脑缺血再灌注后脑组织Cyclin D1和CDK4基因的表达及其意义

①目的研究脑缺血再灌注后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)基因表达及其与神经细胞凋亡的关系。②方法成年健康雌性SD大鼠36只,随机分为假手术组4只和实验组32只,实验组再进一步分为缺血1.5h再灌注2h、6h、12h、1d、2d、3d、7d和14d亚组,每组4只。应用线栓法经左侧颈外颈内动脉插线建立SD大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,应用原位末端标记(TUNEL)技术检测脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的变化,原位杂交技术检测CyclinD1mRNA和CDK4mRNA的表达。③结果脑缺血再灌注2h脑组织即开始出现凋亡神经细胞,并于1d和2d分别在皮质区和纹状体区达高峰。神经细胞CyclinD1mRNA和CDK4mRNA的表达分别于再灌注2h和6h开始逐渐增强,并于12h和1d分别在皮质区和纹状体区达高峰,至再灌注14d降至假手术组水平。④结论脑缺血再灌注后皮质区、纹状体区对缺血更为敏感,CyclinD1mRNA和CDK4mRNA表达可能是诱导细胞凋亡的重要因素之一。     

细胞周期正负调控因子在伤口愈合中的表达的观察

目的 探讨伤口愈合过程中细胞周期正负调控因子CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p^21cipl、p^27kipl、p16^ink4a、p^15ink4h的表达变化及意义。方法 采用大鼠全皮层开放伤模型，收集伤后3—30d伤口组织，以免疫组织化学法测定细胞增生标志物Ki67的表达，Western blot法检测CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4及p^21cipl、p^27kipl、p16^ink4a、p^15ink4b.结果 细胞生长主要发生在伤后一周之内，生长高峰出现在伤后5d。CyclinD1、CDK2、CDK4的表达均保持较为恒定的水平，整个愈合过程无明显的起伏变化；伤后3—11d，CyclinnE呈高表达，14d开始明显下降，伤后21—30d几乎回落到伤前水平。Western blot法未检测到p16^ink4a、p^15ink4b的表达；p^21cipl在伤后7—14d呈一过性表达，其峰值水平出现在伤后9d;p^27kipl呈结构性表达，伤后3—5d表达强度相对低下，随后大幅度上调。结论 伤口愈合过程中，p^21cipl、p27kipl表达确与K567的表达呈反向趋势，P^21cipl、p^27kipl在防止过度增生趋势中发挥着监控作用，其中p^27kipl的作用更为重要。     

P16、CDK4、cyclinD1在乳腺癌中的表达及临床意义

[目的]探讨P16、CDK4、cyclinD1蛋白在乳腺癌组织中的表达情况及临床意义。[方法]用免疫组织化学方法,检测32例乳腺癌组织石蜡切片P16、CDK4及cyclinD1蛋白的表达情况,并分析其与临床病理学指标之间的关系。[结果]P16、CDK4在Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅲ级中的表达差异有显著性意义(P<0.05)。P16、CDK4蛋白的阳性表达与患者的年龄、肿瘤的大小、淋巴结转移及雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达均无显著相关性。cyclinD1在Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅲ级中的表达差异没有显著性意义(P>0.05),随着乳腺癌分化程度的降低,阳性表达呈现升高趋势。cyclinD1蛋白的阳性表达与患者的年龄、肿瘤的大小、淋巴结转移及ER、PR表达均无明显相关性。[结论]P16蛋白的失表达和CDK4、cyclinD1蛋白的过表达可能参与了乳腺癌的发生和发展。     

胆道梗阻肝脏部分切除后肝细胞周期素及其依赖性激酶mRNA的表达变化

目的 检测胆道梗阻肝脏部分切除术（PH）后肝细胞周期素（cyclin)D1、E及细胞周期素依赖性激酶CDK2、CDK4 mRNA的表达变化。方法 Wistar大鼠随机分为正常70％肝部分切除组（N－PH）、胆道梗阻（BDO）胆流再通（RBF）70％PH组（BDO－PH）及胆道梗阻胆流再通组（BDO－RBF）。RT－PCR法检测肝细胞cyclin D1、cyclin E mRNA及CDK2、CDK4 mRNA表达。结果 BDO－PH后肝细胞cyclin D1 mRNA和CDK4 mRNA、 cyclin E mRNA和CDK2 mRNA表达变化时限一致，其表达增长缓慢，表达高峰晚于N－PH组12－24h，分别于70％PH后24h及48h达到高峰，且其高峰表达值亦明显低于N－PH组。结论 胆道梗阻大鼠70％PH后肝细胞cyclin D1 mRNA、clcin E mRNA及CDK2 mRNA、CDK4 mRNA表达高峰延后，且表达量减少。     

P16、cyclinD1和CDK4在膀胱移行细胞癌中表达的临床意义

目的探讨细胞周期调控系统相关因子在膀胱移行细胞癌中表达的临床意义。方法应用免疫组化染色方法检测P16、cyclinD1和CDK4在92例膀胱癌中的表达,运用χ^2检验统计分析。结果①在膀胱癌组织中P16表达下调;cyclinD1和CDK4表达上调。②92例膀胱癌中,P16保留表达率随分级、分期的增加而下降,在复发肿瘤中下降;③92例膀胱癌中,cyclinD1和CDK4保留表达率随分级、分期的增加而增加,在复发肿瘤中增加。结论P16、cyclinD1和CDK4的表达和膀胱移行细胞癌的生物学行为密切相关,在膀胱癌的发生发展中有重要意义。     

p27kip1基因在大鼠自体静脉移植中的表达

目的:观察p27kip1基因在静脉移植模型中的动态表达及与内膜增生的关系。方法:建立大鼠自体静脉移植动物模型,分别于术后1,2,3,7,14,28d取材。Verhoeff染色观察各时间点内膜厚度及管壁厚度;RT-PCR、原位杂交、Western blot检测p27kip1mRNA及蛋白的变化,免疫组化(SABC)法检测p27kip1、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果:术后7d内膜明显增厚,14d内膜增厚达到高峰(P<0.01)。p27kip1蛋白在正常对照血管可见表达,术后3d内无表达,术后7d开始表达,14d明显增高,28d达到高峰(P<0.01)。mRNA的表达于术后7d出现增高,持续表达至28d,其间各时间点之间表达无明显差异。PCNA的表达于术后7～14d达到高峰。结论:p27kip1基因的表达可能是抑制移植静脉内膜增生的环节之一,其可能成为治疗移植血管狭窄、闭塞的目的基因。     

辛基酚对MDA-MB-231乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响

目的:观察辛基酚(OP)对细胞周期及周期蛋白表达的影响,探讨OP抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的可能分子机制.方法:以MTT试验、流式细胞分析、免疫细胞化学和RT-PCR等方法观察OP对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、细胞周期、CDK2,CDK4,cyclin D1和cyclin D3表达的影响.结果:4, 8 μmol/L OP作用MDA-MB-231乳腺癌细胞48h时,其抑制率为(17.1±4.1)%, (40.3±8.7)%,cyclin D1表达量荧光值为55.1±10.2,41.4±11.2,比对照组(89.9±11.2)明显降低(P＜0.05). 8 μmol/L OP作用MDA-MB-231乳腺癌细胞24 h和72 h,G0/G1期细胞为(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%,G0/G1期细胞比对照组[24 h,(46.6±12.8)%;72 h,(15.3±3.1)%]明显增高(P＜0.05). OP导致MDA-MB-231乳腺癌细胞中CDK2,CDK4,cyclin D1和cyclin D3 mRNA的表达降低,且cyclin D1蛋白的表达也降低.结论:OP能抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖,其机制可能与OP能降低乳腺癌细胞中CDK2,CDK4,cyclin D1和cyclin D3 mRNA及其蛋白的表达有关.     

CyclinD1/CDK4在洛伐他汀抑制裸鼠乳腺癌移植瘤增殖中的作用

目的以裸鼠乳腺癌异种移植瘤动物模型为研究对象,检测了洛伐他订(LOV)对高表达BRCA1基因乳腺癌异种移植瘤生长能力的影响,并初步探讨了其作用的分子机制。方法将PCDNA3-BETA-HA-HSBRCA1质粒进行扩增、鉴定后,运用脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,经RT-PCR、WESTERN BLOTTING鉴定转染后BRCA1的表达,以2×106个MCF-7、MCF-7BRCA1细胞接种BALB/C裸鼠,建立乳腺癌细胞异种移植瘤动物模型,肿瘤生长4周后,皮下注射LOV[50MG/(KG.D)]10D,检测肿瘤的增殖能力和组织病理学变化,RT-PCR、WESTERN BLOTTING检测CYCLIND1、CDK4MRNA及蛋白表达。结果裸鼠分别接种MCF-7、MCF-7BRCA1细胞后均能长出肿瘤,成瘤率为100%,组织病理切片观察其生物学特性没有发生改变;经LOV干预10D后,MCF-7细胞和MCF-7BRCA1细胞移植瘤体积均缩小,移植瘤内CYCLIND1、CDK4MRNA及蛋白表达降低;癌细胞数减少,坏死灶增多,且MCF-7BRCA1细胞移植瘤组变化更明显。结论洛伐他汀明显阻滞高表达BRCA1基因乳腺癌异种移植瘤的生长、增殖,这可能与移植瘤组织内CYCLIND1、CDK4表达的降低有关,该效应提高了乳腺癌异种移植瘤对洛伐他汀的敏感性,增强了洛伐他汀的抗肿瘤作用。     

细胞周期素D1、CDK4和VEGF在舌鳞状细胞癌中的表达及相互关系研究

目的 探讨细胞周期素D1（cyclin D1）、细胞周期素依赖激酶4（CDK4）和血管内皮生长因子（VEGF）在舌鳞状细胞癌中的表达及其作用。方法采用免疫组织化学方法检测cyclin D1、CDK4和VEGF在39例舌鳞癌和15例正常舌黏膜中的表达情况，分析其与舌鳞癌组织学分级和颈部淋巴结状态之间的关系。结果cyclin D1、CDK4和VEGF在舌鳞癌中的阳性表达率分别为69．2％、61．5％和66．7％．均高于正常舌黏膜，差异均有显著性意义（均P〈0．01），cyclin D1、CDK4和VEGF在舌鳞癌中的表达均有相关性（均P〈0．01），伴有颈部淋巴结转移组的阳性表达率高于无转移组。结论cyclin D1、CDK4和VEGF在舌鳞癌组织中呈过表达，三者之间的相互作用与舌鳞癌增殖、侵袭和转移密切相关。     

缺血性急性肾衰病程中cyclin E和CDK2的作用

目的：探讨cyclin E和周期素依赖性激酶2（CDK2）在缺血性急性肾衰大鼠肾组织中的表达及其与肾小管上皮细胞增殖之间的关系。方法：急性肾衰大鼠分别在第0、2、7、10、14天处死，取血测定肌酐值，免疫组化法观察肾细胞增殖程度以及cyclin E和CDK2的分布，蛋白印迹法检测肾组织中cyclin E和CDK2蛋白表达。结果：大鼠血清肌酐值在缺血再灌注第2天时显著增高，第7天时最高，第10天时开始降低，第14天时基本降至正常。对照组肾组织的细胞增殖指数（PI）为0.7%，肾缺血后第2、7、10和14天分别为14.8%、30.9%、23.6%和12.4%。Cyclin E和CDK2蛋白在肾组织内主要分布于肾小管，且第2天表达弱阳性，第7和10天表达分别为强阳性和阳性，第14天表达减弱；两种蛋白的水平与免疫组化结果一致。两种蛋白表达水平和PI之间均呈正相关。结论：缺血性急性肾衰大鼠肾小管上皮细胞增殖与肾组织cyclin E和CDK2表达上调密切相关。     

自体静脉移植术后血管平滑肌细胞凋亡与增殖的研究

目的检测静脉移植术后不同时期血管平滑肌细胞(VSMCSs)增殖与凋亡,进一步探讨其在血管内膜增生(IH)发生中的作用.方法60只Wistar大鼠建立自体静脉移植模型,自身正常静脉做对照,应用DNA原位缺口末端标记技术(TUNEL)及免疫组织化学方法检测不同时期(术后1、2、4、6、8周)凋亡及Ki-67表达情况,并作相关分析.结果术后1～8周,移植静脉VSMCS的TUNEL及Ki-67的阳性表达均显著高于对照组(P＜0.01).术后1、2周,二者表达均达高峰,且TUNEL表达低于Ki-67表达;而术后4～8周,TUNEL表达高于Ki-67表达.二者的表达具有显著相关性(r=0.813,P＜0.05).结论静脉移植术后VSMCSs的增殖与凋亡共存,且具有明显相关性,提示二者均参与静脉的重塑过程;术后移植静脉的再狭窄可能与VSMCS的凋亡和增殖失衡有关;对再狭窄的防治应采用调节VSMCS增殖和凋亡平衡的联合策略.     

纳米粒子介导的BMP-2基因转染对移植血管内膜增生的抑制作用

［摘要］ 目的：研究人骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因局部转染后,BMP-2基因蛋白过表达对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用,探讨防治移植静脉再狭窄的新途径。方法:以包载BMP-2基因的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的纳米级粒子混合物(BMP-2-PLGA)转染培养的兔VSMC,作为BMP-2-PLGA纳米粒子组,同时设空白PLGA纳米粒子组及对照组,MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。建立自体静脉移植兔模型,随机分成转基因组、空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组,分别于术后3、7、14和28 d取出移植静脉,Verhoeff染色检测血管内膜厚度,Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达,免疫组织化学法检测BMP-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果：与对照组比较,BMP-2-PLGA纳米粒子组细胞发生明显的G1期阻滞(P<0.05),细胞增殖抑制率及细胞凋亡率增加(P<0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔血管内膜平均厚度明显减少(P<0.05),空白载体粒子组与单纯静脉移植对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔移植静脉组织BMP-2蛋白表达于术后3、7和14 d明显增多(P<0.05),PCNA表达于术后7～28 d明显降低（P<0.01）;空白粒子组与单纯静脉移植对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：BMP-2基因的表达能够有效抑制自体静脉移植后内膜增生及VSMC的增殖,促进体外培养VSMC的凋亡。
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C-myc siRNA抑制大鼠自体移植静脉再狭窄的研究

目的静脉移植术后c-myc基因持续高表达是导致血管内膜增生进而再狭窄的原因之一。文中探讨通过局部给药方法给予针对c-myc基因的小分子干扰RNA(siRNA)对自体移植静脉内膜增生的影响。方法建立SD大鼠自体颈外静脉-颈总动脉移植模型。32只大鼠按移植静脉外膜局部给药不同处理方式方法分为未处理组(No treatment组)、凝胶组(Gel组)、无义序列组(scramble sequence group,SCR组)、c-myc RNA干扰组(C-myc siRNA组),于术后3周处死大鼠取移植静脉,光学显微镜下测量内膜厚度,免疫组化染色检测移植静脉增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、c-myc蛋白的表达,Q-RT-PCR检测移植静脉c-myc mRNA的含量。结果 C-myc siRNA组内膜厚度[(15.0±2.2)μm]显著低于No treatment组[(58.3±8.3)μm]、SCR组[(60.5±6.1)μm]和Gel组[(63.5±5.4)μm]。C-myc siRNA组静脉内膜区和中膜区PCNA阳性细胞率显著低于SCR组[分别为(8.4±2.2)%vs(68.5±5.0)%,P<0.05和(15.0±3.1)%vs(55.2±7.5)%,P<0.05],c-myc蛋白阳性细胞率C-myc siRNA组显著低于SCR组[(30.6±2.6)%vs(48.5±3.5)%,P<0.05]。C-myc siRNA组移植静脉中c-myc mRNA的表达相对量显著低于SCR组(0.48±0.05 vs 1.00±0.12,P<0.05)。结论C-myc siRNA能抑制移植静脉中平滑肌细胞的增殖,抑制内膜的增生,减轻移植静脉再狭窄程度。     

核因子κB的小干扰RNA防治自体移植静脉再狭窄的实验研究

目的   探讨核因子κB（NF-κB）的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA)对大鼠自体静脉移植术后血管内膜增殖及相应炎性细胞因子表达的影响。方法    雄性Wistar大鼠80只,随机分为空白组（A组,n=10）;自体静脉移植组（B组,n=18）;空载体组（阴性质粒脂质体医用蛋白胶复合物转染移植静脉,C组,n=26）和基因转染组（NF-κB siRNA阳离子脂质体医用蛋白胶复合物转染自体移植静脉,D组,n=26）。B、C及D组需制作大鼠自体颈外静脉——腹主动脉移植模型,每组4个时点( 3,7,14,21d),相应时间点取移植静脉观察病理形态学变化,免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）,PCR测定单核细胞趋化因子（MCP-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF α）的mRNA含量,Western blot测定NF-κB p65蛋白的表达。结果    自体静脉移植术后,B、C和D组移植静脉血管桥均出现内膜增生变厚,新生内膜有大量PCNA阳性细胞,中膜平滑肌细胞增生活跃。术后3d,B组和C组 MCP-1 mRNA及TNF-αmRNA表达水平明显高于A组（P＜0.05）,但D组水平明显低于C组（P＜0.05）。术后7d,B、C组NF-κB p65蛋白表达水平明显高于A组（P＜0.05）,与C组相比,D组NF κB p65蛋白水平明显降低（P＜0.05）。结论     NF-κB的基因表达产物和MCP-1mRNA、TNF-αmRNA的表达有一定相关性,自体静脉移植术后新生内膜增生及炎性细胞因子表达在不同时相点呈动态变化。转染NF-κB siRNA阳离子脂质体复合物可抑制NF-κB的表达,减少MCP-1及TNF-αmRNA的表达,从而抑制移植静脉内膜增生和VSMC增殖,减轻再狭窄。     

CDK2-AP1基因过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及周期的影响

目的:通过过表达手段上调细胞周期调节蛋白依赖性激酶2- 关联蛋白1(CDK2-AP1) 基因在乳腺癌细胞MCF-7 中的表达, 并观察其对MCF-7 细胞生长和细胞周期调控的作用。方法:将CDK2-AP1 基因的编码框构建于慢病毒表达载体, 导入MCF-7 细胞, 应用实时定量PCR 和Western 印迹验证CDK2-AP1 基因mRNA 和蛋白的表达效率。利用M 法绘制生长曲线、克隆形成实验观察CDK2-AP1 基因过表达后MCF-7 细胞生长的变化, PI 染色流式细胞仪检测MCF-7 细胞周期的改变。通过Western 印迹检测CDK2-AP1 过表达后, 细胞周期相关蛋白(CDK2, CDK4, P16^Ink4A, P21^Cip1/Waf1) 的表达。结果:过表达CDK2-AP1 基因的慢病毒感染MCF-7 细胞可上调其mRNA 表达6.94 倍, 蛋白表达也十分显著地增高, 两者相一致。生长曲线显示MCF-7 细胞过表达CDK2-AP1 基因后, 增殖能力显著降低(P<0.05);克隆形成实验表明, 其形成的克隆数目同样显著减少(P<0.05);流式细胞仪检测证实MCF-7 细胞过表达CDK2-AP1 能够使细胞周期出现G₁期阻滞, 并且出现凋亡峰;CDK2-AP1 基因表达上调导致P21^Cip1/Waf1和P16^Ink4A蛋白表达上调, CDK2 和CDK4 蛋白表达下调。结论:CDK2-AP1 基因具有抑癌基因的功能, 在乳腺癌MCF-7 细胞过表达该基因能够抑制细胞的生长和克隆形成能力, 并且使细胞阻滞于G₁期。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体上。测序鉴定后切下相应的片段,连接到表达载体pET-22b(+)上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3),使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定表达蛋白。【结果】用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌,Westernblot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体,后两者在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。     

兔自体静脉移植物的中膜平滑肌细胞超微结构变化

目的：观察臬体静脉移植物的中膜平没肌细胞超微结构变化及其增生特点,为内膜增生的防治提供实验依据。方法：以兔右颈外静脉间置于同侧颈总动脉为模形,术后３,７,１４,２８d分别获取移植段静脉,在透射电镜下观察其中膜平滑机细胞超微结构的变化。结果：术后３d时未见移植段静脉中膜平滑肌细胞增生,７d时可见增生,１４d时达高峰,可见正 在分裂 中的平滑肌细胞呈哑铃形,胞质内内质网和线粒体等丰富,核仁明显变大。２８d     

BMP-2基因在兔自体静脉移植中的动态表达

目的观察BMP-2基因在静脉移植模型中的动态表达及与内膜增生的关系。方法建立兔自体静脉移植动物模型,分别于术后3、7、14、28d取材。Verhoeff染色观察各时间点内膜厚度及管壁厚度;Western blot检测BMP-2蛋白的变化,免疫组化(SABC)法检测BMP-2、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果术后7d内膜明显增厚,14d内膜增厚达到高峰(P<0.01)。BMP-2蛋白在正常对照血管可见表达,术后3d内无表达,术后第七天开始表达,第十四天明显增高,28d达到高峰(P<0.01)。PC-NA的表达于术后7～14d达到高峰。结论 BMP-2基因的表达可能是抑制移植静脉内膜增生的环节之一,可能成为治疗移植血管再狭窄的目的基因。