精子携带的乙肝病毒基因在金黄地鼠胚胎中的复制与表达

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。本研究旨在探索乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV)通过精子垂直传播的可能性。方法:将金黄地鼠精子与pBR322-HBVDNA重组质粒进行共培养后,与金黄地鼠正常卵母细胞受精,取2-细胞胚分别制片和提取RNA,用荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)、RT-PCR和免疫荧光检测技术研究精子携带的HBV基因在胚胎细胞中的复制与表达。结果:①FISH:用全长HBVDNA探针与128个2-细胞胚进行FISH,其中3个胚胎FISH结果阳性,每个胚胎的2个间期核上均有HBVDNA杂交信号;②RT-PCR:在检测样本中可见特异的HBxDNA阳性条带,阴性对照1(模板为灭菌水)和阴性对照2(未加反转录酶)均为阴性;③免疫荧光检测:2-细胞胚经血清封闭后,分成两组。一组作检测样本,另一组用PBS代替一抗(小鼠抗人HBsAg)作为阴性对照,检测样本中可见阳性免疫荧光信号,阴性对照未见信号。结论:以精子为载体,携带到卵内的HBV基因能够在胚胎细胞中复制和表达,提示HBV能够通过男性生殖细胞由父亲垂直传递给子代。     

pIRES2-EGFP-DAZ3质粒构建及金黄地鼠2-细胞胚中人DAZ基因的复制与表达

背景与目的：人Yq11.2上AZF区 (内含DAZ基因家族) 的缺失是多数男性不育的病因。本研究旨在探讨DAZ3基因导入精子的可能性以及导入基因在2-细胞胚中的功能。材料与方法：构建pIRES2-EGFP-DAZ3质粒,经鉴定无误后将其导入金黄地鼠精子。将携带DAZ3基因的精子与金黄地鼠卵母细胞进行体外受精。用FISH、PCR、RT-PCR技术分别检测DAZ3基因在精子头部、雄原核上的整合以及在2-细胞胚中的复制与表达。结果：构建的pIRES2-EGFP-DAZ3质粒经酶切、PCR和绿色荧光蛋白表达鉴定构建成功。采用FISH在精子头部、单细胞胚雄原核和2-细胞胚两个间期核上观察到阳性杂交信号。采用RT-PCR在2-细胞胚样本中观察到DAZ3 cDNA的特异条带。结论：外源性DAZ3基因能被导入精子基因组。携带DAZ3基因的精子可与卵母细胞完成正常的受精过程。导入的DAZ3基因在早期胚胎细胞中能够随细胞分裂自我复制并表达其功能。本研究结果为DAZ基因缺失所致男性不育的治疗提供了新的线索。     

HBV基因经生殖细胞垂直传播与DNA甲基化研究进展

乙肝病毒(HBV)基因可能通过生殖细胞垂直传播并在早期胚胎中复制与表达.DNA甲基化模式的改变是胚胎发育的关键,HBV感染可导致宿主细胞表观基因组修饰异常,诱发染色体不稳定,影响胚胎的正常发育并增加肿瘤发生的风险.本文中对近年HBV基因的垂直传播及其与DNA甲基化的关系的研究进行综述.     

人精子携带的HBs和HBc基因在早期胚胎细胞中的蛋白表达

背景与目的:探讨由人精子带入受精卵中的HBs和HBc基因能否在早期胚胎细胞中进行蛋白表达.材料与方法:人精子经重组质粒pIRES2-EGFP-HBV转染后,与金黄地鼠去透明带卵母细胞离体受精,选择带绿色荧光的2-细胞胚,用免疫荧光技术检测HBs和HBc基因在胚胎细胞中的蛋白表达,用ELISA方法分别对HBsAg和HBcAg进行半定量和定性分析.结果:在带绿色荧光的2-细胞胚中免疫荧光检测可见清楚的HBsAg和HBcAg阳性信号;ELISA结果表明,单个2-细胞胚内HBsAg的量小于0.064 ng/ml,对HBcAg的检测得到阳性结果.结论:人精子携带到卵内的HBV基因可在早期胚胎细胞中表达表面抗原和核心抗原.     

HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病.为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究.材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体.用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞.结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带.Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号.用每次实验的最后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性.荧光原位杂交在1 000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号.结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上.此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎.     

HIV-1 gag基因经卵母细胞垂直传递模型的建立

目的：建立HIV-1gag基因经卵母细胞垂直传递的模型,为HIV通过雌性生殖细胞垂直传递的研究奠定实验基础。方法：将含有HIV-1gag基因的重组质粒pIRES2-EGFP-gag注射到小鼠双侧卵巢,转染生殖细胞。应用超排获得实验用卵母细胞,收集显示绿色荧光的卵母细胞,将一部分呈现绿色荧光的卵母细胞裂解,提取基因组DNA,采用PCR检测gagDNA是否存在卵母细胞中;再将另一部分带有绿色荧光的卵母细胞常规制备中期染色体片,用荧光原位杂交（FISH）技术检测HIV-1gag基因在成熟卵母细胞染色体上的整合。结果：转染pIRES2-EGFP-gag后,在荧光显微镜下能够很清楚地看到带有绿色荧光的卵母细胞;PCR结果显示在带有绿色荧光的卵母细胞中可检测到HIV-1gag基因特异的阳性条带;FISH检测结果显示在卵母细胞的中期染色体上检测到HIV-1gagDNA的阳性信号。结论：HIV-1gag基因能够通过卵透明带和细胞膜并整合到卵母细胞基因组内,本研究为HIV-1gag基因可经过雌性生殖细胞垂直传递给子代奠定了实验基础。     

同源重组修复基因RAD51可提高PTEN缺失细胞基因组稳定性

目的：研究同源重组修复基因RAD51对PTEN缺失小鼠胚胎成纤维细胞基因组稳定性的影响。方法：应用免疫荧光和中性单细胞电泳技术观察PTEN缺失后自发性和辐射诱导DNA双链断裂情况;并构建PTEN缺失细胞稳定转染RAD51的细胞系,γ射线照射后检测细胞存活率。结果：PTEN缺失导致细胞自发性和辐射诱导DNA双链断裂增多;转染RAD51后细胞存活率增高,辐射诱导的DNA双链断裂减少。结论：同源重组修复基因RAD51可以提高PTEN缺失细胞基因组稳定性。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

人胚胎干细胞来源的肝细胞：一种具有潜力的乙肝病毒研究模型

目的： 初步探索应用人胚胎干细胞来源的肝细胞作为乙肝病毒(HBV)体外研究模型的潜力。方法：定向分化人胚胎干细胞为肝细胞(hESC-Heps);采用免疫荧光方法检测肝性因子如肝细胞核因子-4α(HNF4α)、白蛋白(ALB)和HBV功能性受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)受体的表达;实时荧光定量PCR检测Ⅲ型干扰素受体表达,Western blotting 检测hESC-Heps在Ⅲ型干扰素刺激下干扰素通路中磷酸化转录信号传导子与激活子2 (STAT2)的表达。结果：成熟的hESC-Heps表达肝性因子HNF4α和ALB,表达HBV功能性受体NTCP受体,并且具有人原代肝细胞特异性的Ⅲ型干扰素反应。结论：人胚胎干细胞来源的肝细胞hESC-Heps可能成为一种具有潜力的HBV研究模型。     

miR-638用于治疗乙肝相关肝癌可能性的实验研究

目的:探讨miR-638用于治疗乙肝相关肝癌的可能性。方法:qRT-PCR方法检测miR-638在乙肝、肝癌患者及正常人群血清中的表达差异,并分析血清miR-638的表达水平与其它血清指标的相关性。上调乙肝病毒(HBV)稳定复制的HepG2.2.15肝癌细胞株中miR-638的表达水平, MTT法和细胞克隆实验检测miR-638过表达对HepG2.2.15细胞增殖的影响;ELISA和qRT-PCR方法检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表达水平。结果:miR-638在乙肝及肝癌患者血清中的表达水平均显著低于正常人群（P＜0.000 1）;在乙肝及肝癌患者血清中miR-638的表达水平,总体间与HBV DNA、谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）水平呈显著负相关（P值分别为0.026、<0.001和0.003）。MTT分析及集落形成实验显示miR-638能够显著抑制HepG2.2.15细胞的增殖及集落形成能力。miR-638表达上调后,HBsAg（P＜0.05）、HBeAg（P＜0.05）和HBV DNA水平（P＜0.001）较miR-ctrl组均显著下降。结论:miR-638在HBV复制过程中发挥作用,miR-638过表达可同时抑制HepG2.2.15细胞的增殖能力和HBV的复制。     

Preventive Effects of a Major Component of Green Tea,Epigallocathechin-3-Gallate,on Hepatitis-B Virus DNA Replication

Background: Hepatitis B virus infection is one of the major world health problems. Epigallocatechin-3 gallateis the major component of the polyphenolic fraction of green tea and it has an anti-viral, anti-mutagenic, antitumorigenic,anti-angiogenic, anti-proliferative, and/or pro-apoptotic effects on mammalian cells. In this study,our aim was to investigate the inhibition of HBV replication by epigallocatechin-3 gallate in the Hep3B2.1-7hepatocellular carcinoma cell line. Materials and Methods: HBV-replicating Hep3B2.1-7 cells were used toinvestigate the preventive effects of epigallocatechin-3 gallate on HBV DNA replication. The expression levels ofHBsAg and HBeAg were determined using ELISA. Quantitative real-time-PCR was applied for the determinationof the expression level of HBV DNA. Results: Cytotoxicity of epigallocathechin-3-gallate was not observed inthe hepatic carcinoma cell line when the dose was lower than 100 μM. The ELISA method demonstrated thatepigallocatechin-3 gallate have strong effects on HBsAg and HBeAg levels. Also it was detected by real-timePCR that epigallocatechin-3 gallate could prevent HBV DNA replication. Conclusions: The obtained datapointed out that although the exact mechanism of HBV DNA replication and related diseases remains unclear,epigallocatechin-3 gallate has a potential as an effective anti-HBV agent with low toxicity.     

Radiation-induced hepatitis B virus reactivation in liver mediated by the bystander effect from irradiated endothelial cells.

PURPOSE: Hepatitis B virus (HBV) reactivation is one unique pathogenesis in Asian carriers with liver toxicity after radiotherapy for hepatobiliary malignancies. This study attempts to delineate the biological mechanism of radiation-induced HBV reactivation. EXPERIMENTAL DESIGN: Primary cultures of hepatocytes (PCC) were prepared from the noncancerous liver tissue removed perioperatively from 12 HBV carriers with hepatocellular carcinoma (HCC). The conditioned medium of irradiated PCCs, HCC, and endothelial cells from patients was transferred to PCCs or HepG2.2.15 cells (a human hepatoblastoma cell line transfected with HBV DNA) before subsequent irradiation. Forty-eight hours after irradiation, HBV DNA was measured by real-time quantitative PCR. Specific cytokines were determined by cytokine array and ELISA analysis. Preradiotherapy and postradiotherapy sera from 10 HBV carriers and 16 non-HBV carriers were analyzed for viral loads and cytokine activities. RESULTS: Radiation induced HBV DNA replication in (a) irradiated PCCs cultured with the conditioned medium from irradiated PCCs (2.74-fold; P=0.004) and endothelial cells (9.50-fold; P=3.1x10(-10)), but not from HCCs (1.07-fold), and in (b) irradiated HepG2.2.15 cells (17.7-fold) cocultured with human umbilical vascular endothelial cells. Cytokine assay revealed increased expression of interleukin-6 (IL-6) in conditioned medium from irradiated human umbilical vascular endothelial cells. All 16 patients with liver irradiated had the increased serum IL-6 compared with 3 of 10 patients with irradiation excluding liver (P<0.001). All nine HBV carriers with liver irradiated had postradiotherapy increases in both HBV DNA and IL-6. CONCLUSIONS: Radiation-induced liver toxicity with HBV reactivation is from a bystander effect on irradiated endothelial cells releasing cytokines, including IL-6.     

乙肝病毒（Adr）全基因组在转基因小鼠体内（HBV）DNA的存在状态

本文用ＰＣＲ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ方法检测了３４只Ｇｏ代２６只转基因小鼠携带ＨＢＶＤＮＡ（阳性率为７６％），５１５只Ｇ１代转基因小鼠中２４８只组织中携带ＨＢＶＤＮＡ（阳性率为４８％），２５只Ｇ２代转基因小鼠中１８只组织中携带ＨＢＶＤＮＡ（阳性率为７２％）．对１０８只尼组织阳性小鼠血清检测，１０２只小鼠血清呈ＨＨＶＤＮＡ阳性。以上结果证明，ＨＢＶＤＮＡ基因已整合小鼠的染色体中。这些转基因小鼠对研究ＨＢＶ病毒的复制与表达，慢性肝炎以及肝癌发生的机理，治疗乙肝药物的筛选等具有十分重要的价值。     

慢病毒介导ＲＮＡ干扰抑制脑胶质瘤细胞ＨＭＧＡ１表达对洛铂化疗敏感性的影响

目的：建立逆转录病毒介导入高迁移率族蛋白组Ａ１（ＨＭＧＡ１）基因ＲＮＡ干扰体外表达体系,并观察洛铂对脑胶质瘤细胞株ＳＨＧ-４４化疗敏感性的影响。方法：制备ＨＭＧＡ１ｓｉＲＮＡ慢病毒载体,ＰＣＲ筛选阳性克隆,测序鉴定;转染脑胶质瘤细胞株ＳＨＧ-４４后,ＲＴ-ＰＣＲ检测其对细胞ＨＭＧＡ１基因表达的影响;ＭＴＴ和克隆集落实验检测洛铂对阳性组和阴性组细胞生长、增殖的影响。结果：ＰＣＲ和测序证实,成功构建ＨＭＧＡ１ｓｉＲＮＡ的慢病毒载体;ＲＴ-ＰＣＲ证实阳性组细胞存在ＨＭＧＡ１基因表达下调;分别用不同浓度的洛铂处理两组细胞２４ｈ后,ＭＴＴ法和克隆集落实验显示阳性组细胞生长抑制率较阴性组细胞明显降低。结论：ＨＭＧＡ１ｓｉＲＮＡ能特异性下调脑胶质瘤细胞ＳＨＧ-４４中ＨＭＧＡ１的表达并抑制了其对洛铂的敏感性。