香加皮水提取物诱导人食管癌细胞TE-13凋亡的实验研究

[目的]运用多种技术手段研究香加皮水提取物诱导人食管癌细胞TE-13凋亡.[方法]利用MTT染色在普通光镜下观察细胞凋亡形态学变化并观测药物对肿瘤细胞的抑制率;通过流式细胞仪分析人食管癌TE-13细胞凋亡率、细胞周期变化;DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测肿瘤细胞凋亡的DNA水平变化;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测细胞内钙离子浓度变化.[结果]经香加皮水提取物处理的人食管癌细胞TE-13出现核固缩、凋亡小体、新月状浓染区等细胞凋亡形态学改变,各剂量药物处理组的肿瘤细胞均表现生长抑制,且具有剂量依赖性,250μg/ml香加皮水提取物处理组的抑制率达91.02%.DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯形电泳条带.药物处理组的肿瘤细胞更多地被阻止于G2/M期,各剂量组均出现明显的凋亡变化,最大凋亡率可达20.3%.各剂量药物处理组的肿瘤细胞内的Ca2 浓度明显高于对照组(P<0.01).[结论]香加皮水提取物可明显抑制人食管癌细胞TE-13的生长增殖,诱导细胞凋亡,并能改变该肿瘤细胞周期分布,阻止细胞周期于G2/M期.     

丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3增殖与凋亡的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制和诱导凋亡作用及其可能机制。方法:培养人卵巢癌细胞SKOV3,经TanⅡA作用后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞周期;RT-PCR检测Survivin与Smac/DIABLO mRNA表达水平;免疫荧光细胞化学检测Survivin蛋白及Smac/DIABLO蛋白的表达。结果:1.0～10.0μg/ml TanⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3具有生长抑制作用,并具有时间-剂量依赖性。实验组较对照组G1/G2期细胞数量增多,而S期细胞数量减少(P<0.05)。随着TanⅡA干预浓度的增加和作用时间的延长,Survivin mRNA的表达受到明显抑制(P<0.05),而Smac/DIABLO mRNA的表达明显上调(P<0.05)。Survivin蛋白及Smac/DIABLO蛋白均表达于SKOV3细胞,其表达多定位于细胞质中,偶见于细胞核。结论:TanⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3具有生长抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能是通过抑制人卵巢癌细胞SKOV3 Survivin和促进Smac/DIABLO的表达而实现的。     

SeO2逆转人卵巢癌耐药细胞株耐药性的研究

[目的]探讨SeO2对体外培养的人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP细胞耐药性的影响及其可能的作用机制.[方法]用MTT法、流式细胞术、电镜检测体外培养的COC1/DDP细胞在单独SeO2及与DDP联合作用下的增殖抑制及凋亡程度,用间接免疫荧光标记法在流武细胞仪上检测Survivin蛋白的表达水平.[结果]SeO2对COC1/DDP细胞的增殖抑制作用随SeO2浓度升高而明显增强,其最适浓度约10μmol/L,SeO2与DDP同时作用时增殖抑制作用明显增高;应用流武细胞术,10μmoL/L的SeO2与DDP同时作用于COC1/DDP细胞72 h,凋亡率达(30.66±2.34)%,电镜术也可检测到凋亡细胞存在;应用间接免疫荧光标记法在流式细胞仪上检测,SeO2与DDP同时作用72 h COC1/DDP细胞的Survivin蛋白表达水平明显降低.[结论]在体外,SeO2可增强COC1/DDP细胞对DDP的敏感性,诱导其凋亡.其诱导凋亡机制可能与下调Survivin蛋白的表达水平有关.     

杏多糖与阿魏菇醇提物对食管癌细胞凋亡及其调控影响的体外实验研究

目的观察杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞Eca9706的凋亡作用及其作用机制。方法采用体外细胞培养,以免疫细胞化学和分子生物学技术观察10^-1g/ml杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响。结果免疫细胞化学结果显示,食管癌细胞经两种受试物处理24h后,Bax的表达较处理前有所增加;Bcl-2表达未见下降,反而有增高的趋势。经HE染色,在光学显微镜下可见,经10^-1g/ml的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物干预后的食管癌细胞出现了凋亡细胞的形态学特征;TUNEL测试结果显示食管癌细胞核的DNA断裂片段较处理前增多;琼脂凝胶电泳显示一片模糊的弥散带。结论10^-1g/ml的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物可促进食管癌细胞抑癌基因Bax的表达,并促进细胞的凋亡。     

5-氟尿嘧啶对人类绒癌JAR细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对人类绒毛膜癌JAR细胞增殖及凋亡的影响。方法:MTT法检测5-FU对JAR细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测5-FU对JAR细胞DNA含量的改变;倒置显微镜及荧光显微镜下观察JAR细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变。结果:MTT抑制实验得出5-FU对JAR细胞的增殖具有一定程度的抑制作用,且抑制作用呈时间、剂量依赖性;5-FU0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml处理JAR细胞24h,通过倒置光学显微镜可观察到JAR细胞的形态变化,可见随着5-FU浓度的增加,JAR细胞逐渐缩小、变圆、分散,细胞核减少;用流式细胞仪检测5-FU对JAR细胞DNA含量的改变发现:12h均未诱导出凋亡,直到24h5-FU处理组才诱导出凋亡,48h由于JAR细胞耐酸性低,出现自溶现象,干扰实验结果,因此只选择24h为实验时间点。0μg/ml(对照组)、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml5-FU处理JAR细胞24h后,流式细胞术检测发现5-FU处理组可诱导绒癌细胞凋亡。5-FU在0μg/ml~40μg/ml范围内可以呈剂量依赖性促进JAR细胞凋亡,在40μg/ml~80μg/ml范围内,凋亡反而降低。40μg/ml、60μg/ml5-FU处理组凋亡率与对照组相比差异有统计学意义。在0μg/ml~80μg/ml范围内5-FU处理组细胞坏死增加,呈剂量依赖性。坏死率高于不加5-FU的对照组,差异具有统计学意义;Ho-echst33342/PI荧光染色结果显示,典型的细胞凋亡形态学改变,可见典型的凋亡小体,表现为核染色质聚集、核固缩、核碎裂。20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml各处理组的凋亡率均显著高于对照组(P<0.01),80μg/ml处理组的坏死率也显著高于对照组。结论:5-FU对JAR细胞的增殖具有一定程度的抑制作用,5-FU对绒毛膜癌JAR细胞有凋亡诱导作用。     

二十二碳六烯酸联合顺铂对人食管癌耐药细胞周期及凋亡的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)与顺铂(DDP)联用对食管癌细胞Eca109/DDP增殖、周期和凋亡的影响。方法采用递增药物质量浓度持续作用诱导法建立耐DDP的食管癌细胞Eca109/DDP。DHA联合DDP作用于Eca109/DDP细胞,MTT法检测Eca109/DDP细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果递增药物质量浓度持续作用诱导6个月后,细胞可以在含1μg/ml DDP的培养液中正常生长,其对DDP的耐药指数为15.886,所得细胞命名为耐DDP的食管癌细胞Eca109/DDP。单用DHA浓度≤1.560μg/ml时,对Eca109/DDP细胞无明显抑制作用(P0.05),但与DDP 1μg/ml合用能显著促进DDP抑制Eca109/DDP细胞的增殖(P0.05),并促进DDP诱导Eca109/DDP细胞周期改变、细胞凋亡增加。细胞周期表现为G1期细胞明显增多(P0.05),S期细胞、G2期细胞明显减少(P0.05);细胞的凋亡率明显增加(P0.05)。结论 DHA促进DDP抑制Eca109/DDP细胞增殖可能与改变Eca109/DDP细胞周期、增加细胞凋亡有关。     

5-氟尿嘧啶对绒癌JAR细胞凋亡的作用机制

目的:探讨5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对人类绒毛膜癌细胞株JAR细胞凋亡的作用机制。从分子水平分析绒癌细胞凋亡及凋亡抑制基因XIAP在此凋亡过程中的作用。方法:RT-PCR法检测5-FU对JAR细胞XIAP mRNA表达的影响。结果:5-FU在0～40μg/ml范围内可以呈剂量依赖性下调XIAP基因mRNA的表达,在40～80μg/ml范围内,随着5-FU剂量的增加,下调能力有所减弱,XIAP的表达反而有所增强。结论:5-FU诱导绒癌细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用机制之一,5-FU诱导细胞凋亡的机制可能与XIAP mRNA的表达有关。     

GRIM-19对子宫颈癌细胞株HeLa细胞Survivin基因表达的影响

目的:探讨稳定转染GRIM-19对子宫颈癌细胞株HeLa细胞凋亡抑制基因Survivin的表达以及细胞增殖的影响。方法:采用脂质体转染法将GRIM-19重组质粒转染子宫颈癌细胞株HeLa细胞,建立稳定表达GRIM-19的HeLa细胞株,采用RT-PCR检测HeLa细胞转染GRIM-19后mRNA水平表达情况,采用WesternBlot检测稳定转染后GRIM-19与Survivin的表达情况,应用细胞计数法观察各组细胞增殖水平。结果:建立稳定的GRIM-19基因表达的HeLa细胞株,命名为HeLa/G19细胞,对照组细胞命名为HeLa/Con细胞。RT-PCR检测显示GRIM-19mRNA表达明显增加,WesternBlot检测显示GRIM-19的蛋白表达显著升高、Survivin蛋白的表达水平显著降低。细胞计数法实验显示HeLa/GRIM-19细胞增殖较HeLa/Con细胞明显减慢(P<0.05)。结论:GRIM-19可以抑制子宫颈癌细胞Survivin的表达,阻滞细胞的生长,可能是子宫颈癌治疗的新靶点。     

新疆天然植物黑加仑对食管癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:观察新疆天然植物黑加仑水提物对食管癌细胞的影响及其作用机制。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度(10-1、10-2、10-3g/ml)黑加仑水提物作用不同时间(12、24、36h)对人食管癌细胞株Eca109的细胞存活量的影响,以大鼠正常肝细胞(BRL)为正常对照细胞株;用Bradford法测定肿瘤细胞蛋白质合成的变化;采用流式细胞技术(FCM)观察黑加仑作用后肿瘤细胞周期变化及凋亡情况;通过倒置显微镜观察细胞的形态变化。结果:黑加仑水提物10-1g/ml组对人食管癌细胞株Eca109作用24h后,癌细胞的生长和蛋白合成均有明显抑制作用(P<0.05),对正常肝细胞的存活量及蛋白合成均无影响;流式细胞仪检测二倍体峰前出现凋亡峰,细胞凋亡率为49.6%;并且癌细胞呈现典型的凋亡细胞形态。结论:黑加仑水提物可通过诱导细胞凋亡而抑制人食管癌细胞株Eca109细胞的生长。     

微囊藻毒素-LR对睾丸支持细胞活性及凋亡基因表达的影响

[目的]研究微囊藻毒素-LR对睾丸支持细胞活性的影响及其对细胞凋亡相关基因表达的影响. [方法]分离纯化大鼠睾丸支持细胞,用低剂量(0～500×10-3 μg/ml)和高剂量(1～20 μg/ml)微囊藻度素-LR染毒细胞,细胞培养24 h、48 h和72 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和中性红吸收(NR)实验检测微囊藻毒素-LR对支持细胞活性的影响;将纯化后的部分睾丸支持细胞接种于6孔板中,给予不同剂量的微囊藻毒素-LR (0,1,10μg/ml),于24h和48 h后提取细胞总RNA,RT-PCR方法检测细胞中凋亡相关基因P53、bax和bcl-2表达水平.[结果]低剂量(0～500×10-3 μg/ml)微囊藻毒素-LR作用于支持细胞24、48、72 h,细胞活性增强.高剂量微囊藻毒素-LR(10和20μg/ml)作用24、48 h,细胞活性显著降低.时闻效应实验结果显示随着暴露时间的延长细胞活性降低.细胞暴露于1 μg/ml微囊藻毒素-LR后与对照组细胞相比较P53和bcl-2 mRNA水平相对表达量增加,bax表达量降低.暴露予10 μg/ml微囊藻毒素-LR后P53和bax mRNA水平相对表达增加,bcl-2表达降低.[结论]低剂量的微囊藻毒素-LR对 细胞具有兴奋效应,随着剂量的增高及暴露时间的延长微囊藻毒素-LR能够明显抑制细胞活性.同时微囊藻毒素-LR可通过P53、bax和bcl-2基因的表达影响睾丸支持细胞的凋亡.     

染发剂对豚鼠肝细胞的影响

[目的]了解市售的染发剂的慢性毒性作用。[方法]采用动物实验观察不同剂量染发剂对豚鼠肝脏的影响。[结果]染发剂对豚鼠体重增加有影响;可引起肝脏肝细胞索紊乱,肝血窦不清,肝细胞水肿,弥漫性水样变性、坏死等病变,对照组与染发剂浓度为50﹪、100﹪组肝脏病理改变差异有统计学意义（H=22.46,P﹤0.001）。[结论]≥50﹪浓度的染发剂可导致豚鼠肝脏发生病理改变,并能影响动物的生长发育。     

环境雌激素双酚A对小鼠脾细胞周期的影响

[目的]观察环境雌激素双酚A对小鼠脾细胞周期的的影响。[方法]每天分别以0.9mg/kg、9mg/kg、18mg/kg剂量给予小鼠腹腔注射双酚A,分别在连续染毒14d后处死小鼠,取脾,测定脾细胞周期。[结果]小鼠脾细胞G1期、G2期明显增加,而S期明显减少。[结论]双酚A可以诱导小鼠脾细胞G1、G2期阻滞,抑制脾脏细胞的分裂增殖。     

胡桃楸树皮对红细胞氧化损伤抑制作用及其活性成分探讨

[目的]观察胡桃楸树皮对红细胞自氧化损伤和H2O2所致的红细胞氧化损伤的抑制作用,同时对活性成分进行定性分析。[方法]用健康成人静脉血制成1%红细胞悬液,加入不同浓度的胡桃楸树皮提取物,以孵育24 h和H2O2为损伤因素,采用比色法测定红细胞的溶血程度来探讨胡桃楸树皮抑制红细胞氧化损伤的作用。采用化学预示法和薄层层析法对胡桃楸树皮活性成分进行分析。[结果]与对照损伤组比较,胡桃楸两种组分的各剂量组都可抑制红细胞的氧化溶血和H2O2所致的氧化溶血,并都呈一定的剂效关系。相同浓度不同组分对红细胞的抑制作用相比,组分1优于组分2;胡桃楸树皮活性成分主要是黄酮、皂苷、蒽醌、酚类及鞣质。[结论]胡桃楸树皮提取物能明显抑制红细胞的氧化损伤;胡桃楸树皮含有黄酮、皂苷、蒽醌、酚类及鞣质等抗氧化活性物质。     

CFSE活性染剂检测放化疗联合治疗对胶质瘤复发影响的研究

[目的]探索利用顺铂联合放疗对胶质瘤治疗复发率的影响。[方法]将C6细胞分为空白对照组、单纯放疗组、单纯化疗组和放疗加化疗组,激光共聚焦观察细胞形态,用流式细胞仪测定CFSE的荧光信号。[结果]放疗加化疗组细胞的增殖能力较单纯放疗及单纯化疗组明显下降。[结论]放疗加化疗联合不仅减少了化疗药物和射线的用量,也大大降低了治疗后的肿瘤细胞增殖能力,为指导临床胶质瘤的后续治疗提供依据。     

肠道菌群总DNA提取方法的研究

[目的]通过实验得出提取DNA的最佳方法,并对样品处理等实验条件进行优化,为PCR检测中模板DNA的制备提供实验依据。[方法]一.样品处理;二.DNA提取:1.醋酸钠-乙醇沉淀法;2.水煮法;3.水煮法-试剂盒法;4.试剂盒法;5.CTAB法;三.DNA的检测。[结果]实验效果最佳的DNA提取方法是试剂盒法,所得到的结果(包括DNA纯度和浓度)是几种提取方法中最好的;水煮法-试剂盒法结果较试剂盒法相近,但操作较烦琐;醋酸钠-乙醇沉淀法、CTAB法和水煮法得到的DNA中含有较多的蛋白质、RNA等杂质。[结论]试剂盒法是提取DNA最佳方法。     

梗阻性肾病成纤维细胞体外增殖规律的初步实验研究

[目的]初步探讨梗阻性肾病人肾间质成纤维细胞体外培养的增殖规律。[方法]取慢性梗阻性肾病(UUO)患者手术切除标本取材,体外培养1～7代细胞,在不同时间点,用相差倒置显微镜观察细胞形态变化;通过免疫细胞化学方法对体外培养细胞进行鉴定;用MTT比色法检测体外培养第3代成纤维细胞的吸光光度值。[结果]原代培养5～7 d后,组织块周围开始长出数目不等的立方形或长梭形细胞;大约2～3周后,以占绝对优势的长梭形细胞可铺满瓶底。第2～5代细胞形态较为均一,多呈长梭形,胞浆丰富,核1～2个不等,偶见核仁,细胞呈栅栏状排列,周围有长短不一的轴状突起,并有无定性成分分布于4周。第6、7代细胞形态变化较大,细胞多数呈圆形或椭圆形,长梭形细胞数量减少,部分细胞形态不规则,胞内出现空泡和(或)颗粒状物质等细胞衰老、变性的形态改变。免疫细胞化学检测第2代细胞表达波形蛋白(vimentin)强阳性,角蛋白(keratin)散在灶性个别细胞弱阳性;第3～6代细胞均表达波形蛋白强阳性,结蛋白(desmin)和角蛋白阴性。传3代细胞MTT结果显示第3～5 d增殖速度最快,d 7细胞数量达到高峰,d 9后细胞生长相对稳定。[结论](1)用组织块培养法在体外顺利培养出梗阻性肾病来源的hRIFs。(2)传3～5代hRIFs纯度高、活性佳,于接种培养后3～5 d进入对数增长期,体外实验研究选择该时期的hRIFs较好。     

金雀异黄素对U251MG的抑制作用及对癌基因表达的影响

[目的]探讨金雀异黄素(Genistein)对胶质瘤细胞株U251MG增殖的影响及可能的作用机制。[方法]用MTT比色法观察不同浓度Genistein在不同作用时间下对U251MG细胞增殖的影响,并通过流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测p53(突变型)、c-erbB1、c-myc、cyclinD1蛋白表达。[结果]当Genistein在达到一定浓度或(和)一定时间后,对U251MG细胞增殖均有不同程度的抑制作用,且呈时间剂量依赖性。U251MG细胞经Genistein作用48h后,p53(突变型)、c-myc基因蛋白表达均较对照组明显下降(F=25.766,P﹤0.01;F=22.974,P﹤0.01),且呈剂量依赖性,而c-erbB1、cyclinD1基因蛋白表达无明显变化(F=0.984,P﹥0.05;F=2.416,P﹥0.05)。[结论]Genistein对U251MG细胞的增殖有明显的抑制作用,其抗肿瘤的机制可能与p53(突变型)和c-myc蛋白表达降低有关。     

TSA诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及对FHIT表达的影响

[目的]研究去乙酰化转移酶抑制剂TSA对人肝癌HepG2细胞的作用及其FHIT表达的影响。[方法]培养的人肝癌HepG2细胞随机分为两组:对照组给予等量DMSO,实验组给予终浓度分别为125、250、500、1 000、2 000nmol/L的TSA,培养24 h后收集细胞,MTT比色法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测FHIT的mRNA和蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,经TSA处理的细胞增殖速度明显减慢,TUNEL阳性细胞百分率随TSA浓度的升高呈剂量依赖性增高(P﹤0.01),细胞FHIT mRNA表达增强(P﹤0.01),FHIT蛋白表达差异具有统计学意义(P﹤0.01)。[结论]TSA可能通过抑制HDACs的活性,上调FHIT表达,诱导细胞凋亡而抑制肝癌细胞生长。     

新型农村合作医疗实证研究——以江苏省海安县为例

[目的]调查参合农民对新型农村合作医疗的参与情况、知晓情况、评价和满意度,为改进和完善新农合相关政策提供决策依据。[方法]选取海安县海安镇、胡集镇、西场镇320户居民作为调查对象,通过事先设计好的调查问卷由调查员面对面进行访谈。[结果]问卷回收率为96.5%,新农合的参合率为99.7%,参合农民对相关政策的知晓率低,知晓途径主要来源于村干部;报销比例偏低,保障能力有限;农村基层医疗机构的技术和环境有待改善。[结论]建议加大对新农合的宣传力度;积极推进支付方式改革,控制医药费用不合理增长;完善基层医疗服务设施,加强人员素质建设;尝试商业保险参与新农合的推动工作。     

NAPP体外抗乙型肝炎病毒作用的实验研究

[目的]应用HepG2.2.15细胞株作为体外抗乙型肝炎病毒的实验模型,研究NAPP对乙肝病毒的抑制作用。[方法]以NAPP梯度浓度与HepG2.2.15细胞混合培养,通过MTT法检测药物的细胞毒性,9 d后取细胞培养上清液,用ELISA法测定HBsAg、HBeAg含量,荧光定量PCR检测上清液中病毒载量。[结果]NAPP浓度在1 mg/ml时,对细胞无明显毒性;NAPP在所稀释的各浓度下,对HBsAg、HBeAg均有抑制作用,对HBsAg、HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5;NAPP可抑制HBV-DNA的复制。[结论]NAPP体外对HBV有显著的抑制作用。