRNA基因的表达。结果：脊髓损伤后应用bFGF显著促进bcl-2基因的表达，2，6，12，24，48h Bcl-2平均光密度值分别为0.165&;#177;0.020,0.254&;#177;0.081，0．312&;#177;0．017,0.415&;#177;0．021，0．304&;#177;0．031，(P&;lt;0．01，t=2.729—9．279),Bax平均光密度值分别为0．034&;#177;0．021，0．184&;#177;0.014，0．204&;#177;0．014．0.216&;#177;0027，0．180&;#177;0.013(P&;lt;0.01，t=4．601～6，376),提高Bcl-2蛋白的含量，降低了Bax蛋白的水平，每组数据差异具有统计学意义。结论：bFGF通过促进bcl-2基因的表达、抑制Bax蛋白的表达抑制脊髓损伤后神经细胞的凋亡，从而保护脊髓组织，这可能是bFGF对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。     

大鼠脊髓损伤后转化生长因子β1 mRNA表达变化及甲基强的松龙的干预作用

目的：观察大鼠脊髓损伤后转化生长因子β1 mRNA表达的变化，及甲基强的松龙对其影响。方法：实验于2003-06／2004—03在上海市药物工业研究院与解放军第二军医大学长海医院病理实验室完成。选择雄性SD大鼠45只，随机分为空白对照组5只、损伤对照组（6，24h，3，7d）、甲基强的松龙组（6，24h，3，7d），每时间点5只。制作脊髓损伤模型后，损伤对照组及空白对照组给予等渗盐水，甲基强的松龙组给予甲基强的松龙（30mg／kg），分别于伤后6，24h，3，7d切取损伤及临近部位脊髓组织，运用原位杂交技术，二氨基联苯胺显色，苏木精轻度复染。采用光学显微镜进行观察，高倍镜下（200倍），随机选择5个高表达视野，记数每个高倍镜视野下阳性细胞的百分比（阳性细胞数／细胞总数）。细胞胞浆内呈棕黄色为转化生长因子β1 mRNA。观察甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤转化生长因子β1 mRNA表达的影响。结果：纳入动物45只，均进入结果分析。①脊髓损伤后甲基强的松龙组转化生长因子β1 mRNA的表达阳性细胞数与损伤对照组相比明显降低[损伤对照组伤后6，24h，3，7d分别为（8．91&;#177;0．82）％，（28．27&;#177;1．10）％，（42．09&;#177;0．93）％，（45．24&;#177;0．85）％，甲基强的松龙组伤后6，24h，3，7d分别为（7．93&;#177;0．40）％，（20．36&;#177;1．10）％，（31．34&;#177;0．62）％，（16．62&;#177;0．97）％]。②阴性对照未见转化生长因子β1 mRNA阳性表达。甲基强的松龙组和损伤对照组均有转化生长因子β1 mRNA阳性表达，甲基强的松龙组同损伤对照组相比，各时段转化生长因子β1 mRNA表达均有减少，且差异明显。结论：甲基强的松龙能抑制大鼠脊髓损伤后转化生长因子β1 mRNA的表达，说明甲基强的松龙对脊髓损伤的治疗作用不是通过转化生长因子β1来实现的。     

尼莫地平对大鼠坐骨神经损伤后脊髓神经元的保护作用

目的：研究尼莫地平对大鼠坐骨神经损伤后脊髓神经元的保护作用。方法：将50只成年SD大鼠，随机分成4组：假手术组(A组，n=5)；坐骨神经切断未干预组(B组，n=15)；生理盐水组(C组，n：15)；尼莫地平组(D组，n=15)。B，C及D3组又按切断右侧坐骨神经后4，9及16d取材时间分为3个时间组，每组5只大鼠，各时间组取大鼠的脊髓L5段．以TUNEL法检测细胞凋亡数，以免疫组化技术检测Bax的表达，苏木精一伊红染色计算脊髓内神经元的数目。结果：坐骨神经损伤后4，9及16d，C组凋亡细胞数目为(8．4&;#177;1．8)，(13．1&;#177;2．1)，(15．4&;#177;1．8)个／前角视野，明显多于D组(2.3&;#177;1．3)，(8．2&;#177;1．7)，(10．1&;#177;2．2)个／前角视野(P&;lt;0．01)；D组神经元存活率为(94．3&;#177;3．1)％。(85．4&;#177;3．1)％，(76，3&;#177;3．2)％，明显高于C组(84．1&;#177;4．5)％。(77．52．9)％，(67．0&;#177;3．5)％，差异有非常显著性意义(P&;lt;0．01)；D组Bax表达(-～+，+～++，+～++)低于c组(+，+～++，+++)；B与C组凋亡细胞数目、神经元存活率及Bax表达差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：尼莫地平可以减少坐骨神经损伤后脊髓神经元的凋亡及Bax的表达．因此，对脊髓神经元具有保护作用。     

电针抗脊髓损伤的实验研究

背景：现有的研究结果证实神经生长因子在脊髓损伤后神经再生修复过程中发挥着重要作用，神经再生能力低下与损伤局部缺少支持神经元生长的微环境有关。针刺对脊髓损伤后的神经保护是否通过促进担损伤脊髓组织中神经生长因子水平的提高而起作用，目前尚缺少大量分子水平的实验证实数据。 目的：采用形态学、原位杂交等技术观察电针对实验性脊髓损伤大鼠运动功能、脊髓组织形态及其神经生长因子mRNA表达的影响。 设计：随机对照动物实验。 单位：同济大学附属第十人民医院针灸科，上海市针灸经络研究所。 材料：实验于1999-01／2002-02在上海市针灸经络研究所完成。选取雄性SD大鼠15只，体质量（260&;#177;9．52）g，随机分成假手术组、损伤对照组和电针组，各5只。 方法：损伤对照组和电针治疗组制备脊髓损伤模型，假手术组仅作椎切除。术后2h，对电针治疗组给予电针治疗，取大椎、命门和L2夹脊、环跳，两组穴位交替使用。针刺后接G6805型电针仪，疏波，0．8Hz0．3-0．6mA，以肌肉有轻微的抖动为宜。1次／d，每次30min，连续治疗30d。损伤对照组和假手术组不作任何处理。采用自行改良的Tarlow评分标准和Rivlin方法分别于术后2h，30d进行运动功能测定。①改良的Tarlov评分标准：以完全瘫痪，针刺时下肢无反应到正常行走记作0-6分。②改良的Rivlin方法：斜板由两块矩形的合金板通过铰链于一端相连而成，板从水平位置（0&;#176;）起绕轴旋转，斜面角度可以测出。将大鼠头朝前，身体纵轴与斜板纵轴垂直放置，逐渐增大板与水平间的角度，直至大鼠不能保持原有位置5s时，记录这一临界角。原位杂交检测，光镜下明视野记录神经生长因子阳性细胞数并摄片。 主要观察指标：脊髓损伤大鼠运动功能评分（改良的Tailov评分）、脊髓损伤大鼠斜面测试临界角度（改良的Rivlin方法）、各组脊髓组织神经生长因子mRNA阳性细胞数的变化。 结果：实验大鼠15只，全部进入结果分析。①大鼠脊髓损伤2h后，损伤对照组和电针治疗组运动功能评分和改良的Rivlin方法斜面临界角均明显下降；30d后，两组的改良的Tarlow评分运动功能评分和斜面临界角均有不同程度的恢复，但以电针组的恢复较明显，与损伤对照组比较，差异有显著性意义[35．40&;#177;6．62，27．80&;#177;1．10；（35．40&;#177;6．62）.（27．80&;#177;1．10）。P〈0．05]。②伤后30d，电针治疗组大鼠病理损害程度，较损伤对照组轻，脊髓组织形态的损伤，神经生长因子mRNA阳性细胞，数的增加较损伤对照组明显（28．13&;#177;1．64，12．63&;#177;1．41．P〈0．01）。 结论：电针可促进脊髓组织中神经生长因子mRNA的表达，可能减轻脊髓组织形态的损伤，促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，因其神经生长因子mRNA的表达而起到神经保护作用。     

大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶的表达及动态改变

目的：探讨大鼠急性脊髓损伤后不同时段髓内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA动态表达。方法：36只SD大鼠抽签法随机分组，任选一组作为对照。采用Allen法制作急性脊髓损伤模型，在损伤后2，6，12，24，48h等时段，以反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)分析：iNOS mRNA表达。在脊髓损伤后24h，用免疫组化方法分析iNOS在脊髓不同类型神经细胞中的表达与分布，并以比色法测定脊髓损伤后血清NOS及一氧化氮的含量。结果：脊髓损伤后，神经元、星形细胞和小胶质中均可见iNOS表达，以神经元表达为主。脊髓损伤后2h可见iNOS表达0．56&;#177;0．02，24h达高峰1．20&;#177;0．05，48h开始降低0．70&;#177;0．06。血清中NOS及一氧化氮的动态改变与损伤组织iNOS mRNA变化趋势相一致。结论：研究资料提示脊髓损伤后脊髓内iNOS表达增高，过量产生的一氧化氮加重了继发性脊髓损伤。