猪胰酶、胰岛素与胰蛋白酶抑制剂的联产

目的 以猪胰浆为原料,联产胰酶、胰岛素(INS)与胰蛋白酶抑制剂(TI).方法 猪胰浆用中性醇处理,得到胰渣和上清液(Ⅰ);胰渣经过聚乙二醇-6000沉淀得到胰酶;Ⅰ用酸沉淀去掉杂质后再沉淀得到INS粗品和上清液(Ⅱ);INS粗品经DE-AE-Sepharose FF层析纯化;Ⅱ经Trypsin一壳聚糖多孔珠亲和吸附得到TI.结果 胰酶的回收率为15.1%4±0.6%,主要成分胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的含量分别为(5.13±0.17)×103、(38.47±1.16)×103、(58.27±2.49)×103U·g-1;INS的回收率为73.7±9.0 mg·kg-1(n=3),效价为27.25±0.34U·mg-1,并具有完整的生物学活性;TI比活为102.59 U·mg,-1,产率为33.86 U·g-1.结论 胰酶、INS与TI的联产极大地提高了胰脏的利用率.     

用RP—HPLC法对基因工程人胰岛素纯度的评价

用国际（ＥＰ，ＩＰ，ＵＳＰ）＾（１）推荐的ＲＰ－ＨＰＬＣ法，在美国ＶｙｄａｃＰｒｏｔｅｉｎｏｒＰｅｐｔｉｄｅＣ１８柱上进行胰岛素的纯度试验，解决了动物实验无法控制样品的纯度问题，该方法获得了良好的精密度，选择性和分离效果，同时，与国产普通Ｃ１８柱进行了对比实验。     

从生产胰岛素的胰渣中制备胰酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶

目的 从中性乙醇提取胰岛素后的残渣中提取制备高活性的胰酶,并从中分离纯化出胰蛋白酶(T)、糜蛋白酶(CT).方法 在胰渣中加入活化剂活化后,用PEG-6000沉淀、丙酮脱脂干燥得到胰酶;胰酶经CM-纤维素纯化得到胰糜蛋白酶混合制剂,再经CM-sepharose FF层析分离得胰蛋白酶和糜蛋白酶.结果 胰酶回收率为12.1％,胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的活性分别为5.40、39.72、76.72 U·mg-1,3种酶的活性比例达1∶7.4∶14.2.胰蛋白酶、糜蛋白酶的效价分别为2505、1003 U·mg-1;相对于胰酶,二者的活性回收分别为48.93％、61.73％.结论 从胰渣中制得的胰酶活性较高(约9倍于《中国药典》2010年版中的标准);制得的T及CT的活力也达到《中国药典》2010年版中的标准.     

重组人胰岛素pET28a-IHI下游工艺研究

目的对含有重组人胰岛素原基因的大肠杆菌工程菌pET28a-I HI摇瓶发酵,并探讨采用磺酸化方法对包涵体蛋白纯化复性的工艺。方法工程菌pET28a-I HI经摇瓶发酵、机械破碎得到包涵体,包涵体经过磺酸化、等电点沉淀、DEAE-52柱层析三步纯化后采用15%SDS-PAGE电泳检测,经过复性,酶切,DEAE-52纯化后,冷冻干燥,样品进行HPLC检测以及整体生物学活性实验。结果工程菌表达量约在30%左右,经过三步纯化,包涵体纯度可达98%以上,酶切之后经质谱检测,与人胰岛素标准品相对分子质量一致,而且动物实验降血糖效果明显,1 L发酵液最终可得到人胰岛素140mg。结论该工艺耗时短,效果好,成本较低。     

甘精胰岛素和人胰岛素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖作用

目的探讨甘精胰岛素(insulin glargine)和人胰岛素(human insulin)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响及细胞外信号调节激酶(ERK)的调节作用。方法使用不同浓度的甘精胰岛素和人胰岛素刺激人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,检测不同时间段的细胞增殖作用,探讨抑制ERK1/2激活对细胞增殖的影响。使用cell counting kit-8(CCK-8)试剂检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布。结果甘精胰岛素和人胰岛素在1、10、100IU.L-1刺激MDA-MB-231细胞96h后均可轻度促进MDA-MB-231细胞增殖,相同条件下甘精胰岛素和人胰岛素的促增殖效应无差异。甘精胰岛素与人胰岛素以10IU.L-1分别刺激48、72、96h后两药均诱导细胞增殖,比较两种药物间增殖效应的差异无统计学意义。甘精胰岛素和人胰岛素均使S+G2/M期细胞比例增加,但两处理组间差异无显著性。ERK1/2抑制剂PD98059可抑制MDA-MB-231细胞增殖;但PD98059不影响甘精胰岛素和人胰岛素对MDA-MB-231细胞增殖的促进作用。结论甘精胰岛素和人胰岛素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖有类似的轻度促进作用,该作用不依赖于ERK的激活。     

不饱和脂肪酸修饰胰岛素的降糖活性及抗酶解作用

目的考察不饱和脂肪酸修饰胰岛素的降糖活性及抗酶解作用。方法小鼠皮下注射给药,测定不饱和脂肪酸修饰胰岛素引起的血糖变化,并与硬脂酰胰岛素及猪胰岛素对照;同样方法测定供试品体外酶解后的降糖效果。结果修饰胰岛素均保持降血糖活性,给药3h后不饱和脂肪酸修饰胰岛素仍有降糖作用,而未修饰胰岛素已完全被清除;亚油酰胰岛素酶解10h后仍保持约4 0 %的降糖活性。结论亚油酰胰岛素体内清除慢,抗胰蛋白酶降解作用强     

人胰岛素的酶促聚乙二醇修饰

为开发一种新的胰岛素聚乙二醇修饰方法,以人胰岛素为原料,用羧肽酶A切掉其B链C末端的苏氨酸残基,得到去掉B30的胰岛素(des-B30-insulin),然后在有机相中,使用胰蛋白酶做催化剂,将一个连有聚乙二醇链的苏氨酸衍生物链接到des-B30-insulin上,得到一种新的聚乙二醇-胰岛素轭合物。该方法的特点是聚乙二醇通过酶促反应被定位连接在人胰岛素的B链C末端氨基酸上,形成了一种新型的聚乙二醇-胰岛素轭合物。生物活性的测定表明该轭合物具有极好的胰岛素活性保留,并具有潜在的长效功能。     

重组牛胰蛋白酶抑制剂对小鼠急性肝损伤的保护作用

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法小鼠60只随机分成6组:正常对照组、模型组、rBPTI的3个剂量组(分别为3、6、12×104kIU·kg-1)、抑肽酶组(6×104kIU·kg-1)。每天腹腔注射给药,7d后体外注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型。末次给药后眼眶取血测定小鼠血清ALT、AST活性,观察肝脏组织病理改变。结果各剂量rBPTI可不同程度降低小鼠血清ALT、AST活性,降低肝组织MDA含量,与模型组比较差异有统计学意义(P<0·05、P<0·01),同时不同程度减轻肝组织病理损伤。结论rBPTI对体外CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,作用效果同天然BPTI相当。     

重组人白细胞介素-11的胰蛋白酶切肽图分析

目的　建立标准肽图分析法,用于rhIL-11的质量控制。方法　应用Alliance HPLC系统及其温控自动进样器探索最佳胰蛋白酶切和色谱条件。结果　连续3批rhIL-11样品的RP-HPLC图谱完全一致,与rhIL-11对照品比较,有20个峰与对照品吻合,但第6峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第9和第10峰之间多一个峰,说明rhIL-11样品蛋白质结构与对照品比较存在细小差别。这种差别经多肽片段分离和氨基酸序列测定证明是由于样品N端多2个氨基酸引起的。结论　本法精确度高、重复性好、自动化程度高,可用于rhIL-11的质量控制。     

人尿胰蛋白酶抑制剂与激肽释放酶联产及纯化的研究

本文探讨了采用Polyerde-3吸附剂,从男性尿中提取HUTI-HUKN粗品,再依次经抑肽酶-琼脂糖4B亲和层析、胰蛋白酶-琼脂糖4B亲和层析,将HUTI和HUKN分离并纯化。每20升尿液得精品HUTI50mg,比活1,250u/mg;HUKN3mg,比活666u/mg。活性回收率分别为41％和50％。     

Protection of insulin from enzymatic degradation by its association to liposomes

The degradative action of digestive enzymes (pepsin, α-chymotrypsin and trypsin) was investigated against insulin associated or entrapped in positively charged liposomes. Under the chosen experimental conditions, both insulin preparations were protected against enzymatic degradation. Furthermore, the nature of the interaction between external phospholipidic bilayer and insulin was found to result from an ionic association. Finally, the protective role of liposomes appeared highly dependent upon the molar proportion phospholipid/hormone.     

化学修饰胰岛素降血糖作用及抗胰蛋白酶降解能力的研究

目的评价化学修饰胰岛素的降血糖作用及抗胰蛋白酶降解的能力。方法将修饰胰岛素和胰岛素经小鼠皮下注射 ,用血糖仪测定它们的降血糖作用 ,比较它们抗胰蛋白酶降解的能力。结果修饰胰岛素和胰岛素有相似的降血糖作用 ,但修饰胰岛素抗胰蛋白酶降解的能力比胰岛素有明显的改善 ,降解的时间延长了 4h。结论修饰胰岛素具有较好的降血糖作用 ,并具有一定的抗胰蛋白酶降解能力     

酪蛋白和鱼精蛋白对胰岛素酶降解和口服降血糖作用的影响

目的研究酪蛋白和鱼精蛋白对酶降解胰岛素(INS)的保护作用及对大鼠灌胃给予INS溶液和微球后降血糖作用的影响。方法采用HPLC法测定α-糜蛋白酶和胰蛋白酶溶液中INS的残余量,考察酪蛋白和鱼精蛋白对体外酶降解INS的保护作用；制备INS溶液及肠溶微球,在促吸剂n-［8-(2-羟基苯甲酰基)氨基］辛酸钠(SNAC)存在下,大鼠灌胃给药研究酪蛋白和鱼精蛋白单独及合并使用对INS溶液和微球降血糖作用的影响。结果酪蛋白对α-糜蛋白酶体外降解INS有较好的抑制作用,鱼精蛋白不能抑制α-糜蛋白酶对INS的降解,但对胰蛋白酶降解INS的抑制作用优于酪蛋白。鱼精蛋白和酪蛋白均可增加INS溶液和肠溶微球的降血糖作用,两者合用效果更佳。在SNAC、鱼精蛋白和酪蛋白存在下,INS肠溶微球比INS溶液有更强而持久的降血糖作用。结论酪蛋白和鱼精蛋白可通过竞争性与酶结合机制增加INS在肠道消化酶中的稳定性,对INS口服吸收有利。     

Comparative effect of human soluble insulin and insulin aspart upon hypoglycaemia-induced alterations in cardiac repolarization

AIMS: Sudden death in young diabetic patients has been associated with nocturnal hypoglycaemia perhaps as a result of cardiac dysrhythmias following abnormal cardiac repolarization during hypoglycaemia. It was therefore important to compare the effect of soluble human insulin (HI) and a rapid-acting insulin analogue, insulin aspart (IAsp), on these aspects of cardiac function. METHODS: A total of 17 healthy males underwent identical hyperinsulinaemic hypoglycaemic clamps with blood glucose maintained at 5 mm for 30 min and reduced to 2.5 mm after an additional 30 min. Subjects received either HI or IAsp on two different occasions separated by 4-6 weeks. Regular measurements were made of two measures of cardiac repolarization, QT dispersion and QTc as well as of counter-regulatory hormones. RESULTS: The blood glucose lowering effect did not differ between IAsp and HI and the clearance rates were similar (HI mean +/- SD 1.24 +/- 0.12 l h(-1) kg(-1), IAsp mean +/- s.d. 1.22 +/- 0.32 l h(-1) kg(-1)). There were similar significant increases but no difference between treatments in QTc after hypoglycaemia induced by either IAsp or HI (480 +/- 37 ms vs 480 +/- 25 ms; NS). However, QT dispersion during hypoglycaemia was less pronounced with IAsp than with HI (92 +/- 36 ms vs 107 +/- 42 ms; P < 0.05). Plasma adrenaline increased significantly and similarly after both insulins (initial and final concentration, HI, 0.23 +/- 0.01 to 4.87 +/- 0.48 nm, P < 0.001, IAsp, 0.24 +/- 0.01 to 4.99 +/- 0.48 nm, P < 0.001). Serum potassium decreased significantly but by a similar amount between the groups (initial and final concentration, HI, 4.18 +/- 0.3 to 4.2 +/- 0.2 mm, P < 0.001, IAsp, 4.2 +/- 0.3 to 4.2 +/- 0.3 mm, P < 0.001). CONCLUSIONS: Soluble human insulin and insulin aspart had similar effects upon hypoglycaemia-induced alterations in cardiac repolarization, presumably because the effects of both regular insulin and insulin aspart on the sympathoadrenal response and potassium concentration were the same.     

猪胰岛素与重组人胰岛素的高效液相色谱分析

目的鉴别猪胰岛素与重组人胰岛素。方法采用C8、C1 8及常规孔径 (6～ 1 0nm)与大孔径 (30nm)色谱柱用梯度洗脱和等度洗脱对猪胰岛素与重组人胰岛素的分离方法进行研究。结果用梯度洗脱代替英国药典中的洗脱体系能达到相同的分离效果。结论用常规C1 8柱通过梯度洗脱可分离猪胰岛素与重组人胰岛素     

重组胰岛素样生长因子-Ⅰ基因工程菌的发酵研究

目的探讨胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )基因工程菌的摇瓶及发酵罐培养的一些发酵参数、诱导阶段的补料基质及诱导剂浓度对IGF Ⅰ表达的影响。方法通过摇瓶培养和分批及补料分批发酵培养进行研究。结果在摇床转速为 15 0、2 0 0、2 5 0r min条件下测得以葡萄糖为基准的Y△x △s分别为 0 .2 0 3、0 .2 7、0 .33。干细胞产量分别为 0 .5 4、0 .76 5、1.0 5 4g L。平均生长速率分别为 0 .0 34、0 .0 4 8、0 .0 6 6g (L·h)。细胞对数生长期分别为 6、7.5、10h。发酵罐上生物量由分批发酵的 18(A6 0 0nm)提高到补料分批发酵的 35 (A6 0 0nm) ,表达量占细胞可溶性总蛋白质的10 %。结论后期供纯氧与补料能延长对数生长期 ,提高乳糖浓度和诱导前用甘油作碳源有利于IGF Ⅰ表达     

重组酶在胰岛素生产中的应用

本文分别测定了重组的与天然的牛胰蛋白酶和羧肽酶B对前胰岛素融合蛋白的裂解活性。水解产物采用HPLC进行分析,发现重组酶具有更强的活性并且副产物少,因此重组酶在胰岛素生产中比天然的牛胰蛋白酶和羧肽酶B具有更好的前景。     

重组甘精胰岛素与低精蛋白胰岛素联合格列美脲治疗2型糖尿病的疗效观察

目的观察重组甘精胰岛素（长秀霖）与低精蛋白胰岛素（诺和灵30R）联合格列美脲治疗2型糖尿病的有效性和安全性。方法将60例糖尿病患者随机分为长秀霖组和诺和灵30R组,每组30例。长秀霖组每天晚上18∶00点注射长秀霖,诺和灵30R组每天早、晚餐前2次皮下注射诺和灵30R,2组每天早餐前30mim均口服格列美脲3mg。观察2组患者空腹血糖（FPG）、平均餐后2h血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1C）、C肽水平及低血糖事件的发生率。结果 2组治疗后FPG、2hPG、HbA1C水平均有明显下降（P〈0.05）,但2组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）;且长秀霖组治疗后C肽升高（P〈0.05）,且于高于诺和灵30R组C肽水平（P〈0.05）。长秀霖组低血糖事件发生率为6.7%低于诺和灵30R组的23.3%（P〈0.05）。结论该2种治疗方法的疗效大致相同,但长秀霖联合格列美脲治疗2型糖尿病低血糖事件发生率低,并有可能改善β细胞功能,故更具有选择优势。     

门冬胰岛素与人正规胰岛素对不规律进食老年2型糖尿病患者血糖影响的研究

目的：研究门冬胰岛素与人正规胰岛素对不规律进食老年2型糖尿病患者血糖的影响。方法：2006年2月至2007年4月老年2型糖尿病患者共33例[男性18例，女性15例，平均年龄（65．82±2．85）岁]被纳入研究，先后用方案A和方案B治疗，各4个月。方案A：三餐前30min皮下注射人正规胰岛素＋睡前皮下注射人低精蛋白锌胰岛素；方案B：三餐后10～15min皮下注射门冬胰岛素＋睡前皮下注射人低精蛋白锌胰岛素。每周检测2次空腹血糖（FBG）和早、午、晚餐后2h血糖；并对患者低血糖发生次数及其严重程度、糖化血红蛋白（HbA1c）变化进行对比观察。结果：患者的FBG和早、午、晚餐后2h血糖，在方案A治疗期间分别为（7．37±4．22）mmol／L、（9．73±3．38）mmol／L、（10．23±3．96）mmol／L和（10．85±3．36）mmol／L，在方案B治疗期间分别为（7．01±1．74）mmol／L、（9．23±1．58）mmol／L、（9．22±1．28）mmol／L和（9．76±1．32）mmol／L，差异有统计学意义（均P〈0．01）；方案B较方案A的餐后血糖波动幅度明显降低；治疗前后HbA1c的差值在方案A、B分别为（3．08±0．96）％和（3．37±0．47）％（P〈0．01）；低血糖发生次数及中重度低血糖发生率，在方案A治疗中分别为68例次及36．7％，在方案B治疗中分别为21例次及19．05％，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：门冬胰岛素餐后皮下注射可有效降低老年2型糖尿病患者的血糖，减小餐后血糖波动幅度，减少低血糖的发作次数并降低其严重程度，对不规律进食的老年糖尿病患者安全有效。