利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽。方法:将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内,制备膀胱癌荷瘤小鼠模型,尾静脉注射噬菌体展示环七肽库,然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体,经过3轮体内筛选后,免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序,并推导出外源多肽氨基酸序列,化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共聚焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果:3轮体内筛选后,噬菌体富集率达到4.334×102倍。免疫组化结果显示,肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势,且结合逐渐增强,同时由于噬菌体经肝、肾代谢,可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体。ELISA结果显示,随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中,有24个阳性噬菌体,其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力,对其测序并推导出3种多肽序列,重复率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名为NYZL1。化学合成FITC-C6-NYZL1,通过激光扫描共聚焦显微镜术、流式细胞术均证明多肽NYZL1可以特异性结合膀胱癌细胞。结论:利用体内噬菌体展示技术筛选出了与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽NYZL1,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。     

应用噬菌体肽文库筛选McAb F3特异性结合肽

目的：应用噬菌体展示肽文库筛选可与抗汉坦病毒囊膜蛋白单抗F3特异性结合的配体肽。方法：采用protein-A亲和层析纯化的F3单抗为筛选配基，对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘洗，夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果：通过3轮生物淘洗，能被抗体捕获的噬菌体克隆为91．7％（11／12）；ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽能与F3单抗特异性结合；序列分析表明7个阳性克隆氨基酸序列相同，均为－MHGPTKNQMWHT，同源性分析显示该序列与HTNV／SEOV M蛋白G2区第750－759位氨基酸有较高的同源性，结论：获得了具有良好结合活性的模拟表位肽，为基于表位水平的HFRSV（肾病综合征出血热病毒）特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要依据。     

以特异性噬菌体展示肽为靶筛选TNF-α结合肽的研究

目的：建立以特异性噬菌体展示肽为靶从噬菌体肽库中筛选结合表位的新方法。方法：以前期工作中筛选得到的模拟TNF－α表位的环七肽克隆LCS－7（c-RRPAQSG-c)为靶，筛选噬菌体线性十二肽库；用间接ELISA及竞争试验鉴定阳性克隆。结果：对噬菌体十二肽库进行3轮筛选后，挑取20个克隆中有10个为阳性克隆，测序结果氨基酸序列相同：EHMALTYPFRPP。结论：以TNF－α模拟肽克隆为靶筛选得到的噬菌体十二肽克隆，能够与TNF－α结合，为TNF－α结合肽；所测得序列完全一致。上述结果提示了该筛选方法的可行性。     

噬菌体展示法筛选抗入PTA1单克隆抗体结合肽

目的 从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体（mAbs)特异性结合的短肽。方法 采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs,通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb,经过三轮亲和筛选,从噬菌体随机12肽库中筛选可特异必结合mAb的重组噬菌体阳性克隆,进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析,结果 确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1,得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆,序列测定结果发现,这些可结合LeoA1的短肽,有较保守而集中的模式序列,即WPXHHX序列,结论 这些具有保守模式序列的短肽,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体拮抗剂的候选肽段,此外,PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定,也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。     

从噬菌体随机肽库筛选CD137结合肽

目的应用噬菌体随机七肽库筛选与人CD137特异结合的肽序列。方法以重组人CD137作为筛选分子，对噬菌体展示随机七肽库进行亲和淘选。经过5轮淘选后，共随机挑选23个噬菌斑并对其进行了扩增和测序，据此推导随机多肽的氨基酸序列。经夹心ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与CD137的结合力。^3H-TdR法检测了噬菌体展示多肽对抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应影响。结果5轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。通过对阳性克隆的测序和序列比较分析，得到RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF的相似序列和与CD137L具有同源SRS序列的SRSRVRY、HRRPSRS肽序列，ELISA结果显示这5个克隆都有良好的与CD137的结合力。RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY4个噬菌体展示肽均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应。结论通过对噬菌体随机肽库的淘选，得到与CD137结合的相关多肽，为进一步研究CD137与配体结合的特异性位点及其拮抗性多肽药物设计提供了实验依据和结构基础。     

应用噬菌体肽文库筛选mAb F3特异性结合肽

目的 应用噬菌体展示肽文库筛选可与汉坦病毒囊膜蛋白中和性单抗（mAb） F3特异性结合的配体肽。方法 以F3mAb为筛选配基，对噬菌体展示和随机12肽文加进行3轮生物亲和淘选；用夹心ELISA和竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果 通过3轮生物淘选，能被抗体捕获的噬菌体克隆为21／22，ELISA测定显示，筛选到的噬菌体短肽能与F3mAb特异性结合。序列分析表明，7个阳性克隆氨基酸序列相同，均为－MHGPTKNQMWHT；同源性分析显示，该序列与HTNV／SEOV M蛋白G2区第750－759位氨基酸有较高的同源性。结论 本研究为基于表位水平的HFRSV特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要的依据。     

噬菌体展示法筛选抗人 PTA1单克隆抗体结合肽

目的从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体(mAbs)特异性结合的短肽。方法采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs,通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb,经过三轮亲和筛选,从噬菌体随机12肽库中筛选可特异性结合mAb的重组噬菌体阳性克隆,进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析。结果确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1,得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆,序列测定结果发现,这些可结合LeoA1的短肽,有较保守而集中的模式序列,即WPXHHX序列。结论这些具有保守模式序列的短肽,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体拮抗剂的候选肽段。此外,PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定,也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。     

内毒素休克小鼠肝脏血管内皮细胞特异性结合肽的体内筛选及初步鉴定

目的：利用体内噬菌体展示技术筛选能与内毒素休克小鼠肝脏血管特异性结合的短肽。方法:尾静脉注射噬菌体环七肽库至内毒素休克小鼠体内，循环10 min后，回收肝脏中的噬菌体。将回收的噬菌体扩增、纯化，并以此为起始物进行下一轮筛选。经过4轮筛选后，将所得文库与正常小鼠做一次差减筛选。随机挑取噬菌体单克隆进行测序，序列分析后，进行噬菌体的体内回输实验及免疫组化分析，验证所筛得噬菌体克隆的导向情况。结果:经过4轮体内筛选，肝脏中噬菌体回收率逐步提高，证明噬菌体文库在肝脏血管中得到有效富集。DNA测序后发现，10条序列中有5条为LTTWAPA，体内回输实验和免疫组化实验均证实表达该序列的噬菌体能有效地靶向于休克小鼠肝脏血管内皮细胞。结论:筛选到的短肽LTTWAPA能特异性结合于内毒素休克小鼠肝脏血管内皮细胞，有可能对内毒素休克的治疗具有重要意义。     

用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫免疫原的模拟短肽

目的　从噬菌体随机 12肽库免疫筛选出大鼠对血吸虫天然抗性的模拟靶表位 ,探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。方法　用粗提大鼠血清IgG作固相配体筛选噬菌体 12肽库 ,按吸附 洗脱 扩增的淘洗过程进行 3轮筛选 ;随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ,并对其中的 2个克隆进行测序 ;用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,分别在 0、1、3周进行 ,第 5周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴 ,4 5d后剖杀冲虫 ,计虫数及肝卵数。结果　经 3轮筛选 ,特异性结合噬菌体富集增加了 2 0 0多倍 ,随机挑取 2 0个噬菌体克隆经ELISA鉴定 ,有 19个克隆能与大鼠血清呈特异性反应。自动测序仪测序的 2个克隆的序列与GenBank的已知序列无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 33.6 % ,减卵率为 5 9.8%。结论　利用噬菌体展示技术可获得天然抗血吸虫抗性的短肽 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫     

P-糖蛋白结合肽的筛选及合成肽鉴定

目的 筛选人膀胱癌P-糖蛋白特异性结合肽并合成鉴定.方法 利用表达获得的P-糖蛋白胞外段融合蛋白为靶蛋白,采用酶联板法筛选噬菌体随机12肽库,化学合成该特异性肽序列,免疫细胞化学方法进行鉴定.结果 从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P-糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆,测序获得特异性结合肽序列.免疫细胞化学结果显示特异性合成肽可与耐药细胞BIU-87/ADM结合,而与敏感细胞BIU-87不结合.结论 筛选获得的结合肽具有一定的亲和力,可与特定的肿瘤细胞结合,表现出一定的肿瘤特异性;P-糖蛋白结合肽的筛选,为人膀胱癌多药耐药的靶向治疗结论提供实验依据.     

噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表位的研究

目的：得到拟类脂Ａ的六肽。方法：用抗类脂Ａ的单克隆抗体筛选噬菌体随机六肽库,经四轮筛选后进行ＥＬＩＳＡ检测,用得到的１５个阳性克隆分别免疫小鼠,并将使小鼠产生抗ＬＰＳ抗体的１０个克隆进行测序,将保守序列进行肽合成。结果：得到保守序列为Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ,即ＫＦＳＳＲＸ。固相合成此小肽可与其１Ｂ６抗体结合,且此结合可被ＬＰＳ抑制。结论：此六肽可模拟脂多糖或类脂Ａ表位。     

用噬菌体展示随机12肽库筛选HCV B细胞抗原表位

目的用患者血清中抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体从噬菌体展示随机12肽库筛选HCV抗原表位。方法用硫酸铵粗提HCV患者血清中Ig后用DEAE—Sephadex A50层析纯化并作为筛选的配基;对噬菌体展示随机12肽库采用配基亲和富集、阴性血清吸收的方法进行生物淘洗;ELISA鉴定筛选克隆的结合特性;测定阳性克隆所携带DNA序列并进行计算机辅助分析。结果三轮生物淘洗后特异性克隆得到了富集。用第3轮淘洗出的26个克隆进行结合实验,其中有3个克隆与HCV患者血清结合力较高而与正常人血清结合能力较弱;序列分析发现2个序列与HCV蛋白第1082～1093和1954～1965位(1082YHGAGTRTIASP 1093和1954TQLLRRLHQWIS 1965)氨基酸有较高的同源性;计算机辅助分析提示这两个位点具有形成表位的性质。结论获得了两个HCV抗原表位,在HCV感染的检测中具有潜在的应用价值。     

利用噬菌体肽库技术获得与人Fas结合的多肽基序

目的　利用噬菌体随机肽库技术获得与人Fas胞外区结合的多肽及其多肽基序 ,观察多肽基序的生物学功能。方法　以人Fas胞外区与IgGFc段的融合蛋白Fas .Fc为筛选配基 ,筛选噬菌体随机九肽库 ;微量淘洗与ELISA相结合鉴定阳性克隆 ,DNA测序和分析。化学合成多肽进行竞争性ELISA以及细胞增殖抑制实验。结果　经过 4轮亲和筛选 ,微量淘洗鉴定 ,获得 4 2个阳性克隆 ;固定ELISA实验显示筛选到的噬菌体短肽能与Fas .Fc特异性结合 ,并呈剂量依赖关系 ;随机选取 13个阳性克隆进行DNA测序 ,其序列及出现几率分别为 :PRKARVDTS(2 / 13)、YKKKSLQVQ (2 / 13)、YKKKSMLQA(2 / 13)、SRKKYDQYA(4/ 13)、YARKIKPTA(2 / 13)和ARKKTEGAG(1/ 13)。经多重序列分析 ,获得多肽基序 : R/KKK A。在ELISA和竞争性ELISA实验中 ,化学合成多肽EGEFYKKKSM LQADPAK (P3)可抑制Fas与抗人Fas单抗Apo 1的结合 ,且呈剂量效应关系 ;P3不能抑制Fas与FasL的结合。细胞增殖实验表明 ,多肽可抑制Jurkat细胞增殖 ,且随多肽剂量的增加而加强。多肽与单抗Apo 1联合作用对Jurkat细胞增殖的影响与单独使用P3没有明显差别。结论　通过噬菌体随机肽库技术获得与Fas结合的多肽及其多肽基序 ,它们可能模拟了抗Fas抗体Apo 1对Fas的结合位点 ,为基于Fas凋     

应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位

目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.     

应用噬菌体展示肽库技术淘选大鼠CCR5膜外第一、二胞外环特异性结合的活性拮抗肽与初步鉴定

目的:利用噬菌体展示肽库技术淘选与大鼠CC趋化因子受体5(CCR5)膜外第一、二胞外环特异性结合的短肽,并鉴定其与CCR5的结合能力。方法:在蛋白质数据库中查得大鼠CCR5第一、二胞外环的氨基酸序列,合成相应的线性短肽作为淘选的靶分子,利用噬菌体展示7肽文库进行3~4轮淘选,用ELISA法鉴定所选肽与靶分子的结合,并测定其与浓度的关系。结果:与CCR5第一、二胞外环特异性结合的噬菌体展示的短肽序列分别为GHWKVWL和HYIDFRW,ELISA鉴定呈阳性反应,且短肽与靶分子的结合具有浓度依赖性和可饱和性。结论:利用噬菌体展示技术成功获得了2条CCR5特异性结合的短肽,并在体外证明其可与CCR5第一、二胞外环具有结合能力。     

Selection of the specific coalescent peptide of human CD59 by phage display techniques

To screen and identify the short peptides with specific binding activity to human CDS9 and to design the short-peptide clamp against tumor escape, the phage display peptide library containing 12 peptides was used to select the highly expressed specific coalescent peptide of human CD59 in CHO cells. Positive phage clones obtained after 5 rounds of biopanning and detected with ELISA were obtained , in which 8 of them with high binding activity to human CD59 were sequenced. The 3 sequences thus obtained showed high homology with each and certain homology with sequence with human CD2 (PubMed 339HGAAENSISPSS), and all contained primary structure HXAXXXXXXPXX, of which this sequence may be the mimic conformational epitope binding to human CD59. These results in the present study may be helpful to design the short-peptide clamp against the active sites of CD59 on tumor escape.     

子宫内膜腺癌细胞系特异性结合短肽筛选及分析

目的和方法：用噬菌体随机12肽库对人子宫内膜腺癌细胞系(EAC)进行全细胞筛选,并通过特异性结合实验检验所筛选出的克隆的结合特异性。 结果： 经过5轮“吸附-洗脱-扩增”，噬菌体高度富集,并得到1个结合特异性较强的克隆。 结论： 利用噬菌体肽库可以简便、迅速地筛选出与EAC特异性结合的克隆，为进一步研制子宫内膜癌的靶向药物提供实验依据。     

应用噬菌体肽库技术获得与猪鼻支原体蛋白P37结合的多肽序列

本研究以猪鼻支原体P37蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示随机肽库进行亲和淘选。利用ELISA法鉴定亲和力高的阳性噬菌体克隆,对其进行DNA测序和分析,据此推导随机多肽的氨基酸序列,然后构建、表达GST-多肽重组蛋白,经GST-pull down进一步鉴定该多肽与P37的结合力。经过4轮筛选和单克隆检测,获得18个有较强特异反应的阳性克隆,18个克隆包括了5种不同的小肽序列,它们分别为ACAPKPPWLC(12/18)、RPLSIDP-WSPHL(3/18)、RPLSNDPWSPHL(1/18)、QNMMSPIEGVRI(1/18)和WAPEKDYMQLMK(1/18)。用ACAPK-PPWLC、RPLSIDPWSPHL与GST重组的融合蛋白进行GST-pull down实验表明,RPLSIDPWSPHL多肽能与P37相互作用。本研究为进一步筛选与P37相互作用的蛋白提供了实验依据和结构基础。