胚胎后肾间充质干细胞的分离和生物学特性研究

目的探讨建立一种简便有效的体外分离纯化大鼠胚胎后肾问充质干细胞（MMSCs）的方法,并研究MMSCs的生物学特性。方法孕14天清洁级SD大鼠,脱颈处死后取其胚胎,分离胚胎肾,剪碎后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养;于倒置显微镜下观察培养细胞形态变化,利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定MMSCs的生长曲线,经流式细胞仪检测CD45、CD90及CD133的表达。结果培养细胞呈现梭形或类纤维样,贴壁生长,增殖对数期始于接种后2～3人,5～6天后增殖能力减慢,渐进入平台期。CD45、CD90和CD133表达率分别为1．94％、95．43％和95．31％。结论培养细胞为胚胎后肾问充质十细胞,符合间充质干细胞特性。     

大鼠胚胎后肾间充质干细胞体外诱导分化的实验研究

目的 研究大鼠胚胎后肾间充质干细胞(MMSCs)体外诱导分化的生物学特性.方法 原代分离培养后肾间充质干细胞,在体外特定诱导条件下观察细胞向成骨细胞、脂肪细胞及肾小管上皮细胞的分化及其形态演变,采用细胞免疫荧光检测细胞表面特定蛋白的表达变化.结果 大鼠后肾间充质干细胞在特定诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞及上皮细胞分化,免疫荧光结果显示分化后的上皮细胞E-cadherin蛋白表达明显增强,而vimentin、fibronectin的表达则明显降低甚至无表达.结论 大鼠胚胎后肾间充质干细胞在特定条件下有定向分化的能力,具有潜在分化为肾实质细胞的能力.     

Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的对Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）进行分离培养,并检测其生物学特性。方法采用0．85％NH4Cl分离培养Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs,检测生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力鉴定。结果BMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力。第5代细胞生长速度较第3代略减慢。细胞周期显示93．79％细胞处于G0～G1期。表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达CD29和CD90,几乎不表达CD45。在体外能够向成骨细胞分化。结论Long-Evans大鼠股骨来源骨髓间充质干细胞经0．85％NH4Cl分离培养后,纯度高,具有良好生物学特性。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)体外分离培养和扩增方法,观察MMSCs在体外培养的生物学特性,为MMSCs的临床应用奠定技术基础.方法 采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增MMSCs,光镜观察MMSCs生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析MMSCs纯度.结果 MMSCs贴壁生长,呈典型MMSCs形态和生长特征,原代及传代5代内的MMSCs均有活跃的增殖能力,其中CD105阳性细胞＞98%.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法可获得高纯度和高增殖活性的MMSCs,成人MMSCs至少在传代培养5代内生长旺盛并维持其生物特性,可满足临床治疗和人体生物组织研究要求.     

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stemcells,r MSCs)和体外传代培养技术,并对r M-SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离r MSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后r MSCs的生长、增殖情况。[结果]r MSCs在体外培养扩增,原代可获得(5~6)×105、第5代可获得(2~3)×108个细胞。r MSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,r MSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是r M-SCs,具有r MSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的体外分离、培养及诱导分化

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性.方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第1、5及10代细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD13、CD44、CD14、CD34与HLA-DR);化学染色(油红O、茜素红染色)及RT-PCR检测其体外诱导成脂和成骨分化的能力;RT-PCR检测胚胎十细胞特异性标志基因OCT-4.结果:体外培养4～6 d后,有细胞从组织块中游出;细胞传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变.培养细胞表达CD13与CD44,但CD14、CD34及HLA-DR呈阴性表达.体外诱导实验证实,该细胞具有成脂和成骨分化的能力.RT-PCR显示其表达OCT-4基因.结论:人脐带MSCs能在体外培养、扩增并且具有和骨髓MSCs类似的生物学特性,可作为组织工程种子细胞来源.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性.方法采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达.结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降.流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性.细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)%,其中S期为(4.12±2.35)%;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)%,说明大部分细胞仍然处于静止期.流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征.结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数.     

豚鼠骨髓间充质干细胞分离培养及形态学观察

目的：分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞（MMSCs）,并通过观察了解其细胞生物学特性。方法：利用MMSCs和其它细胞不同的生长特性,采用细胞差速贴壁法,以含10%（体积分数）标准胎牛血清的L-DMEM培养基培养;用2.5%胰蛋白酶、37℃条件下消化,按1∶2的比例传代;倒置相差荧光显微镜下逐日观察各代MMSCs形态及生长情况。结果：经数次换液和连续传代培养,红细胞等杂质逐渐减少,可得到形态较均一的MMSCs,其增殖速度和细胞活性良好。结论：细胞差速贴壁法经济可靠、操作简单、易于掌握,是体外分离培养MMSCs的可行的实验方法;以此法获得的豚鼠MMMSCs生长旺盛,活性好,增殖能力强。     

人胎儿骨髓间充质干细胞体外分离培养及诱导分化为类肝细胞

目的建立人胎儿骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)的体外分离、培养方法,体外诱导分化MMSCs为类肝细胞,观察MMSCs细胞生物学特性,并对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。方法采用体外细胞培养技术,分离培养人胎儿MMSCs,在1%Matrigel做基质,2.5μmol/ml AZA预处理10~12h,HGF 10ng/ml FGF4 10ng/ml HGM培养基中诱导。用显微摄像和MTT研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和RT-PCR鉴定细胞表型。采用ELISA法检测培养上清中人清蛋白水平。结果24h换液后可获得约(300±80)个贴壁细胞;培养细胞在种植后1~3d为生长滞留期,第4天达到对数生长期,以后进入到平台期,细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线类似。连续传10代后,每个胎儿来源的MMSCs可扩增达1011~1012个细胞。MMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。在添加FGF4和HGF的Matrigel上诱导培养的MMSCs在21~28d时,细胞形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%~50%,双核细胞比率5%~7%。免疫组化和RT-PCR检测显示未诱导培养的MMSCs中,有较少的细胞表达AFP及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞浆蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、AFP和CK19及其mRNA,至诱导后期表达下降,而ALB、CK18、GST-π和肝细胞转录因子HNF-1α表达逐渐上升。ALB、CK18阳性细胞比例达61%~65%。未诱导分化的MMSCs没有分泌ALB,诱导分化的MMSCs以时间依赖方式产生清蛋白。结论人胎儿MMSCs分离成分单纯,增生旺盛。诱导培养可获得高比例的类肝细胞。MMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后MMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。     

Study on the differentiation of embryonic stem cells derived epidermal stem cells into sweat gland cells in vitro

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源.方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞.将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果.结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达.培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志.经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化.结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源.     

小鼠后肾发育中的细胞凋亡及凋亡小体行踪的超微结构

 目的 观察小鼠后肾发育过程中所出现的细胞凋亡及凋亡小体的行踪。方法 应用光镜和透射电子显微镜技术观察胚龄12，14，16，18 d 胎鼠后肾发育过程中细胞凋亡及凋亡小体的超微结构。结果 后肾发育中程序性细胞死亡是由经典的细胞凋亡和坏死样程序性死亡所组成，其中以经典的细胞凋亡为主要形式。细胞凋亡后形成凋亡小体。凋亡小体是由少量皱缩的细胞质和固缩的染色质碎块组成，一旦出现即被邻近细胞所吞噬。后肾内间质细胞、输尿管芽细胞以及发育中肾单位内各种细胞都具有很强的吞噬凋亡小体的能力。被吞噬的凋亡小体体积大小不一，数量不等，细胞器首先被消化，染色质碎块随后被消化。结论 后肾发育时期凋亡细胞主要由后肾自体细胞吞噬处理，后肾内各种细胞都具有较强的吞噬凋亡小体的能力。     

LIF诱导小鼠胚胎后肾间充质细胞分化形成肾上皮细胞

目的 观察白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）能否诱导后肾间充质细胞（metanephric mesenchymal cells,MMCS）分化形成肾上皮细胞,并探讨其机制.方法 取孕11.5天的小鼠胚胎,分离后肾间充质组织,去除输尿管芽,Pax-2染色鉴定.对鉴定后的肾间充质细胞进行体外培养,并在培养液中加入细胞因子成纤维细胞生长因子（FGF2）、转化生长因子（TGF-α）和LIF进行诱导,用免疫荧光染色和RT-PCR检测后肾间充质细胞分化形成肾上皮细胞过程中的形态学和基因表达变化.结果 经细胞因子LIF处理,后肾间充质细胞由排列杂乱无序的细胞发育形成有连续基底膜的肾小球.RT-PCR检测发现上皮细胞标记因子（E-caderin、Collagen Ⅳ、podocalyxin）的表达逐渐增高.结论 LIF能诱导后肾间充质细胞分化形成肾上皮细胞,可为肾脏疾病的细胞治疗提供实验依据.     

肾脏偶发小肿瘤的诊断和治疗

目的提高肾脏偶发小肿瘤的诊治效果。方法对192例肾脏偶发小肿瘤进行回顾性研究,探讨其影像学检查特点和治疗方法。结果诊断为肾脏透明细胞癌160例,血管平滑肌脂肪瘤18例,后肾腺瘤14例。术中冰冻病理报告为后肾腺瘤、术后病理报告为透明细胞癌3例,术前诊断肾癌行根治性肾脏切除术、术后病理检查结果为肾血管平滑肌脂肪瘤2例。肾癌、后肾腺瘤超声表现为低回声为主58.1%（93/160）,肾血管平滑肌脂肪瘤超声表现为高回声为主44.4%（8/18）。CT扫描肾癌增强扫描CT值略高于后肾腺瘤和肾血管平滑肌脂肪瘤。肾血管平滑肌脂肪瘤位于肾脏边缘突向肾外部分大于肿瘤1/2者占83.3%。肾癌行根治性肾切除术生存率与保留肾单位术后生存率无显著差异,而且保留肾单位手术后仅1例再发肾癌。结论影像学检查难以准确判断肾脏偶发小肿瘤的性质,肿瘤位于肾脏边缘突向肾外部分大于肿瘤1/2者可能为肾血管平滑肌脂肪瘤。肾脏偶发小肿瘤应该采取保留肾单位手术。     

后肾性腺瘤3例分析

目的：探讨后肾腺瘤的临床、病理学持征及诊断要点。方法：收集3例后肾腺瘤的临床资料，手术切除标本，采用常规HE染色，SP法免疫组化染色，结合复习文献进行讨论。结果：临床表现不典型；组织学主要由紧密排列的小管状、乳头状腺体构成，其间含有肾小球样结构，免疫组化结果：Leu7( )，Vimentin( )，CK7灶性( )，EMA( )，CK(-)。结论：后肾性腺瘤是肾胚胎残留发生的罕见良性肿瘤，常被误诊为恶性肿瘤，应与肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌、神经内分泌肿瘤、肾母细胞瘤病和肾源性残余病变等鉴别。     

后肾腺瘤五例诊治分析

目的探讨后肾腺瘤的临床症状、影像学及病理学特点、治疗及效果,提高其诊治水平。方法回顾性分析我院2000—2010年收治的5例后肾腺瘤患者的临床症状、实验室检查、影像学检查、病理检查结果、治疗方案及效果。结果患者均经彩色多普勒超声检查发现,经CT检查诊断为肾肿瘤,经病理及免疫组化检查证实为后肾腺瘤。行手术治疗,随访4个月~5年均无瘤生存。结论后肾腺瘤是一种非常罕见的肾脏良性肿瘤,保留肾单位的肿瘤剜除术或肾切除术具有良好的治疗效果,术后长期随访具有重要意义。     

后肾腺瘤1例并文献复习

目的探讨后肾腺瘤的临床、病理形态学特征及诊断要点。方法采用常规HE染色及免疫组化染色,并复习相关文献进行总结。结果后肾腺瘤由紧密而规则排列的圆形小管状、乳头状腺体构成,含有圆形细胞巢的实性区域相间构成,偶可见肾小球样结构。免疫组化结果:Vimentin、CK阳性及EMA阴性为特点。结论后肾腺瘤是一种罕见的胚胎性上皮源性良性肿瘤,常被误诊为恶性肿瘤,应与肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌等鉴别。     

βⅢ-微管蛋白在人胎肾发育不同时期的表达及意义

目的:观察βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)在人胎肾发育不同时期的表达,初步探讨其在肾胚胎发育过程中的意义。方法:取11～32周人胎肾10例,常规石蜡包埋切片,免疫组织化学二步法检测βⅢ-tubulin在不同阶段胎肾组织上的表达情况,图像分析软件分析结果。结果:正常人胎肾中,在肾浅层皮质生后肾组织帽、原始肾小球、分化早期肾小管有βⅢ-tubulin阳性表达,呈棕黄色;在深层皮质成熟肾小球和肾小管未见表达;被膜、髓质可见血管内皮表达。结论:βⅢ-tubulin主要表达于肾小球形成初期,成熟肾小球和肾小管未见表达,提示其可能在胎肾的肾小球形成早期起作用,随着发育的成熟而消失。     

组织块重复贴壁使用在原代细胞培养中的实验意义

目的旨在提高采用人脐静脉组织块贴壁法进行平滑肌细胞原代培养组织块的重复利用率,进而缩短采用细胞培养进行实验的培养周期。方法以改良人脐静脉平滑肌细胞贴壁培养法为基础,当原代培养细胞(对照组)进行第1次细胞传代后,将培养组织块再次接种于新培养瓶中继续培养(实验组),分别记录两组细胞爬出时间、第1次传代时间、以及第1次传代后24、48、72、96h的细胞计数,通过倒置显微镜对两组细胞进行形态学观察,采用抗α-actin免疫细胞化学方法,对两组传代细胞的类型和性质进行鉴定。结果与对照组比较,实验组细胞爬出时间及第1次传代时间均明显缩短(P<0.05);两组第1次传代后24、48、72、96h细胞计数差异均无统计学意义(P>0.05);两组细胞形态经α-actin鉴定差异无统计学意义。结论人脐静脉组织块重复贴壁培养后,经传代其细胞数量、细胞形态与原代组织块贴壁培养的细胞差别均无统计学意义。     

METANEPHRIC ADENOMA IN CHILDREN： REPORT OF TWO CASES AND REVIEW OF LITERATURE

Metanephric adenomas are uncommon benign re-nal tumors. Relatively, the tumors are more involvedin adult females and rarely found in children. Theimaging characteristics of the lesions are lacking andhave not been described clearly. Now we reviewedthe man…