吉非替尼耐药人肺腺癌细胞的建立及耐药机制的研究

目的建立吉非替尼耐药的人肺腺癌细胞株A549/GR,并初步探讨其生物学特性及其耐药机制。方法采用逐步增加吉非替尼剂量法诱导人肺腺癌细胞A549形成吉非替尼耐药的细胞株A549/GR;CCK-8法检测细胞的半数抑制浓度(IC50)及绘制细胞生长曲线,并计算耐药指数;显微镜下观察吉非替尼作用前后A549、A549/GR细胞形态学的改变;直接测序法检测EGFR基因在酪氨酸激酶区的基因突变;q RT-PCR法检测EGFR基因在m RNA水平表达的改变。结果 CCK-8法测得A549/GR细胞的耐药指数为6.00,显示成功建立了吉非替尼耐药的细胞模型,其倍增时间较亲代细胞缩短;形态学观察显示A549/GR细胞极性消失,有变长梭形的趋势;A549/GR细胞系EGFR基因酪氨酸激酶区未发现基因突变;q RT-PCR法显示A549/GR细胞EGFR基因在m RNA水平较亲代细胞轻度上调。结论成功建立吉非替尼耐药人肺腺癌A549/GR细胞模型,A549/GR细胞耐药性的产生与EGFR基因18-21外显子区域突变无关。     

E-cadherin基因在卵巢癌高低转移细胞中的差异表达及其机制的探讨

[目的]探讨上皮性细胞黏附分子在人卵巢浆液性囊腺癌高、低转移细胞株HO-8910和HO-8910PM的表达情况.[方法]采用蛋白印迹及免疫细胞化学方法检测2种细胞株的E-cadherin蛋白表达差异,用RT-PCR法检测2种细胞株的mRNA表达差异,用PCR及基因测序法检测基因突变情况.[结果]E-cad蛋白及mRNA在HO-8910中表达,在HO-8910PM中不表达.在E-cadherin基因外显子6～9未发现突变.[结论]E-cad的表达可能与肿瘤的转移能力负相关.     

粒状头样蛋白2下调诱导上皮间质转化促进肿瘤细胞对吉非替尼耐药

目的 探讨粒状头样蛋白2（GRHL2）在肿瘤靶向治疗药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）吉非替尼获得性耐药中的作用和可能机制。方法 利用吉非替尼浓度逐步递增的体外诱导方法培养人结直肠癌细胞DiFi和人肺腺癌细胞HCC4006,获得吉非替尼耐药细胞株。通过RNA测序方法筛选在耐药细胞株与其亲代细胞中差异表达的基因并进行实时荧光定量PCR验证。使用pcDNA3.1-GRHL2质粒转染耐药细胞株使GRHL2过表达,用CCK-8法检测细胞对吉非替尼的敏感性。采用蛋白质印迹法检测耐药细胞株中上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin的表达变化,并通过CellMiner^TM数据库分析60株人肿瘤细胞系中GRHL2表达与E-cadherin和Vimentin表达的关系。结果 成功获得DiFi和HCC4006的耐药细胞株。通过RNA测序和实时荧光定量PCR验证发现GRHL2在耐药细胞株中表达下调,而在耐药细胞株中过表达GRHL2后细胞恢复了对吉非替尼的敏感性。蛋白质印迹分析表明耐药细胞株中上皮标志物E-cadherin表达下调,而间质标志物Vimentin表达上调;CellMiner^TM数据库分析表明GRHL2的表达与E-cadherin/Vimentin比值高度一致。结论 GRHL2表达下调通过诱导上皮间质转化介导肿瘤细胞对吉非替尼的耐药。     

人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株的建立及其生物学特性观察

目的:建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。方法:采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立5-FU获得性BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。MTT法检测耐药细胞株对多种化疗药物的交叉耐药性。观察其细胞形态学、生长曲线、倍增时间、平板克隆形成率、贴壁率、细胞周期分布、染色体核型以及裸鼠致瘤性。流式细胞术检测阿霉素在亲本及耐药细胞株内的积聚量。免疫细胞化学法检测胸苷酸合酶在耐药细胞内的表达。结果:成功建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株模型。该耐药细胞对阿霉素、长春新碱、奥沙利铂及甲氨蝶呤均有不同程度的交叉耐药性,但对羟基喜树碱仍较敏感。体外培养见细胞趋向群集性生长。耐药细胞株倍增时间较亲本细胞株长,克隆形成率则较亲本细胞株低,差异有统计学意义。耐药细胞贴壁率在23、h明显低于亲本细胞株,其G0/G1期细胞分布比率较低而S期比率明显增加。阿霉素在耐药细胞株内的积聚量低于亲本细胞株,耐药细胞株胸苷酸合酶的蛋白表达量较亲本细胞株明显增强。结论:人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株可以成为研究5-FU获得性耐药机制及开展多药耐药逆转剂筛选较好的体外模型。     

非小细胞肺癌奥希替尼耐药细胞株的建立与鉴定及耐药后对化疗的敏感性

目的：建立非小细胞肺癌奥希替尼耐药细胞株H1975AR,对亲本和耐药细胞株进行鉴定,探讨耐药机制。方法：在体外采用浓度递增的方法予奥希替尼处理诱导H1975细胞建立奥希替尼耐药细胞株H1975AR;光镜及Giemsa染色比较2种细胞形态学差异;第二代测序（next generation sequencing,NGS）检测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变;磺酰罗丹明B（sulforthodamine B,SRB）法检测细胞增殖,评估细胞对EGFR?酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）和化疗药的敏感性;分别予0、10、100、1 000 nmol/L奥希替尼处理6 h,Western blot法检测EGFR及下游增殖信号的变化。结果：①SRB法测得H1975AR的耐药指数为3 634.75,显示H1975AR是奥希替尼耐药细胞株;②耐药细胞株形态发生改变且核浆比增大;③与H1975相比,给予奥希替尼处理对H1975AR的p?EGFR和p?ERK抑制作用不明显,且相同的给药浓度对H1975AR的p?AKT抑制作用较弱,同时下调c?Met的表达;④H1975和H1975AR对第一代EGFR?TKI耐药,对顺铂和紫杉醇敏感。结论：H1975AR细胞EGFR C797S顺式突变的产生是奥希替尼主要耐药机制,并对顺铂和紫杉醇敏感。     

长链非编码RNA BANCR与非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的相关研究

目的：探讨长链非编码RNA BANCR与非小细胞肺癌表皮生长因子受体（EGFR）-酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药之间的相关性。方法：选择EGFR19外显子区缺失突变的细胞株以及野生型细胞株进行研究,应用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测耐吉非替尼细胞株PC9/GR及亲本细胞株PC9中BANCR的表达差异,发现BANCR在PC9/GR细胞中显著低表达。在PC9/GR细胞中过表达BANCR,分别应用CCK8法、克隆形成实验、流式细胞术检测过表达后PC9/GR细胞对吉非替尼药物敏感性,细胞增殖能力,联合吉非替尼处理后细胞凋亡变化;Western blot检测过表达BANCR后对PC9/GR细胞上皮间质转化（EMT）的影响。结果：①吉非替尼的敏感细胞株的RNA BANCR表达水平较高,耐药细胞株的RNA BANCR表达水平较低（P<0.05）。②在PC9/GR细胞中过表达BANCR,相对于对照组,吉非替尼对PC9/GR细胞的半数抑制浓度（IC50）减低,前后差异具有统计学意义（P<0.05）。过表达BANCR后PC9/GR细胞增殖能力减弱,经吉非替尼处理后细胞凋亡增多（P<0.05）。③与空白对照组比较,Western blot结果显示过表达BANCR的PC9/GR细胞E-钙粘蛋白表达水平明显升高,N-钙粘蛋白水平明显降低。结论：长链非编码RNA BANCR可诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖;过表达BANCR可以增加PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性,逆转其耐药性,这一作用机制可能是通过调控EMT过程来发挥作用的。     

硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其差异表达蛋白的飞行时间质谱分析

目的:建立硼替佐米耐药的骨髓瘤细胞株,探讨硼替佐米敏感和耐药多发性骨髓瘤细胞株在蛋白质组水平上的差异.方法:采用硼替佐米浓度递增法诱导NCI-H929细胞株产生耐药株.采用流式细胞术比较亲本NCI-H929和NCI-H929B的细胞周期,双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析两者间的差异蛋白表达情况.采用Western blot方法对部分鉴定结果进行验证.结果:采用浓度递增法自骨髓瘤细胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐药株NCI-H929B.MTT法检测硼替佐米对亲本NCI-H929和NCI-H929B 24 h的IC50,其分别为20.7 nmol/L和487.4 nmol/L,耐药倍数为23.5.生长曲线及流式细胞术分析显示NCI-H929亲本和NCI-H929B的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异.与亲本NCI-H929细胞的2-DE相比,NCI-H929B细胞中有11个蛋白点表达明显上调,6个明显下调.对这17个蛋白质点进行MALDI-TOF-MS分析,共获得了17个肽质量指纹图谱(PMF).将PMF质量数据通过Aldente软件查询SWISS-PROT数据库,根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等,初步鉴定出14种蛋白质.Western blot验证其中一种蛋白质(蛋白DJ-1),结果与双向电泳鉴定结果基本一致.结论:通过浓度递增法可建立硼替佐米耐药的骨髓瘤细胞株.双向电泳结果提示这些差异表达的蛋白质可能与多发性骨髓瘤对硼替佐米耐药的机制有关.     

EGCG对人肺癌细胞NCI-H1975和NCI-H520细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系增殖凋亡、周期的作用机制.方法 对数生长期NSCLC细胞系NCI-H1975和NCI-H520,分为空白对照组(0 mol/LEGCG)和不同剂量(20、40、80、160、320 mol/L) EGCG组,分别处理作用24、48、72 h,CCK-8法检测细胞凋亡率;细胞流式细胞术检测细胞凋亡和周期;Western blot检测细胞周期、凋亡相关蛋白表达及NF-kB/Bcl2和EGFR/ERK/AKT信号通路变化;细胞分为:Control siRNA组、EGFR siRNA组和EGFRsiRNA+EGCG组,采用siRNA转染技术,分析下调EGFR对NF-kB/Bcl2和EGFR/ERK/AKT信号通路的影响.结果 分组的相应浓度EGCG组NCI-H1975和NCI-H520细胞的增殖显著降低(P＜0.05),同时G1/G0细胞比例增高,G1/S期细胞比例下降(P＜0.05),CyclinD1、CyclinE、CDK6蛋白表达降低(P＜0.05),但对CDK4无明显影响(P＞0.05),同时细胞凋亡增多,Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9蛋白表达上调(P＜0.05).P-P65、Bcl2、P-EGFR、P-AKT蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,但对P-ERK没有明显的影响.而EGCG+EGFR siRNA组,相比于EGFR siRNA组,明显降低各蛋白的表达,升高Bax蛋白(P＜0.05).结论 EGCG下调NF-kB/Bcl2和EGFR/ERK/AKT信号通路抑制NCI-H1975和NCI-H520细胞增殖、促进凋亡,并阻断细胞周期.     

长链非编码RNA BANCR与非小细胞肺癌EGFR⁃TKI耐药的相关性研究

目的：探讨长链非编码RNA BANCR与非小细胞肺癌表皮生长因子受体?酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor?tyrosine kinase inhibitor,EGFR?TKI）耐药之间的相关性。方法：选择EGFR 19外显子缺失突变的细胞株PC9以及EGFR?TKI吉非替尼诱导的耐药细胞株PC9/GR进行研究。应用实时荧光定量PCR法（qRT?PCR）检测PC9/GR及PC9细胞中BANCR的表达差异。在PC9/GR细胞中过表达BANCR,应用CCK?8法检测细胞对吉非替尼药物敏感性,克隆形成试验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测上皮间质转化相关蛋白的表达。结果：①BANCR在PC9/GR细胞中显著低表达（P < 0.05）。②在PC9/GR细胞中过表达BANCR后,相对于对照组,吉非替尼对PC9/GR细胞的半数抑制浓度（half inhibition concentration,IC50）降低（P < 0.05）。过表达BANCR后PC9/GR细胞增殖能力减弱,经吉非替尼处理后细胞凋亡增多（P < 0.05）。③Western blot结果显示过表达BANCR的PC9/GR细胞E?钙黏蛋白（E?cadherin）表达水平明显升高,N?钙黏蛋白（N?cadherin）表达水平明显降低（P < 0.05）。结论：长链非编码RNA BANCR可诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖;过表达BANCR可以增加PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性,逆转其耐药性,其机制可能与调控上皮间质转化有关。     

细胞外泌体蛋白AGR2表达差异与上皮性卵巢癌获得性耐药关系及机制研究

目的:探讨细胞外泌体蛋白AGR2表达差异与上皮性卵巢癌获得性耐药的关系。方法:用不同浓度顺铂(6、12、18、24μg/mL)处理细胞,筛选出大鼠卵巢癌耐药细胞株,MTT法检测细胞存活率。用超速差速离心法获得外泌体蛋白,纳米流式检测外泌体蛋白的粒径大小及颗粒浓度。通过qRT-PCR技术比较两组细胞系AGR2相关mRNA的转录情况,并通过Western blot实验对外泌体中AGR2蛋白表达水平进行比较,分析细胞外泌体中蛋白AGR2表达差异与上皮性卵巢癌获得性耐药的关系。结果:NUTU-19肿瘤细胞生存率与化疗药浓度呈负相关;药物浓度的升高与耐药细胞株(NUTU-19R)死亡率相关性不明显。NUTU-19R细胞株AGR2相关mRNA表达水平高于NUTU-19细胞株,差异有统计学意义(P<0.05);NUTU-19R细胞株AGR2蛋白表达高于NUTU-19细胞株,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:细胞外泌体蛋白AGR2高表达促进了上皮性卵巢癌获得性耐药的形成。     

胰岛素样生长因子1在非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药机制中的作用

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株和患者中的表达和临床意义。方法 ELISA法检测PC9、A549、H1975细胞和患者血清IGF-1水平,蛋白质印迹和免疫细胞化学法检测细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的表达;MTT法检测吉非替尼和IGF-1受体拮抗剂BMS536924处理后的细胞增殖;收集84例接受EGFR-TKIs治疗患者的临床资料,分析IGF-1表达与临床病理特征和生存期的相关性。结果同吉非替尼敏感细胞株PC9相比,耐药细胞株H1975和A549中IGF-1表达增加(P<0.05),IGFBP表达降低;加入不同浓度的BMS536924可促进吉非替尼对耐药细胞株的增殖抑制(P<0.05)。在接受EGFR-TKIs治疗的患者中,疾病进展者的IGF-1水平较疾病控制者有所增高(P=0.052);原发性耐药者较获得性耐药者的IGF-1水平升高(P=0.02)。IGF-1表达阴性患者的生存期高于阳性患者(P=0.002)。结论 IGF-1在耐药NSCLC细胞株及患者血清中均有高表达,使用IGF-1R拮抗剂可逆转耐药细胞对EGFR-TKIs的反应;IGF-1表达与患者预后相关。     

肺癌细胞株E - cadherin的表达状态及其与启动子甲基化的关系

[目的]研究肺癌细胞株上皮钙粘蛋白(E - cadherin)的表达与基因启动子甲基化状态的关系.[方法]采用免疫细胞化学法检测肺癌细胞株NCI - H460、SPCA和A549的E- cadherin蛋白表达;半巢式甲基化特异性PCR法(MSP)和微流控芯片技术检测E- cadherin基因启动子甲基化状态.[结果]...     

miR-124 modulates gefitinib resistance through SNAI2 and STAT3 in non-small cell lung cancer

Gefitinib is used as a first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Unfortunately, most NSCLC patients inevitably develop gefitinib resistance during treatment. In addition to EGFR mutation status, the mechanisms involved are largely unknown. In this study, we showed that miR-124, a tumor suppressor, was significantly down-regulated in gefitinib-resistant NSCLC patients and cell lines compared with gefitinib-sensitive patients and cell lines. In addition, the miR-124 depletion induced gefitinib resistance, and miR-124 overexpression sensitized gefitinib-resistant cells to gefitinib. Mechanistic analysis revealed that miR-124 decreased SNAI2 and STAT3 expression by directly targeting their 3'UTRs and that knocking down SNAI2 or STAT3 partly reversed the gefitinib resistance induced by miR-124 depletion. Our data demonstrate that the miR-124 plays a new critical role in acquired resistance to gefitinib and that the manipulation of miR-124 might provide a therapeutic strategy for reversing acquired gefitinib resistance.     

BIM在EGFR突变非小细胞肺癌中的表达及其意义

目的 检测非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株的凋亡以及促凋亡蛋白(BIM)的表达,探讨吉非替尼对其的影响.方法 采用Annexin PI单染法检测吉非替尼作用下各细胞株的凋亡,免疫印迹法检测BIM的表达.结果 吉非替尼诱导NSCLC细胞株凋亡,其中对H1650、H1975突变株的诱导凋亡率高于A549细胞株(P＜0.01),H1650的BIM表达随吉非替尼浓度的增加而增强,H1975的BIM表达较高,但受吉非替尼浓度变化的影响不明显,而A549的BIM表达需要更高浓度的吉非替尼作用.结论 吉非替尼可以使NSCLC细胞表皮生长因子受体(EGFR)突变株细胞内的BIM表达增高,并且可能通过上调BIM的表达来诱导肿瘤细胞凋亡.     

葫芦素B靶向抑制STAT3抗吉非替尼耐药非小细胞肺癌的研究

目的探讨葫芦素B通过抑制STAT3信号活化,从而拮抗EGFR T790M突变介导的NSCLC吉非替尼耐药的机制。方法利用不同浓度的葫芦素B作用于PC-9/GR细胞的不同时期,用CCK-8法测定细胞的增殖抑制、PI染色法检测细胞的周期、Annexin-v/7-AAD双标记法检测细胞的凋亡,检测不同浓度以及作用时间的葫芦素B对PC-9/GR细胞增殖抑制、细胞周期阻滞及细胞凋亡诱导效应。结果葫芦素B能够显著抑制PC-9/GR细胞增殖以及对细胞周期的G2/M期有明显阻滞作用,而且呈浓度依赖,随着浓度增加,其增殖抑制作用和阻滞活性也增高,同时观察到PC-9/GR细胞分别加入10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L三种浓度的葫芦素B作用后,抑制了p-Jak2、p-STAT3的表达,且这种抑制呈浓度依赖性,但不影响p-EGFR的激活以及总EGFR、Jak2、STAT3的表达。结论葫芦素B能够抑制吉非替尼耐药NSCLC中异常激活的STAT3信号途径,这种抑制具有选择性,从而诱导吉非替尼耐药NSCLC的凋亡。     

钙黏蛋白与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗肝细胞癌敏感性的相关性

目的 探讨钙黏蛋白（E-cadherin）表达在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗肝细胞癌耐药形成中的作用。方法 选取常见的4种肝细胞癌细胞HepG₂、BEL-7404、SK-HEP-1和MHCC97,用蛋白质印迹法检测这4种肝癌细胞中E-cadherin的蛋白表达,MTT法检测E-cadherin的表达与肝癌细胞EGFR-TKI治疗抑制率的相关性。结果 4种肝癌细胞中HepG₂、BEL-7404 表达E-cadherin呈阳性并对EGFR-TKI治疗敏感,PD153035和吉非替尼两种EGFR-TKI的药物浓度与肝癌细胞HepG₂、BEL-7404的生存率之间存在相关性（P<0.05）;然而,肝癌细胞SK-HEP-1和MHCC97中E-cadherin表达阴性并对EGFR-TKI治疗耐药,PD153035和吉非替尼两种药物浓度与肝癌细胞MHCC97、SK-HEP-1的生存率之间不存在相关性（P>0.05）。另外,E-cadherin表达阴性细胞SK-HEP-1转染E-cadherin目的基因后与转入空载体的肝癌细胞相比,EGFR-TKI治疗的敏感性上调（P<0.05）。结论 E-cadherin在调节EGFR分子靶向治疗的敏感性方面起重要作用。     

肺金生方抗非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药性的分子机制研究

目的探讨肺金生方抗非小细胞肺癌(NSCLC)酪氨酸磷酸酶抑制剂(TKIs)靶向药物耐药的作用及分子机制。方法选用NSCLC细胞系HCC827,按0.01、0.05、0.10、0.50和1.0μM浓度梯度诱导构建吉非替尼耐药细胞株,采用CCK8法检测耐药株是否构建成功,采用荧光定量PCR(q-PCR)检测耐药株c-MET扩增水平。20只BALB/c裸鼠按随机数字表法分成空白对照组、吉非替尼组、肺金生方组和肺金生方+吉非替尼组,每组5只。按每只4×10~7/200μL将吉非替尼耐药细胞株注射于裸鼠后肢皮下,构建皮下移植瘤模型。四组均腹腔注射生理盐水,吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg灌胃;肺金生方组给予肺金生方剂量53.6g/kg灌胃;肺金生方+吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg+肺金生方剂量53.6g/kg联合灌胃给药。给药频次每2天1次,连续给药4周。CCK8法检测耐药HCC827 GR细胞增殖率,流式细胞技术检测耐药HCC827 GR细胞凋亡率,Western blot检测耐药HCC827 GR细胞p-EGFR、p-MET、p-AKT、p-ERK1/2表达水平。结果与空白对照组比较,吉非替尼组裸鼠皮下移植瘤瘤重无差异[(1.34±0.16)g比(1.41±0.13)g,P>0.05],肺金生方组裸鼠皮下移植瘤瘤重明显减轻[(0.77±0.28)g比(1.41±0.13)g,P<0.01],吉非替尼+肺金生方组裸鼠皮下移植瘤明显小于肺金生方组和吉非替尼组[(0.34±0.16)g比(0.77±0.28)g、(1.34±0.16)g,P均<0.01];肺金生方单用或与吉非替尼联用能够明显抑制耐药HCC827 GR细胞的增殖能力[(43.45±4.47)%、(24.25±5.21)%比(100.00±2.14)%,P均<0.01];肺金生方组、吉非替尼+肺金生方组细胞凋亡率显著高于空白对照组[(7.40±0.56)%、(12.80±0.72)%比(3.05±0.54)%,P均<0.01];肺金生方组、吉非替尼+肺金生方组c-MET和p-c-MET表达水平明显降低,并明显抑制下游AKT/ERK1/2磷酸化水平。结论肺金生方或和吉非替尼联用能有效抑制吉非替尼耐药皮下移植瘤的生长,抑制耐药细胞的增殖并促进凋亡,其作用机制可能与下调c-MET蛋白表达以及下游AKT/ERK1/2磷酸化水平有关。