LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

LCRGl基因5’端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的：LCRGl基因的调控机制至今不清楚，本研究拟克隆LCRGl基因的转录起始区上游序列，寻找与其表达有关的调控序列。方法：利用生物信息学技术预测LCRGl基因5’端调控区域的启动子活性区域，采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp-＋585 bp）片段，并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中。与内参照质粒PhRL—SV40共转染COS7细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：成功扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp- ＋585bp）片段，测序正确；pGL3—1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0．16倍，为阴性组pGL3basic的35倍。结论：成功克隆LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191 bp- ＋585bp），该片段具有启动子活性。     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。     

hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中的特异生物活性

目的: 构建带有survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体，探讨survivin启动子在HeLa细胞中的特异表达活性。 方法: 采用PCR技术扩增survivin启动子，插入pGL3Basic载体，构建携带survivin启动子的pGL3Basic真核表达载体（pGL3Basic/ Surp）。纯化pGL3Basic/ Surp质粒，用脂质体法转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304，48 h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应，检测荧光素酶活性。 结果: 成功克隆1 kb survivin基因启动子，并构建了携带有survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体，转染后的Hela细胞荧光素酶活性为2074.2±78.5，而ECV304荧光素酶活性为9.7±1.1。 结论： 成功克隆的survivin启动子在HeLa细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性，为进一步开发肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础     

人CYP19基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆人CYP19基因启动子PⅠ.3（-345～-234bp）、PⅡ（-517～-278bp）和PⅠ.7（-299～＋81bp）片段,构建启动子荧光素酶报告基因载体。[方法]采用生物合成PⅠ.3（-345～-234bp）、PⅡ（-517～-278bp）和PⅠ.7（-299～＋81bp）区域基因片段,通过HindⅢ和KpnⅠ酶切连接到pGL3-Basic载体上。[结果]测序验证pGL3-Basic-PⅠ.3,pGL3-Basic-PⅡ和pGL3-Basic-PⅠ.7构建成功。[结论]pGL3-Basic-PⅠ.3,pGL3-Basic-PⅡ和pGL3-Basic-PⅠ.7荧光素酶报告基因载体的成功构建,为进一步研究CYP19基因组织特异性表达奠定基础。     

人类生存蛋白启动子的克隆及其在淋巴瘤细胞中的转录活性研究

  目的　克隆人类生存蛋白（Survivin）核心启动子,研究Survivin启动子在人类淋巴瘤细胞Ramos和健康人肝脏细胞Chang Liver中的转录活性。方法　以人类肠基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子987 bp片段,将其通过酶切位点连入pGL3-Basic载体构建pGL3-Survivin荧光素酶报告基因载体,通过脂质体转染法转染Ramos和Chang Liver 细胞,通过检测荧光素酶表达水平,比较Survivin启动子在这两种细胞中的转录活性。结果　成功克隆出987 bp的Survivin启动子;双酶切、PCR检测和DNA测序证实pGL3-Survivin载体构建成功;荧光素酶活性检查显示：Survivin启动子在Ramos细胞中的转录活性为阳性对照CMV启动子活性的4.5 %,明显高于在Chang Liver细胞中的0.19 %,在淋巴瘤细胞中具有较高特异性,且在淋巴瘤细胞中的活性明显高于阴性对照pGL3-Basic的0.086 %。结论　Survivin启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性,可以作为淋巴瘤细胞基因转染的肿瘤特异性启动子使用。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

人P21WAF1/CIP1启动子荧光素酶真核表达载体的构建

目的：构建含人P21^WAF1/CIP1基因启动子的表达载体pGL3-P21p。方法：以全血总RNA为模板,经RT-PCR扩增P21^WAF1/CIP1基因启动子,并将其克隆到T-easy载体,测序分析,然后经酶切再克隆到pGL3-basic,构成重组真核表达载体pGL3-P21p。将pGL3-P21p转染到乳腺癌细胞株MCF7中,并检测细胞中荧光素酶的活性。结果：经测序、酶切等检测证实重组真核表达载体pGL3-P21p构建成功,荧光素酶活性检测显示P21^WAF1/CIP1基因启动子对荧光酶基因表达起到了正调控作用。结论：P21^WAF1/CIP1启动子荧光素酶真核表达载体的成功构建为进一步研究P21^WAF1/CIP1基因启动子的表达调控奠定了基础。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的：构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法：PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论：成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

胰头癌手术切除可能性的术前评价

目的通过总结胰头癌病人的临床表现和影象学检查结果来评价手术切除的可能性。方法总结32例胰头癌病人的临床表现和CT、磁共振（MRI）检查结果,判断肿瘤是否已发生邻近浸润或远处转移,以此来评价其手术切除的可能性。结果在22例作CT检查的病例中,判断正确的为17例,准确率为77．3%。作MR检查9例,全部判断正确,准确率为100%。结论某些特殊的临床表现和CT、MR检查对判断肿瘤是否发生邻近浸润或转移有较大价值,为术前评价手术切除的可能性提供依据。