恶性疟原虫非编码RNA的研究进展

疟疾依然是世界上严重危害人类健康的3大传染病之一。在5种导致人类疟疾的疟原虫中,恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)毒力最强、致死率最高。研究表明,红内期恶性疟原虫能够逃避宿主免疫系统,与其抗原编码基因的互斥性表达密不可分,这依赖于其发育过程具有精密的基因表达调控机制。目前对其基因表达调控机制研究尚不够深入。已有研究发现,恶性疟原虫中具有丰富的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),其中一部分ncRNA已被证实在恶性疟原虫生长发育和致病过程相关的基因表达调控中发挥着重要作用。本文就近年恶性疟原虫相关ncRNA的功能研究进展进行综述,以加深对疟原虫基因表达调控机制的理解,从而为疟原虫致病的分子机制研究提供理论基础。     

一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用

目的探讨应用一步反转录PCR(RT-PCR)技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性。方法取恶性疟(1例)、间日疟(1例)、卵形疟(1例)和三日疟(5例)患者全血,提取疟原虫总RNA和基因组DNA。应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶(DNase)消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列,应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA(未经DNase消化和经DNase消化)和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S r DNA序列,比较2种检测技术可检测到目标序列的样品最低稀释浓度。结果患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带,测序结果显示分别为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)的18S rRNA序列特异性条带,但未扩增出三日疟原虫(P.malariare)特异条带。一步实时荧光RT-PCR结果显示,4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号,除三日疟原虫样品外,各溶解曲线均仅有单一的扩增峰。因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异,一步RT-PCR可检测到的最低稀释浓度从1至10-4不等,但可检测到的DNA样品的最低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级,且两者最低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品。与普通PCR的检测结果比较发现,同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度最低,较普通PCR的敏感性提高10~1 000倍。结论一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA,但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析。     

RNA干扰抑制恶性疟原虫的生长

RNA干扰 ( RNAi)是一种干扰基因表达和进行功能性基因组筛选的方法。RNAi借助转录后的加工特异性抑制靶 m RNA生成 ,并导致特异性蛋白合成的减少。本实验中 ,RNAi的靶点是编码二氢乳清酸脱氢酶( DHODH)的基因片段 ,用编码 DHODH的ds RNA进行干扰。DHODH是嘧啶生物合成中的一种酶 ,对疟原虫生长非常重要 ,抑制DHODH的表达预计可干扰疟原虫的生长。本实验选用恶性疟原虫单链 RNA,编码恶性疟原虫环子孢子蛋白 ( Pf CSP)的和编码刚地弓形虫二氢叶酸还原酶胸苷酸合成酶( Tg DHFR)的 ds RNA作阴性对照 ,并且对编码恶性疟原…     

药物对疟原虫蛋白质合成的影响

药物对疟原虫蛋白质合成的影响是多方面的。已知某些药物通过影响疟原虫DNA复制或RNA转录或抑制核糖体的功能,使疟原虫蛋白质合成障碍。有些药物可妨碍疟原虫对必需氨基酸的利用,蛋白酶抑制剂可抑制疟原虫蛋白水解酶,影响血红蛋白的消化降解,使外源性氨基酸减少而影响疟原虫的蛋白质合成。     

原位杂交法检测一种新的恶性疟原虫有性期特异性RNA基因的表达

本文报道一种新的恶性疟原虫有性期特异性RNA基因的检测和初步鉴定。 恶性疟原虫NF54株的3D7A克隆体外培养获得无性血液期原虫和配子体,经CsCl超离心法制备其RNA,并按常规方法构建配     

利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究

目的利用单链引导RNA(sg RNA)串联表达框架编辑恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)K13和NUP116基因。方法根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物,PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂,并引入突变位点。PCR串联基因K13和NUP116的sg RNA,将同源臂和串联的sg RNA与载体p L6cs连接,构建用于电击转染实验的载体p L6-K13-NUP116,将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法,转入恶性疟原虫体内,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统对基因进行编辑修饰,通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂(WR)和杀稻瘟菌素(BSD)筛选转基因疟原虫,提取转基因疟原虫的基因组,对其进行PCR检测,最终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰。结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂(K13全长557 bp,NUP116全长569 bp)以及串联的sg RNA,与载体p L6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体p L6-K13-NUP116。电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫,培养至第28天涂片镜检发现疟原虫。PCR检测结果显示,转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功。测序表明,K13和NUP116基因的目标位点被成功突变。结论基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sg RNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑。     

基于线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因鉴定贵州省首例输入性卵形疟病例

提取贵州省首例镜检诊断为输入性卵形疟病例的血样DNA,以疟原虫的核糖体RNA小亚基(SSU r RNA)和线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因(cox3)为靶标,分别设计属、种特异性引物及种特异性引物, PCR扩增、测序,比较2种引物对疟原虫种类PCR鉴定的特异性。以卵形疟原虫wallikeri亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712053.1)和curtisi亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712052.1)为模板,应用DNAMAN V6软件对扩增序列进行Blast比对。利用Mega 7.0.26软件,采用邻接法,基于疟原虫线粒体cox3基因DNA序列构建系统进化树。PCR结果显示,基于疟原虫SSU r RNA属、种特异性引物扩增,仅获得1 200 bp的属特异性条带,未出现种特异性条带。基于疟原虫cox3种特异性引物扩增,可获得880 bp的目的条带。Blast比对结果显示,PCR扩增获得的cox3基因序列与卵形疟原虫wallikeri亚种和curtisi亚种的序列一致度为99.4%和97.4%。     

巢式PCR技术在输入性卵形疟诊断中的应用研究

目的应用巢式PCR扩增小亚单位核糖体核糖核酸(18S r RNA)基因确诊卵形疟原虫感染。方法采集2012-2013年山东省疟疾患者全血和滤纸血样,吉氏染色镜检观察血膜疟原虫形态并鉴定虫种。提取血样中DNA,根据疟原虫18S r RNA基因以属和种特异性引物进行巢式PCR扩增,筛查卵形疟阳性标本并进行测序验证。结果2012和2013年山东省共筛查到7例输入性卵形疟原虫感染病例。巢式PCR扩增7份血样均在800 bp处出现卵形疟原虫特异性单一条带,Blast比对表明产物序列与Gen Bank卵形疟参考序列一致。结论经巢式PCR方法确诊了2012和2013年山东省7例输入性卵形疟病例。     

约氏疟原虫孢子增殖特异18S核糖体DNA部分序列及其检测应用

目的　测定约氏疟原虫 By2 6 5株 S型 18S r DNA序列 ,并用于蚊体内疟原虫的分子检测。　方法　根据伯氏疟原虫 S型 18S r DNA序列 ,合成一对保守区引物 ,从感染约氏疟原虫 7d后的斯氏按蚊中肠组织逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)扩增约氏疟原虫 S型 18S r RNA片段并测序 ,据此序列合成约氏疟原虫 S型 18S r D-NA种型特异引物 ,与保守的逆转录引物配伍 ,对感染后 1～ 7d蚊体内约氏疟原虫 S型 18S r RNA表达量进行RT- PCR检测。　结果　扩增的约氏疟原虫 S型 18S r DNA片段长度为 92 0 bp,与伯氏疟原虫 S型和约氏疟原虫A型的同源性分别为 95 .3%和 94.0 %。 RT- PCR检测结果显示卵囊密度与扩增带强度明显一致 ,且敏感性高于解剖镜检方法。感染后 3d即可检出蚊体内疟原虫 ,而此时卵囊在光镜下尚难识别。　结论　测定了约氏疟原虫S型 18S r DNA的部分序列 ,将其作为分子指标 ,可早期、敏感、特异和半定量检测蚊体内感染的疟原虫。     

恶性疟原虫FCC1/HN株3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的序列测定

3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)是疟原虫糖酵解过程中重要的酶 ,其基因最近被发现 [1 ]。本文报告恶性疟原虫 FCC1/HN株 GAPDH基因序列测定结果。1　材料与方法1.1　虫株恶性疟原虫 FCC1/ HN株在本室长期保种 ,体外培养参照Trager等 [2 ]方法并略作改进 [3]。1.2　基因组 DNA的提取取 5 0 μl培养物 ,按文献 [4 ]方法用 5 %磷酸钠盐溶液提取 ,最后溶于 5 0 μl DEPC- H2 O中。1.3　提取总 RNA收获培养物中的环状体期疟原虫 (1× 10 9以上 ) ,用 RNA提取试剂盒 (采用 TRIZOL试剂盒 ,Gibco,BRL )抽提总RNA,紫外分光光度计测…     

激光捕获显微解剖富集肝内期恶性疟原虫供mRNA分析

肝内期恶性疟原虫是疫苗诱导保护性免疫反应和疟疾治疗的重要靶位。目前,对疟原虫肝内期发育的基因表达谱几乎一无所知。运用近年发展的DNA微阵列技术,进行基因表达分析,再结合恶性疟原虫基因数据库,可测定疟原虫期特异基因表达谱。经这种分析现已鉴定了有性和无性血液期的不同基因的表达。然而,类似的肝内期基因表达的测定,因肝细胞内感染低,仅能抽提到非常低的虫体RNA而受阻。为解决这一问题,在抽提RNA前受感染肝细胞必须密集。激光捕获显微解剖法(LCM )在病理学打开了一个新的前景,可从不同组织中精确、可靠地取单个细胞作遗传学或…     

疟原虫核酸探针的制备与应用

核酸探针是现代分子生物学技术中的重要工具,用核酸探针作分子杂交检测疟原虫DNA具有高度的特异性和敏感性,近年来广泛用于疟疾的研究,在DNA文库的筛选、疟疾的基因诊断和虫株的分类鉴定等方面都取得了令人瞩目的成绩。本文就疟原虫核酸探针的制备方法和应用进展作一简要综述。一、核酸探针的制备 1.探针的来源:疟原虫基因组DNA,克隆的DNA或cDNA,由特定DNA转录的RNA,以及合成     

实用寄生虫病杂志2001年第9卷文题中英文索引

疟疾套式 PCR扩增特定 SSU r RNA基因片断检测四川疟原虫感染的研究 ( 1 ) :4PCR检测 Pf6 0 .1基因诊断恶性疟实验方法研究 ( 1 ) :8疟史访问在疟疾监测中的作用初探 ( 1 ) :2 1扬中市 1 972 -1 999年疟疾疫情消长及防治效果评价( 1 ) :4 3云南省恶性疟原虫多药抗性基因Asn86 Tyr多态性调查 ( 2 ) :5 2薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶的研究 ( 2 ) :6 5应用 CSP基因型简捷 PCR鉴定法对间日疟原虫分型的初步评价 ( 2 ) :6 7间日疟原虫对氯喹敏感性的体内监测 ( 2 ) :741例输入性恶性疟误诊报告 ( 2 ) :78疟疾病例侦察中血检对象…     

恶性疟高分子量蛋白抗原相应基因编码碎片的克隆分离

从恶性疟制备的RNA可于体外合成许多高分子量蛋白质,其中有些能被恶性疟免疫的人血清所沉淀,含量丰富的分子量为145,000的蛋白质属于其中之一。作者将恶性疟原虫先行同步处理然后体外培养30～48小时,用通常方法提出疟原虫RNA,后者与鼠核糖体RNA呈现相似的电泳谱型。在兔网状细胞溶胞产物体系中可激发体外转译。对新合成的~(35)-硫同位素标记蛋白质用SDS聚丙烯酰酶进行了电泳分析,并使之与相应的免疫抗血清进行反应,再将抗     

约氏疟原虫235 ku多基因家族的基因克隆和序列分析

目的 克隆约氏疟原虫不同虫期235ku棒状体蛋白（Plasmodium yoelii yoelii 235 ku rhoptry proteins，Py235）的基因，并对其进行序列测定和分析。方法根据疟原虫棒状体235 ku蛋白的基因序列，设计引物。用Tri—pure与氯仿等试剂提取不同时相点的约氏疟原虫总RNA．逆转录合成cDNA．用PCR的方法扩增Py235基因片段。将获得的预期大小的PCR产物插入PMD18-T克隆载体，转化XLl—Blue感受态细胞，蓝白筛选白色克隆，进行体外扩增．提取质粒，进行酶切鉴定，对含有目的插入片段的克隆进行序列测定。结果 从不同侵入虫期的疟原虫总RNA中成功克隆出292bpPy235基因片段，测序结果与GeneBank报道序列具有很高的相似性。结论 在疟原虫235ku多基因家族，不同侵入虫期疟原虫Py235基因的mRNA转录与表达具有一定的遗传稳定性，但表型也有变异，从而获得侵入不同宿主细胞的功能。     

伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子的表达和纯化

目的 表达和纯化伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子（PbMIF）。方法 根据GenBank中PbMIF mRNA的预测序列，设计特异引物，采用RT-PER方法从伯氏疟原虫ANKA株红内期RNA扩增获得PbMIF基因。将PbMIF基因与T载体连接并测序，利用NCBI中Blast程序分析测序结果。阳性T／A克隆质粒经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切后，将目的片段克隆至原核表达载体pET28a，并转化大肠埃希菌BL21（DE3），收集经IPTG诱导表达的细菌进行SDS-PAGE分析，并对表达产物进行亲和纯化。结果 从伯氏疟原虫RNA中扩增到PbMIF cDNA，长度为351bp，编码116个氨基酸。测序结果显示，其核苷酸序列与GenBank中PbMIF cDNA的预测序列完全一致，编码的氨基酸在一级结构上与恶性疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子（PfbbMIF）的同源性为76％．与人类和小鼠MIF的同源性为31％。表达产物为可溶性的PbMIF蛋白，亲和纯化后的PbMIF蛋白纯度为71％。结论 表达并纯化出可溶性PbMIF蛋白，为进一步研究疟原虫的生物学特性奠定了物质基础。     

恶性疟原虫（海南株）cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的 :构建恶性疟原虫 c DNA表达文库。方法 :采用“一步法”提取红内期恶性疟原虫12 2 4 μg RNA,经 Oligo( d T)纤维素柱纯化得到 35.84 μg poly ( A) m RNA。取 10 μg m RNA反转录得到 1.75μg平端双链 c DNA,与含 Eco RI,Not I,Sal I酶切位点的衔接头连接后 ,经分级分离柱纯化回收到 2 0 0 ng大小主要在 50 0 bp- 7kb左右的 c DNA片段。取 50 ng c DNA与λgt11噬菌体臂连接后体外包装 ,完成建库。并采用 PCR方法初步鉴定该文库。结果 :已构建一个含 10 6个重组子的 c DNA表达文库。结论 :文库容量及插入 c DNA片段的大小适合于进一步研究。     

Chelex法从恶性疟原虫薄血涂片提取DNA的基因诊断

目的 建立从恶性疟原虫薄血涂片中提取DNA进行恶性疟原虫18S RNA基因套式PCR检测方法 ,并探讨其可行性.方法 利用螯合型的离子交换树脂Chelex-100作为介质,一步法分别提取患者染色和未染色薄血涂片恶性疟原虫DNA,行套式PCR扩增.以培养的不同浓度恶性疟原虫制备的染色和未染色薄血涂片提取恶性疟原虫DNA为模板进行PCR扩增,检测该方法的灵敏度.结果 用Chelex-100法提取恶性疟原虫患者染色与未染色薄血膜DNA,PCR扩增均出现205 bp特异扩增片段.染色及未染色薄血膜恶性疟原虫PCR扩增的最低虫体浓度分别为1.5×101/μL血和1.5×10-1/μL血.结论 Chelex-100法薄血涂片中提取微量DNA的套式PCR检测方法,可在基因水平检测存档的薄血涂片标本.为恶性疟疾的临床实验室诊断和分子流行病学研究提供了新方法.     

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法 选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1 000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物...     

3种方法提取血膜疟原虫DNA的比较研究

目的对3种提取血膜疟原虫DNA的方法进行比较研究,筛选出从血膜中提取疟原虫DNA的最佳方法。方法血膜依次经过二甲苯脱油和乙醇脱色处理,然后分别采用Na2HPO4法、Chelex-100法和试剂盒法提取DNA。根据疟原虫小亚基核糖体RNA编码基因(18SSSU rRNA)保守区设计套式PCR引物,分别以3种方法提取的疟原虫DNA为模板进行套式PCR扩增,并对扩增产物进行测序分析。结果疟原虫新血膜(保存1年内)3种方法提取的DNA经PCR扩增后均呈阳性且测序成功,与镜检结果一致。Chelex-100法提取的旧血膜(保存1~5年)标本和试剂盒法提取的旧血膜和陈旧血膜(保存6~10年)的DNA经PCR扩增后均呈阳性且测序成功,与镜检结果一致。结论 3种方法均可成功提取新血膜疟原虫DNA,Chelex-100法可提取旧血膜的疟原虫DNA,试剂盒提取法适用于旧血膜和陈旧血膜的疟原虫DNA的提取。