汉坦病毒A9株M基因片段全长cDNA克隆及其在痘苗病…

采取反转录－聚合酶链反应，分３个片段扩增Ⅰ型汉坦病毒（野鼠型）中国毒株Ａ９株Ｍ基因片段，分别克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ载体中。选择个正向插入的ＴＡ９ＩＢ、ＴＡ９ＣＤ、ＴＡ９ＥＡ克隆，选用Ｃｌａ Ⅰ、ＥｃｏＲ Ｖ进行酶切、连接，获得了１个在ＰＧＥＭ－Ｔ载体中插入３．６ｋｂ的Ａ９株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱分析证实插入片段正确。将Ａ９Ｍ片段在痘苗病毒／Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶瞬时表达系统中进行表达，用抗汉     

汉坦病毒A9株全长L片段cDNA克隆和核苷酸序列测定

目的克隆我国分离的汉坦病毒A9株L片段全长cDNA,并测定其核苷酸序列.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分段扩增汉坦病毒A9株全部L片段,用T-A克隆方法进行PCR产物克隆,测定PCR产物的核苷酸序列.通过亚克隆将分段的L片段连接成全长cDNA克隆.结果A9株的基因组L片段长度为6533个核苷酸,腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(%A+U=62.47).包含有一个单一的开放读码框架(ORF),编码一个标准的质量为2.46×105的蛋白,含有2151个氨基酸.A9株与76-118、C1-1和C1-2株的同源性最高,达到83.8%.与TULA病毒的关系较远,其核酸序列的同源性为65.8%.将推导的A9株编码的氨基酸序列与其他21种负链RNA病毒的依赖RNA的RNA聚合酶的氨基酸序列以及汉坦病毒几个代表株的L片段氨基酸序列进行比较,显示A9编码的RNA聚合酶也有6个比较保守的区域以及几个极端保守的氨基酸残基.结论汉坦病毒A9株L片段具有和其他汉坦病毒RNA聚合酶相似的核苷酸一级结构,通过对推导的氨基酸分析,该片段具有一些在RNA病毒聚合酶中都存在的保守区域.     

汉坦病毒A9株M基因片段核苷酸序列的测定及分析

采用反转录-ＰＣＲ方法，分节段扩增汉坦病毒Ａ９株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ，并克隆入ｐＧＥＭＴ载体中，用双脱氧末端终止法直接测定序列。结果表明，Ａ９株Ｍ片段ｃＤＮＡ由３６１８个碱基组成，编码１１３５个氨基酸，　　核苷酸序列及由其推导的氨基酸序列同７６／１１８株的同源性分别为９４．３３％和９７．８０％，说明汉坦病毒Ａ９株与７６／１１８株在糖蛋白的结构上高度保守。同７６／１１８株比较，在３'末端非编码区变异极大，变异率为２０％，且多了２个核苷酸。Ａ９株Ｍ基因片段核苷酸序列的获得，为利用该ｃＤＮＡ进行基因工程疫苗的研制创造了条件。     

中国狂犬病毒疫苗株（5aG）糖蛋白基因在痘苗病毒中的表达及免疫效果观察

将克隆到的中国狂犬病毒疫苗株（５ａＧ）的糖蛋白基因重组到痘苗病毒ＴＫ区，并在痘苗病毒Ｐ１１启动子的控制下，构建了狂犬－痘苗重组病毒（ＶＶａＧ）。经间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印染证明，重组病毒ＶＶａＧ能良好地表达狂犬病毒糖蛋白，其分子量约为６６００。用ＶＶａＧ免疫小鼠，７ｄ便可诱生较高的狂犬病毒中和抗体，２１ｄ达４１６９，并能１００％保护狂犬病毒本毒株和国际标准攻击毒（ＣＶＳ）的致死量攻击。     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

河北省人感染汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省人感染汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76～118株和R22株的C2编码区设计型特异性引物,利用RT-nested PCR技术对采集的HFRS患者中汉坦病毒抗体阳性的血清标本进行检测及基因分型,从中选取部分标本的扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 69份阳性血清标本经RT-nested PCR检测17份阳性,检出率为24.64%,其中≤7 d的标本检出率为34.29%,8～14 d的检出率为19.23%,≥14 d的未能检出.17份阳性标本均为SEO型.对其中9份扩增产物的G2区测序后表明,9份血清标本的同源性为92.0%～100.0%,其中HeB7与其他8份标本的同源性为92.0%～95.0%,属不同亚型,与R22的同源性为97.7%,同属于S1亚型;除HeB7外其余8份标本同源性高达95.7%～100%,同属于S3亚型.9份标本与76～118株的同源性仅为70.3%～72.7%.结论 河北省人感染汉坦病毒以SEO型为主,亚型以S3为主,也存在S1亚型.在一定范围内,同型汉坦病毒基因相对保守,具有区域稳定性特征.     

检测β3-整合素基因在汉坦病毒敏感细胞中的表达

目的 克隆表达β3-整合素基因，制备抗体，并用之进行β3-整合素表达阴性Vero细胞的分离和富集，方法 采用RT-PCR扩增克隆β3-整合素基因，亚克隆至pQE30表达质粒，在原核细胞中表达，免疫印迹实验确证其表达及免疫反应性，纯化蛋白免疫接种家兔制备抗体，补体倡导 的抗体依赖性的细胞毒实验分离富集目的细胞，免疫荧光及免疫印迹检测筛选结果，结果成功克隆β3-整合素基因，并在pQE30表达系统中得到高效表达，免疫印迹证实所表达的β3-整合素蛋白具有良好的免疫反应性，制备了高效抗体，免疫荧光及免疫印迹均未检测出β3-整合素在Vero,VeroE6,Hep-2,2BS和293等汉坦病毒敏感细胞表面的表达。结论 除β3-整合素外，汉坦病毒很可能还有别的受体。     

辽宁地区汉坦病毒分离株的基因分型

目的　分离辽宁地区汉坦病毒并对分离株 (SY 13)进行基因分型 ,以查清辽宁地区汉坦病毒流行株的基因型和基因亚型。方法　采用组织细胞培养法分离汉坦病毒 ;用RT PCR法分别扩增SY 13的M片段G1、G2区和S片段 ;采用邻位相连法 ,通过DNAStar、Clustalx、Phylip等序列分析软件分别对 3个基因片段的序列与从GenBank下载的序列进行同源性分析 ,并构建种系发生树。结果　通过对 3个基因片段进行比较分析 ,SY 13与HTN型同源性较高 ,为 79.3%～ 97.0 % ;通过M片段G2区的比较分析 ,SY 13与BAO 10、BAO 14、JIANG 13、BAO 9、Q 33处于同一分支 ,同源性为 95.0 %～97.0 %。结论　辽宁地区汉坦病毒SY 13株与黑龙江地区分离株属同一亚型 ,为HTN型病毒中的H4亚型     

天津地区汉坦病毒分离株TJJ16S基因片段克隆和序列分析

目的 了解天津地区汉坦病毒分离株TJJ16S基因的分子特征。方法采用细胞培养法从鼠肺标本中分离汉坦病毒，命名为TJJ106，提取TJJ16感染Vero-E6细胞的总RNA，经逆转录扩增病毒cDNA，继而进行PCR扩增S基因片段，纯化后兜隆于pMD-18T载体，测定核苷酸序列并进行分析。结果天津地区首次从社鼠中分离出汉坦病毒TJJ16，其S基因片段全序列长为1701nt。只有1个编码N蛋白的开放读码框架（ORF），起始密码子为第37nt，终止于1326nt，推导其编码的蛋白长为429个氨基酸。经核苷酸系统发生树分析，TJJ16株应归属为汉坦病毒的汉滩型（HTN型）毒株，与HTN型新亚型A16株同属一个亚型。结论TJJ16病毒株的分离与S基因片段序列分析，证实在天津市鼠间存在HTN型汉坦病毒感染，对临床和流行病学的研究具有重要意义。     

汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后最高.     

中国湖南株丁型肝炎病毒cDNA（443－870）片段的克隆和序列分析

取１例湖南丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ阳性血清，经强变性剂法抽提ＨＤＶＲＮＡ，逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，扩增的ＨＤＶＣＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１８质粒中，获得了中国湖南株ＨＤＶＣＤＮＡ（４３３－８７０）片段克隆，ＤＮＡ测序结果显示，该片段（４３８ｈｐ长，包括一端ＰＣＲ引物２５ｈｐ）与已知的美国、意大利、法国、诺鲁和中国台湾５株ＨＤＶｃＤＮＡ相同片段比较，同源性分别为９１．３％，９４．５％，９１．３％，８４．５％和８９．３％，其中与ＨＤＶＲＮＡ复制密切相关的第一个高度保守区与美国株、意大利株和法国株完全同源。     

戊型肝炎病毒中国株结构区ORF2 cDNA的克隆及表达

将戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）中国株结构区第二开放读码框架（ＯＲＦ２）８３７ｂｐ ｃＤＮＡ片段插入ｐＧＥＸ１λＴ质粒中进行表达。经免疫吸印法证明，该质粒表达的融合蛋白具有识别抗－ＨＥＶ的抗原表位，可用于制备抗－ＨＥＶ检测试剂。     

汉滩病毒Z10株G1糖蛋白编码区克隆及序列分析

目的 汉滩病毒浙１０（Ｚ１０）株Ｇ１糖蛋白编码区的克隆、核苷酸序列分析，提供我国应用最为广泛的肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）疫苗株序列资料。方法 反转录ＰＣＲ法扩增Ｇ１基因片段，克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，双脱氧链终止法测定核苷酸序列。结果 测定１４４９个核苷酸，可编码４８３个氨基酸。与Ｉ型７６／１１８、Ｌｅｅ、Ｈｏｊｏ株比较核苷酸同源性分别为８７％、８６％、８６％，与Ⅱ型Ｒ２２株同源性为６７％。比较氨基     

肾综合征出血热病毒76－118株的反转录及聚合酶链反应扩增、鉴定的初步研究

用反转录和聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增了肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）７６－１１８株ＭＲＮＡ３＇－端２３７ｂｐ基因片段。制备了长臂光敏氨基已酸生物素标记的２３７ｂｐ探针。经琼脂糖电泳和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹，生物素－亲和素系统杂交和显色，对２３７ｂｐ扩增产物进行了特异性和灵敏性鉴定。ＰＣＲ技术与反转录技术相结合可用来对一些ＲＮＡ病毒进行研究和诊断，并能快速制备出质量较好的标记探针。     

Molecular Cloning of Coat Protein Gene of an Indian Cotton Leaf Curl Virus (CLCuV-HS2) Isolate and its Phylogenetic Relationship with others Members of Geminiviridae

Cotton leaf curl geminivirus is a whitefly (Bemisia tabaci Genn.) transmitted Begomovirus (Family Geminiviridae) causing a serious disease of cotton in northern India. The very typical symptoms of present isolate (CLCuV-HS2) showed thickened veins, dark green discoloration of the leaves with upward curling and leaf like structure known as enation (one in number), which develops into cup-shaped on the reverse side of leaves. The polymerase chain reaction (PCR) based technique can detect the viral DNA in samples stored upto 3 days after the collection and have wide application for the field diagnosis. The complete nucleotide sequence of the Indian isolate of cotton leaf curl geminivirus (CLCuV-HS2) coat protein (CP) gene component was determined using CP specific primers through PCR amplification from field infected cotton plants growing in Haryana, India. Comparison of the amino acid sequence of the putative CP with some other mono and bipartite geminiviruses revealed a maximum of 97.3% identity with Pakistan cotton leaf curl virus (CLCuV-62). A nuclear localization signal located close to the N-terminal of CP gene was determined.     

汉滩病毒M片段噬菌体表位文库的构建及筛选

目的 通过构建汉滩病毒M片段的噬菌体展示文库，筛选汉滩病毒包膜蛋白的抗原表位。方法 DNaseⅠ随机消化的M片段与载体pComb3连接，转化宿主XL-1Blue，在辅助噬菌体VCSM13存在的条件下，获得M片段的随机噬菌体文库.利用纯化的恢复期病人血清对M片段噬菌体文库进行3轮淘洗，通过ELISA、序列分析对所获得的克隆进行鉴定。并对其中2个阳性克隆的目的片段进行了原核表达和免疫原性分析。结果 筛选获得的5个阳性噬菌体克隆均位于G1蛋白编码区，原核表达的2个阳性：充隆片段蛋白免疫兔，免疫兔血清能与病毒抗原发生特异反应。结论 本技术路线可用于汉滩病毒包膜蛋白抗原表位的研究，为汉滩病毒诊断试剂的研制、亚单位疫苗的设计提供了数据。     

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:从小鼠肝脏组织克隆canstatin cDNA并在大肠杆菌(E.coli)中表达, 为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法: 用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin(m canstatin)的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin cDNA 定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中, 在大肠杆菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达。结果:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin的cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中表达。结论: 首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA, 其原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。