鸡干扰素基因的分子克隆与序列测定

目的：从接种新城疫Ｆ４８Ｅ９病毒的Ｌａ Ｓｏｔａ疫苗免疫鸡体外有丝分裂原刺激的脾淋巴细胞中克隆鸡干扰素基因。方法：应用逆转录多聚酶链式反应技术扩增,常规平端连接、转化及序列测定技术进行验证。结果：研究表明克隆得到的基因与国外报道的鸡胚成纤维细胞干扰素基因。结论：鸡在该状态下其脾淋巴细胞表达鸡胚成纤维细胞干扰素ｍＲＮＡ。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型SM44株胸苷激酶基因的克隆及序列测定

为了分离、克隆单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）ＳＭ４４株胸苷激酶基因（ＴＫ）,采用原代兔婴肾细胞培养ＨＳＶ－Ｉ ＳＭ４４株病毒,提取病毒核酸作为模板,设计了ＨＳＶ－１ ＴＫ基因的上、下游引物,在引物的５‘端分别引入ＢａｍＨ１和ＥｃｏＲ１限制性内切酶位点,通过ＰＣＲ方法扩增出ＴＫ基因,经ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ １双酶切与ＰＵＣ１９质粒载体相连接,构建重组体转化受体菌ＪＭ１０９,通过筛选和酶切鉴定,获得     

人白细胞介素17基因的克隆及序列测定

应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，参照国外发表的白细胞介素１７（ｈＩＬ－１７）ｃＤＮＡ全基因序列，利用自行设计合成的１对引物，从ＰＨＡ活化的正常人外周血单个核细胞中，扩增出ｈＩＬ＿１７ｃＤＮＡ基因，并定向插入ＰＵＣ１８载体，构建了ｈＩＬ－１７基因重组体，经ＤＮＡ序列测定，确认为ｈＩＬ－１７基因，这为是一步研究ｈＩＬ－１７的生物学功能提供可靠的物质基础。     

一种新的TTV基因群全基因序列测定及基因结构分析

目的 测定2株TTV高度变异株全基因序列，对其基因结构、基因分型及分子流行病学分析。方法 从2名感染TTV高度变异株的婴儿血清中抽提其．DNA，用long inverted PCR扩增出全基因组并测定其序列，同时对测序结果进行分析。根据测定的序列设计引物，对人群中此类变异株的感染情况进行研究。结果 首次报道了TTV-个新基因群——第5基因群；测定了该基因群中2株变异株的全基因序列。该基因群在小于30日龄、1—6月龄、7—12月龄的婴儿中检出率分别为0、27．3%、39．5％，献血员中检出率为45．8％。结论 虽然第5基因群基因组核酸序列呈高度异质性，但其基本结构及功能与已报道的TTV各基因群十分相似；婴儿中该基因群的感染主要与环境因素有关。     

北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定

目的 克隆和测定北京地区ＴＴ病毒（ＴＴＶ）分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从１例临床非甲￣庚型肝炎病人血清中分段扩增ＴＴＶ全基因,获得５个互相重叠的片段,分别长１９９ｂｐ（１－１９９）,１２６７ｂｐ（９０－１３５６,８７８ｂｐ（１３５４－２２３１,１１２９ｂｐ（２１７８－３３０６,４３４ｂｐ（３３０６－３７３９）,用标准的分子生物学方法测定了这５个序列,从而得到全长ＴＴＶ基因     

肝癌单抗重链可变区基因的克隆及序列测定

从分泌与肝细胞肝癌特异性强并具有良好人体内导向作用的鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＡｂ２５中提取ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，用合成的寡核甘酸引物从中扩增出抗体重链可变区基因。将此基因克隆到ｐＵＣ１９质粒中，测定了此可变区基因的全序列。经计算机分析，结果表明基因长度为３６０ｂｐ，编码１２０个氨基酸，是具有功能性的抗体可变区基因，在核苷酸序列上与小鼠重链ＶＨ１８６．２家族同源性最高，属免疫球蛋白重链可变区基因９个家族中的第三族     

幽门螺杆菌ureB基因的克隆及序列分析

目的 对幽门螺杆菌（Hp)ureB核苷酸序列及推定氨基酸序列进行同源性比较分析,确定Hp菌株的ureB基因差异性,为疫苗的研究和诊断用品的评价提供依据。方法 自选设计引物,PCR扩增来自国内不同病人的4株Hp菌株的ureB基因,与pGEM-T载体克隆连接、测序;进一步同GenBank上发表的其他4株国外Hp菌株ureB的全基因序列进行比较分析。结果 8株Hp菌株的ureB基因序列出现了33种长度,CAPMF3和CPM630分别为1269bp和1680bp,其他为1710bp。6株1710bp的ureB基因序列的分析表明,国外3株Hp的ureB同源性较高,三者氨基酸的同源性达到100％。国内3株Hp的ureB变异较大,推定氨基酸同源性为98．7％－98．9％。结论 UreB作为保护性同时存在免疫保护覆盖率问题,研究疫苗和诊断用品时要注意选择使用在人群中流行占优势的Hp菌株的高度保守的UreB抗原肽,使其具有更高的覆盖率。     

单纯疱疹病毒I型SM44株胸苷激酶基因的克隆及序列测定

为了分离、克隆单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－Ｉ） ＳＭ_(４４)株胸苷激酶基因（ＴＫ），采用原代兔婴肾细胞培养ＨＳＶ－ＩＳＭ_(４４) 株病毒，提取病毒核酸作为模板，设计了 ＨＳＶ－ＩＴＫ基因的上、下游引物，在引物的 ５’端分别引入 ＢａｍＨＩ和 ＥｃｏＲ Ｉ 限制性内切酶位点，通过ＰＣＲ方法扩增出 ＴＫ基因，经ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双酶切与 ＰＵＣ１９质粒载体相连接，构建重组 体转化受体菌ＪＭ１０９，通过筛选和酶切鉴定，获得ＨＳＶ－ＩＳＭ_(４４) ＴＫ基因阳性克隆，行全序列测定分析，与ＨＳＶ－ＩＣＬ１０１ 株 ＴＫ基因同源性为 ９９．０２％，存在 １１个核苷酸和 ７个氨基酸的差异。 ＨＳＶ－ＩＴＫ基因的克隆成功，为该基因应用于恶 性肿瘤的自杀基因治疗奠定了基础。     

大肠杆菌突变的thyA基因的克隆及序列分析

目的 研究ｔｈｙＡ基因天然缺陷菌株ｔｈｙＡ＊基因的改变。方法 用ＰＣＲ插入法将ｔｈｙＡ＊基因克隆到ｐＵＣ１８上,进行序列测定及分析。结果 突变的ｔｈｙＡ基因其第１３１位碱基Ｔ突变为碱基Ａ。结论 ｔｈｙＡ基因缺陷的大肠杆菌的ｔｈｙＡ基因第１３１位碱基Ｔ突变为碱基Ａ,是导致该基因功能丧失的直接原因。     

人CD23基因的亚克隆与部分序列测定

已构建的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因克隆ｐＢＣＤ９７６，以ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切，回收ＣＤ２３全基因，定向插入ｐＵＣ１８载体，构建ｐＵＣ１８－ＣＤ２３全基因重组体（ｐＵＣｄ９７６）。进一步利用该基因中第３９９位的ＨｉｎｄⅡ酶切点，在ｐＵ１８中构建了ＣＤ２３Ｎ端４０３ｂｐ和Ｃ端６０７ｂｐ的二个亚克隆，分别称为ｐＵＣＤ４０３Ｎ和ｐＵＣＤ６０７Ｃ。并对ｐＵＣＤ６０７Ｃ进行测离，最终确认其为ＣＤ２３基因。     

致肾盂肾炎大肠杆菌papA基因的克隆及序列分析

目的 对致肾盂肾炎大肠杆菌（ＵＰＥＣ）１３２株的ｐａｐＡ基因进行克隆和序列分析。方法 根据Ｆ１３型ｐａｐＡ基因序列设计引物,并在二引物５′端加上限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＢａｎＨⅠ的酶切位点。采用此引物扩增１３２菌株ｐ菌毛粘附基因群的ｐａｐＡ基因,扩增产物克隆人质粒,选取阳性重组质粒进行核苷酸序列分析。结果 ＵＰＥＣ１３２株经ＰＣＲ法扩增获得约７００ｂｐ的ｐａｐＡ片段,经克隆获得阳性重组质粒ｐＣＴ２     

贵州地区不同人群TTV核酸检测及部分核苷酸序列分析

目的 了解贵州地区TTV感染状况，分析TTV贵州株的基因特点。方法 以公布的TTV第1读码区序列设计两对寡核苷酸引物，用套式聚合酶链反应法(nested—PCR)检测贵州地区不同人群血清中TTV核酸(TTV DNA)，并对3份TTV DNA阳性血清的PcR产物，用直接测序法测定核苷酸序列。结果 62例正常人，37例志愿献血员，50例血液透析患者，107例静脉药瘾者及139例肝病患者血清中TTV DNA阳性率分别为6．45％(4／62)，8．1％(3／37)，26.0％(13／50)，25.23％(27／107)和16.55％(23／139)。在肝病组中，重型肝炎、肝硬化、肝癌患者的TTV DNA阳性率分别为35.71％(5／14)，14．15％(15／106)和15．79(3／19)。测定的282个核苷酸中，3株贵州株的同源性均高于99％，与日本株N22相比，同源性都为98％。结论 贵州存在TTV感染，血透患者中有较高的TTV感染率，TTV可能是重型肝炎的病原因子，3株贵州株可能为同一基因型。     

幽门螺杆菌omp11基因的克隆及序列分析

目的　对幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL Hp2 7和NCTC116 37株外膜蛋白基因 (omp11)进行克隆和测序 ;确定不同Hp菌株omp11基因序列的变异性 ,并对该基因编码多肽的化学及免疫学特性进行预测 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的筛选提供数据。方法　提取Hp染色体DNA ,用自行设计的PCR引物 ,从染色体DNA上扩增出omp11基因 ,将其克隆到载体pNEB193中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliJM10 9)。对重组质粒进行酶切鉴定 ,对插入的omp11基因片段进行测序 ,应用生物信息学软件Omiga2 .0、GeneDoc2 .3和GenBank、Swiss port数据库对 4个Hp菌株 (MEL Hp2 7、NCTC116 37、2 6 6 95、J99)的omp11基因序列进行同源性分析 ,并对该基因编码多肽的主要化学特征和抗原结构域进行预测。结果　MEL Hp2 7和NCTC116 37株omp11基因的核苷酸序列长度均为5 6 1bp ,不同菌株间核苷酸序列的同源性为 96 .6 %～ 98.0 % ,与国内的MEL Hp2 7株同源性最高的菌株是NCTC116 37,二者的同源性为 97.9%。 4株Hpomp11基因编码的氨基酸序列长度均为 186aa ,不同菌株间氨基酸序列的同源性为 98.9%～ 10 0 % ,与MEL Hp2 7株同源性最高的菌株是 2 6 6 95 ,二者的同源性为 99.5 %。预测HpMEL Hp2 7omp11基因编码多肽的相对分子质量 (Mr)     

藏猪白细胞介素4基因Cdna的克隆及序列分析

目的：克隆藏猪白细胞介素4基因cDNA。方法：从体外ConA刺激70小时的藏猪外周血淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR技术扩增，pMD-T载体连接，常规转化后，进行酶切及序列测定进行鉴定。结果：研究表明克隆得到的IL-4基因cDNA与成华猪的IL-4同源性达到99％，与长白杂交猪的同源率为98％。结论：从藏猪外周血淋巴细胞中成功地分离到IL-4基因。     

人白细胞介素10（hIL—10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因，这将为今后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。     

日本立克次体ompB蛋白基因的克隆及序列分析

参照立氏立克次体分子量为１２×１０４蛋白基因序列合成引物，分两段扩增日本立克次体的１２×１０~４蛋白基因，扩增ＤＮＡ的长度分别为２．５和２．６ｋｂ。含有启动子区的２．６ｋｂ片段在ｐＵＣ１９质粒中不稳定。从这段ＤＮＡ删去启动子及８５个氨基酸编码子区的扩增产物可被克隆。以这一重组质粒为载体克隆含终止密码子的２．５ｋｂ片段。序列分析表明开放阅读框架由４９５６核苷酸对组成，编码１６５２个氨基酸。日本立克次体与立氏立克次体ｏｍｐＢ基因的遗传同源性是９５．５％，表明分子量１２×１０~４可能被用于制备抗斑点热立克次体感染的亚单位疫苗。     

鸡贫血病毒VP2基因的克隆、序列分析及表达

目的：为探讨鸡贫血病毒的分子生物学特征。方法：采用ＰＣＲ方法获得允许贫血病毒的ＶＰ２基因,采用平端连接将其克隆到ＰＵＣ１１９载体上进行测序,采用粘端连接将其亚克隆到ＰＥＴ载体上并进行原核表达。结果：发现ＣＡＶ－ＳＪ１株的ＶＰ２基因共有６５１个碱基,同围外ＴＫ５８０３,２６Ｐ４,Ｃｕｓ－１、８２０２毒株的ＶＰ２基因相比分别有６、７、８、７个碱基的差别,其中３个是ＳＪ１株特有的碱基变化。由基因序列推导     

小鼠PGRP-L编码区基因的克隆及序列分析

目的：获得小鼠长型肽聚糖识别蛋白（mPGRP—L）全长编码区基因。方法：采用RT—PCR技术，从BALB／c鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L编码区基因片段，将其插入pUCm-T载体，以PCR和测序进行鉴定。结果：从BALB／c小鼠肝脏cDNA中，分别以Primer—F和Primer—R1、Primer—F1和Primer—R为引物对进行PCR，扩增得到约1050bp的上游基因片段和约540bp的下游基因片段。以纯化的上、下游片段为模板，Primer—F和Primer—R为引物进行PCR，扩增获得约16aHDbp的DNA片段，并将其克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-mPGRP-L。鉴定结果表明，mPGRP—L编码区基因全长1593bp，与GenBank中mPGRP—LcDNA比较仅2个位置的核苷酸不同，两者的同源性为99．87％。结论：成功地克隆了mPGRP—L的cDNA，为mPGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

TTV在肝炎患者中的检测及临床意义探讨

目的研究新近报道与丙氨酸转氨酶异常相关的ＴＴＶ在已知和未知病毒性肝炎中的临床意义。方法设计ＴＴＶ部分基因的特异性引物，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了１０４例病毒性肝炎的ＴＴＶＤＮＡ，并对１例ＴＴＶ阳性标本克隆测序。结果ＴＴＶＤＮＡ序列与日本ＴＴＶ部分基因序列相对应位置的核苷酸同源性为９８．４％。在１０４例肝炎患者中ＴＴＶＤＮＡ阳性检出率为２４．０％（２５／１０４），其中在非甲～戊和庚型肝炎患者中为４８．０％（１２／４２），在甲型肝炎中为１９．０％（４／２１），乙型肝炎为２５．０％（８／３２），丙型肝炎为１１．１％（１／９），９例ＨＧＶＲＮＡ阳性者中未检出ＴＴＶＤＮＡ。值得注意的是重型肝炎ＴＴＶ检出率极高，其中急性重型肝炎６例中阳性为４例（６６．７％），慢性重型肝炎６例中阳性为３例（５０．０％）。结论ＴＴＶ在我国肝炎病人中存在。在重型肝炎中有较高的发生率，可能是未知病毒致急性和慢性及重型肝炎的病因之一。     

人白细胞介素10（hIL－10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈｌＬ－１０ｃＤＮＡ基困，这将为令后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。