紫杉醇联合5-Aza-dC对非小细胞肺癌细胞NCI-H446生长抑制作用的研究

目的探讨紫杉醇（PAC）联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-d C）对非小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖迁徙及侵袭能力的影响。方法将人小细胞肺癌细胞NCI-H446给予紫杉醇及5-Aza-d C干预处理,根据药物干预方式的不同分为对照组、紫杉醇组及联合用药组;应用CCK-8法检测各组NCI-H446细胞增殖能力的差异;划痕实验和Transwell实验检测各组NCI-H446细胞迁移和侵袭能力的差异。结果 CCK-8结果显示PAC及5-Aza-d C均可抑制NCI-H446细胞的增殖活性,且呈时间依赖性。48 h后紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的增殖能力较对照组明显减弱（P〈0.01）;划痕实验结果显示划痕形成24 h后,对照组划痕愈合率为（69.15±0.837）%。而在紫杉醇组划痕处愈合率为（47.30±0.783）%;联合用药组划痕愈合率为（43.45±0.862）%。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞在迁移能力方面较对照组差异有统计学意义（P〈0.01）;Transwell实验结果显示对照组NCI-H446细胞转染穿过基质胶的细胞数量为（151.4±6.88）个,紫杉醇组为（66.8±5.17）个,联合用药组为（40.2±4.55）个。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的侵袭能力较对照组差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 5-Aza-d C作为化疗增敏剂可增加非小细胞肺癌细胞NCI-H446对紫杉醇的敏感性,从而提高紫杉醇对非小细胞肺癌的化疗效果。     

miR-424对非小细胞肺癌细胞株A549迁移及侵袭的影响

目的探讨miR-424对非小细胞肺癌细胞株A549迁移及侵袭的影响。方法 RT-PCR法检测肺癌细胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157及人胚肺成纤维细胞MRC-5中miR-424表达,脂质体LipofectamineTM2000将miR-424 inhibitor和miR-424 NC转入A549细胞中,48 h后,RT-PCR法检测miR-424表达,CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、转化生长因子-β1(TGF-β1)及p-Smad3的表达。结果 miR-424在肺癌细胞NCIH460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中的[(1.78±0.13),(1.69±0.10),(1.89±0.18),(2.88±0.27),(2.52±0.20),(2.49±0.23)]表达量显著高于miR-424在人胚肺成纤维细胞MRC-5中的(0.58±0.05)表达量(P0.01)。与miR-424 NC组比较,miR-424 inhibitor组miR-424表达量显著降低(P0.01),细胞活力下降(P0.01),细胞迁移及侵袭能力降低(P0.01),MMP2,MMP9,TGF-β1及p-Smad3表达量均显著下调(P0.01)。结论 miR-424表达量下调后能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路进而抑制A549细胞的迁移及侵袭。     

miR-28调控非小细胞肺癌细胞增殖、迁移与侵袭的作用机制

目的 探讨微小RNA-28 (miR-28)对非小细胞肺癌细胞株细胞A549和H1299的影响及其作用机制。方法 通过转染miR-28 mimics过表达miR-28,转染miR-28 inhibitor抑制miR-28的表达,其中miR-28 NC作为对照组。通过CCK-8实验、克隆形成试验和细胞周期实验分别评估过表达miR-28、抑制miR-28对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、Transwell迁移及Boyden小室侵袭实验分别评估过表达miR-28、抑制miR-28对非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭能力的影响;通过生物信息学软件分析发现Ras相关蛋白1b (RAP1B)可能是miR-28的潜在靶基因并利用荧光素酶报告基因实验进行验证;通过RT-qPCR和Western blot方法检测过表达和抑制miR-28表达后A549和H1299细胞RAP1B的表达。结果 与miR-28 NC比较,miR-28 mimics组A549和H1299细胞的增殖速度明显减慢,迁移及侵袭能力明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-28 inhibitor组A549和H1...     

CXCL16在非小细胞肺癌细胞株A549中的表达及对其生物学行为的影响

目的探讨趋化因子配体16(CXCL16)在非小细胞肺癌细胞株A549中的表达及对其生物学行为的影响。方法采用Western blot方法检测人胚肺成纤维细胞MRC5和肺癌A427、H1299、A549细胞株中CXCL16表达水平;将shRNA(shRNA组)和shCXCL16(shCXCL16组)转染至A549细胞中,不转染任何质粒的细胞作为空白对照组,Western blot法检测各组CXCL16表达水平,MTT法检测细胞株增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭及迁移能力。结果在人胚肺成纤维细胞MRC5中,CXCL16呈低表达;在非小细胞肺癌细胞株中,CXCL16蛋白高表达于A549细胞,其次是H1299细胞,在A427细胞中呈低表达(P0.05)。选取A549细胞转染shCXCL16进行后续实验。Western blot检测显示,shCXCL16转染后,A549细胞中CXCL16的表达水平降低(P0.05);MTT实验显示,转染72、96、120 h后,shCXCL16组A549细胞OD490值明显低于shRNA组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。划痕实验显示,24 h后shCXCL16组细胞相对宽度为(0.74±0.14)μm,大于空白对照组的(0.28±0.07)μm和shRNA组的(0.31±0.08)μm,差异有统计学意义(F=125.470,P0.05);Transwell实验显示,24 h后shCXCL16组细胞迁移数量和细胞侵袭数量分别为(122.56±14.56)、(94.02±11.33)个,均明显少于空白对照组的(291.46±19.63)、(243.58±18.36)个和shRNA组的(282.70±18.44)、(239.17±16.91)个,差异有统计学意义(F=56.237、99.784,P0.05)。结论 CXCL16在A549细胞中呈上调表达,沉默CXCL16会抑制A549细胞增殖,降低A549细胞侵袭、迁移能力。     

沉默Yes相关蛋白1对人非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 研究Yes相关蛋白1(YAP1)在非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭中的作用.方法 通过慢病毒介导的小干扰RNA靶向抑制人非小细胞肺癌细胞株A549中YAP1基因的表达,采用CCK-8法、流式细胞术分别检测沉默YAP1对A549细胞增殖及凋亡周期的影响,Transwell实验观察沉默YAP1对A549细胞迁移、侵袭能力的影响.结果 沉默YAP1后,A549细胞YAP1 mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.01),CCK-8实验结果显示沉默YAP1抑制A549的增殖、增加G0/G期的细胞比例(P＜0.01),Transwell实验结果示沉默YAP1抑制A549细胞的迁移、侵袭(P＜0.01).结论 沉默YAP1基因对非小细胞肺癌细胞的恶性生物学特征具有抑制作用,YAP1可能成为肺癌治疗的潜在靶标.     

离子通道蛋白Piezo1对肺细胞癌侵袭和增殖的作用

目的 探究慢病毒介导siRNA沉默新型离子通道蛋白Piezo1对肺细胞癌侵袭和增殖的相关作用,以期为临床上非小细胞肺癌的治疗提供思路。方法 以2019年1月至2021年1月我院心胸外科收治的89例非小细胞肺癌的患者为研究对象,收集非小细胞肺癌组织和周边肺癌组织,利用免疫组织化学染色和RT-PCR检测肿瘤组织和癌旁组织中Piezo1的相对表达量。以非小细胞肺癌细胞系A549和NCI-H1299为种子细胞,根据siRNA-Piezo1的处理方案,将A549和NCI-H1299各自分成2组,即siRNA-Piezo1干扰组和对照组,siRNA-Piezo1干扰组的A549和NCI-H1299细胞均转染siRNA-Piezo1的慢病毒载体,对照组的A549和NCI-H1299细胞转染空白质粒的慢病毒载体,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率,利用Transwell试剂盒检测细胞侵袭水平。利用裸鼠构建动物模型,根据是否皮下注射siRNA-Piezo1干扰质粒将裸鼠分成对照组和siRNA-Piezo1干扰组。siRNA-Piezo1干扰组裸鼠成瘤后皮下注射siRNA-Piezo1干扰质粒,对照组皮下...     

千金子二萜醇衍生物抗非小细胞肺癌的作用及机制

目的：非小细胞肺癌占所有肺癌的85%,具有较高的发病率和病死率。非小细胞肺癌的治疗研究和新药开发迫在眉睫。本研究主要探讨千金子二萜醇衍生物的活性及其抑制非小细胞肺癌细胞生长的作用机制。方法：以千金子二萜醇为原料合成3个千金子二萜醇衍生物,采用磁共振验证结构;采用MTT法检测上述衍生物对非小细胞肺癌细胞(A549和H1299细胞)增殖活力的影响,筛选出活性最佳的化合物进行后续实验。集落形成、划痕、Transwell实验分别用于检测A549和H1299细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR(real-time RT-PCR)和蛋白质印迹法用于检测A549细胞中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、MMP2等mRNA和蛋白质的表达水平。结果：3个千金子二萜醇衍生物均呈剂量依赖性地抑制A549和H1299细胞的生长,且对正常细胞Beas-2B和16HBE细胞抑制作用较弱,具有一定的选择性杀伤作用。其中C-5苯甲酰化千金子二萜醇的活性最佳,作为后续实验的药物。与对照组相比,处理组的A549和H1299细胞克隆团明显变小且数目明显减少,相对迁移率明显降低,侵袭...     

PHF1基因在不同类型非小细胞肺癌中的表达水平及其生物学功能

目的分析人植物同源结构域指蛋白1(PHF1)基因在不同类型非小细胞肺癌中的表达水平及其生物学功能,为非小细胞肺癌诊治提供更好方案。方法采用实时荧光定量PCR检测非小细胞鳞癌/腺癌组织及鳞癌细胞株(NCI-H520)/腺癌细胞株(A549)中PHF1 mRNA表达水平。设计并构建PHF1低表达和PHF1过表达重组慢病毒载体,将其分别转染NCI-H520细胞和A549细胞,同时验证其转染效果。采用CCK8法、Transwell实验和流式细胞仪分别检测各组细胞增殖、侵袭及凋亡情况。结果与癌旁正常组织比较,PHF1 mRNA在非小细胞鳞癌组织中明显增高,在非小细胞腺癌组织中明显降低,差异均有统计学意义(P0.05);与腺癌细胞A549比较,鳞癌细胞NCIH520 PHF1 mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。第1天,鳞癌细胞NCI-H520和腺癌细胞A549四组细胞增殖、侵袭及凋亡率比较差异均无统计学意义(P0.05);从第3天开始,鳞癌细胞NCI-H520和腺癌细胞A549四组细胞增殖、侵袭及凋亡率比较差异有统计学意义(P0.05),其中在增殖和侵袭方面:NCI-H520表现为PHF1过表达组阴性对照组≈空白对照组PHF1低表达组,而在A549表现为PHF1低表达组阴性对照组≈空白对照组PHF1过表达组;在凋亡率方面:NCI-H520表现为PHF1低表达组阴性对照组≈空白对照组PHF1过表达组,而在A549表现为PHF1过表达组阴性对照组≈空白对照组PHF1低表达组。结论 PHF1在非小细胞鳞癌中高表达,靶向抑制其可阻碍癌细胞增殖、侵袭及凋亡,过表达则反之;而在非小细胞腺癌中PHF1低表达,与鳞癌结果截然相反,有望成为鉴别非小细胞鳞癌与腺癌及个体化治疗的重要指标。     

槲皮素通过STAT3信号通路抑制肺癌A549细胞迁移和侵袭

目的 观察槲皮素通过抑制信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法 体外培养A549细胞,以不同浓度(0、7.5、15、30、60、120μmol/L)槲皮素处理24、48和72 h,采用CCK-8检测槲皮素对A549细胞增殖的抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50).A549细胞随机分为4组:分别以0(空白对照组)、15和30μmol/L槲皮素和3μg/ml顺铂(阳性对照组)处理24 h.采用细胞黏附实验、划痕修复实验、Transwell小室体外侵袭实验观察A549细胞黏附、迁移、侵袭能力,Western印迹法检测STAT3、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)蛋白表达的变化.结果 槲皮素剂量依赖性地抑制A549细胞增殖.与空白对照组相比,槲皮素显著抑制A549细胞黏附率、迁移率、侵袭细胞数(P<0.05或P<0.01);与空白对照组相比,槲皮素显著降低A549细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达(P<0.05或P<0.01).结论 槲皮素具有明显的抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用,其机制可能与抑制STAT3信号通路有关.     

金银花多酚粗提物调控miR-100-5p参与非小细胞肺癌细胞NCI-H1299侵袭迁移

目的:探讨金银花多酚粗对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞恶性生物学行为的影响及分子机制。方法:将非小细胞肺癌NCI-H1299细胞分为NC组、紫杉醇组、金银花多酚粗提物低、中、高剂量组、miR-100-5p组、miR-NC组、anti-miR-100-5p+高剂量组、anti-miR-NC+高剂量组;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;Transwell检测细胞迁移和侵袭;蛋白质印迹法检测E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-100-5p表达水平。结果:不同浓度金银花多酚粗提物处理后,NCI-H1299细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少,E-Cadherin、miR-100-5p表达水平升高,N-Cadherin、Vimentin表达水平降低(P<0.05)。过表达miR-100-5p后,NCI-H1299细胞活性升高,细胞迁移[(226±20.03)个]和侵袭数量[(171±15.03)个]增加,E-Cadherin表达水平(0.34±0.03)降低,...     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.