自噬参与DJ-1保护大鼠黑质多巴胺能神经元抵抗鱼藤酮损伤

目的 观察过表达DJ-1是否缓解鱼藤酮致SD大鼠中脑黑质多巴胺能神经元损伤及其机制。方法 在大鼠黑质致密部注射携带DJ-1、LacZ或者GFP-DJ-1、GFP的腺相关病毒颗粒,4周后注射鱼藤酮。通过免疫组织化学方法鉴定基因表达情况,并检测 TH阳性神经元数量,验证DJ-1保护作用。通过Western blotting方法检测自噬相关蛋白表达水平。结果 鱼藤酮损伤4周时,可见过表达DJ-1组大鼠损伤侧黑质的TH阳性神经元数目显著高于单纯鱼藤酮损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹检测动物损伤侧黑质自噬相关蛋白Beclin1、p-mTOR的表达和LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值,发现DJ-1过表达组中Beclin1与LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值均较对照组增加,差异有统计学意义;而p-mTOR的表达较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DJ-1能抵抗鱼藤酮对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤,DJ-1能上调自噬水平。     

Tideglusib 对MPP+ 诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡的保护作用及其机制研究

目的：研究特异性GSK-3β抑制剂Tideglusib 对1- 甲基-4- 苯基- 吡啶离子（1-methyl-4- phenylpyridinium ion,MPP+）诱导SH-SY5Y 神经细胞凋亡的保护作用及其可能的作用机制。方法：通过MPP+ 诱导SH-SY5Y 细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型,采用MTT 筛选出对SHSY5Y起保护作用的Tideglusib 有效浓度;采用免疫化学染色方法检测Tideglusib 对SH-SY5Y 的神经保护作用;分别采用Hoechst33258 核染方法和流式细胞仪检测Tideglusib 的抗凋亡作用;通过Western-blot 检测经Tideglusib 处理后,SH-SY5Y 细胞中与神经元凋亡密切相关的磷酸化 tau蛋白（p-tau）及其上游激酶磷酸化糖原合成激酶（p-GSK-3β）的表达水平。结果：300 μmol·L-1 的MPP+ 处理SH-SY5Y 细胞48 h 构建体外帕金森细胞模型,通过MTT 及免疫化学染色方法筛选Tideglusib 的有效保护浓度发现5 μmol·L-1 的Tideglusib 可对SH-5Y 细胞产生保护作用,细胞存活率与MPP+ 处理组相比差异具有统计学意义（P<0.01）;通过Hoechst33258 和流式细胞仪发现MPP+ 可导致SH-SY5Y 产生凋亡,5 μmol·L-1 的Tideglusib 可有效改善SH-SY5Y 的凋亡情况,差异具有统计学意义（P<0.01）;Western-blot 结果显示MPP+ 可引起 GSK-3β的活化并诱导 tau 的异常磷酸化;而Tideglusib 可下调 GSK-3β的活性,降低磷酸化 tau 的水平（P<0.05）。结论：Tideglusib可抑制MPP+ 引起的SH-SY5Y 神经细胞凋亡,作用机制可能是通过抑制GSK-3β从而降低tau 蛋白的磷酸化水平,进一步发挥神经元保护作用。     

MPP+诱导小鼠胚胎中脑组织原代培养多巴胺能神经元的损伤与死亡

目的：探讨1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（1-methyl-4-phenyl-[BF]1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPP⁺）诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤。方法：采用OF1/SPF小鼠胚胎（孕14 d）中脑进行原代细胞培养，将培养细胞分为对照组和MPP⁺给药组。于体外培养第10天,在MPP⁺给药组分别加入含有0.1、1.0、10.0 和15.0 μmol•L^-1 ４个不同浓度的MPP⁺的培养液，持续作用48 h后，经酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色，显微镜下观察、计数多巴胺能神经元。 于体外培养10 d,在MPP⁺给药组的培养液中加入终浓度为10 μmol•L^-1MPP⁺,分别于给药后2、4、8、24、48、72和96 h进行TH免疫组化染色，显微镜下计数TH染色阳性神经元，明确MPP⁺引起多巴胺能神经元损伤和死亡的时程变化。结果：0.1、1.0、10.0和15.0 μmol•L^-1浓度的MPP⁺给药组中平均每培养孔中的TH染色阳性神经元的数量分别为对照组的(70.30±6.38)%、(67.39±4.92)%、(51.68±2.95)% 和(50.91±5.60)% 。MPP⁺给药组中，多巴胺能神经元的损伤表现为两种不同形态:绝大多数多巴胺能神经元表现为神经突起的数目及长度明显减少，极少数为胞体空虚、丢失,仅存神经突起。10 μmol•L^-1 MPP⁺分别作用24、48、72和96 h的MPP⁺给药组中,TH染色阳性神经元的数量每培养孔分别为(677.2±6.1)、(411.5±26.6)、(229.0±20.3)和(191.3±15.2)个，与对照组［(839.8±15.5)个/培养孔］相比明显减少（P<0.05）。 结论: 0.1、1.0、10.0和15.0 μmol•L^-1 浓度的MPP⁺均可诱导的多巴胺能神经元的损伤和死亡，其损伤程度与MPP⁺药物浓度和持续作用的时间呈依赖关系；MPP⁺诱导多巴胺能神经元的损伤和死亡可能存在2种不同的机制。     

银杏叶提取物对MPP+诱导的中脑多巴胺能神经细胞损伤的保护作用

目的：探讨银杏叶提取物（EGB761）对1-甲基4-苯基吡啶离子（MPP^＋）诱导的帕金森病细胞模型是否具有保护作用．方法：采用胚胎大鼠中脑原代细胞培养法,分离培养中脑神经细胞,随后进行EGB761及MPP^＋处理,最后通过3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法,酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学,研究EGB761对MPP^＋损伤后的中脑原代培养细胞及DA能神经细胞活性的影响,同时进行iNOS免疫细胞化学法,了解iNOS的表达情况．结果：在MPP^＋诱导的中脑原代细胞凋亡中,MPP^＋组TH阳性细胞数及细胞存活率均显著低于各EGB761组及阳性对照组（P〈0．01）．而iNOS的表达则显著多于各EGB761组（P〈0．01）．结论：EGB761对MPP^＋诱导的胚胎大鼠中脑原代培养细胞损伤具有保护作用,且此作用有随剂量的增大而增加的趋势．     

DJ-1基因与帕金森病的相关性研究进展

帕金森病(parkinson's disease,PD)是一种常见的伴运动障碍的神经变性病,主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高及姿势不稳等症状.它的发病率在40岁以上人群为0.1%,在65岁或以上人群为1%～2%,大部分患者为散发病例,但10%～20%患者有家族史.     

温肾养肝汤对MPTP所致帕金森病多巴胺能神经元损伤保护的分子机制研究

目的 探讨温肾养肝汤保护多巴胺(Dopamine,DA)能神经元,延缓帕金森病(Parkinson's disease,PD)进程的作用机制.方法 将50只小鼠随机分为正常组,模型组,温肾养肝汤高、低剂量组,金刚烷胺组,每组10只,除正常组外,其余组小鼠腹腔注射30 mg·kg-11-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四...     

外源性犬尿喹啉酸对黑质多巴胺能神经元损伤保护作用的实验研究

目的：观察评价预先应用谷氨酸（Glu)受体拮抗剂犬尿喹啉酸（KYNA）对黑质多巴胺（DA）能神经元及神经传导纤维损伤的保护性作用。方法：雌性SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只，应用江湾I型C立体定向仪，在单侧黑质致密部（SNc)及中脑被盖腹侧部（VTA），A组注射生理盐水，B组注射KYNA，C组注射KYNA和6－OHDA，KYNA先于6－OHDA 0.5h,D组注射6－OHDA。注射药物3d后，进行症状观察，2周后处死大鼠。切片HE染色观察黑质细胞的形态特点，冰冻切片免疫组化特殊染色观察TH阳性细胞及TH阳性纤维着色情况，实验数据分别采用方差分析以及秩和检验进行统计分析。结果：正常黑质细胞体形较大，富含黑色素颗粒，可见尼氏体。数据统计分析结果提示B组与A组之间无显著影响，P＞0．05。实验组C与A、B、D组比较均有显著性差异，P＜0．01。结论：外源性谷氨酸受体拮抗剂KYNA通过阻滞Glu受体能减轻6－OHDA诱导的黑质DA能神经元毒性损害。     

MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性的影响

目的　探讨 1 甲基 4 苯基吡啶 (MPP+ )对体外培养的中脑多巴胺能神经元的影响。方法　将不同浓度的MPP+ 加入体外培养的中脑多巴胺能神经元培养液中 ,分别测定 [3H]多巴胺和 [3H]胆碱摄取能力及细胞内的多巴胺含量 ,并进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色。结果　MPP+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元的 [3H]多巴胺摄取力有明显的抑制作用 (P <0 0 5 ) ;但对[3H]胆碱摄取力无抑制作用 (P >0 0 5 ) ;这种抑制作用在未抑制胶质细胞组明显强于抑制胶质细胞组 (P <0 0 5 ) ;加用MPP+ 后中脑多巴胺能神经元细胞内的多巴胺含量明显减少 (P <0 0 5 ) ,TH阳性细胞明显减少 (P <0 0 5 )。结论　MPP+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性有明显的抑制作用     

姜黄素对鱼藤酮诱导的黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用

目的 观察姜黄素对由鱼藤酮诱导的慢性帕金森病大鼠模型黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用并探讨其可能机制。方法 2014年12月-2015年5月,选取清洁级雄性SD大鼠80只按随机区组法分为溶剂对照组、姜黄素组、鱼藤酮组、治疗组,每组20只。采用脑切片免疫组化染色法检测大鼠脑黑质区酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞数,Western blotting法检测大鼠脑黑质区沉默信息调节因子3（SIRT3）、P47phox表达水平,流式细胞仪检测大鼠脑黑质区活性氧（ROS）水平。结果 4组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组,高于鱼藤酮组（P＜0.05）。4组大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox表达水平比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组,高于鱼藤酮组（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组,低于鱼藤酮组（P＜0.05）。4组大鼠脑黑质区ROS水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组,低于鱼藤酮组（P＜0.05）。结论 姜黄素可有效拮抗鱼藤酮诱导的慢性帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤,其机制可能与姜黄素通过促进SIRT3的表达清除小胶质细胞源性ROS有关。     

乳铁蛋白对MPP+诱导的帕金森病细胞模型炎症损伤的保护作用及机制研究

目的 探讨外源性乳铁蛋白对1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺)诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞帕金森病(PD)模型炎症损伤的保护作用及其机制。方法 以250μmol/L的MPP⁺诱导N2a细胞损伤构建PD细胞模型,将模型随机分为对照组、乳铁蛋白组、MPP⁺组和乳铁蛋白+MPP⁺组。采用CCK-8法检测细胞存活率;Annexin FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;Hoechst33342染色检测细胞早期凋亡情况;检测各组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞IL-4、IL-6、IL-13、IL-1β、TNF-α mRNA的表达;Western blotting检测不同浓度MPP⁺(0、100、250、500、1 000μmol/L)N2a细胞的酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)蛋白的表达,检测各组的Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、p38、p-p...     

1-甲基-4-苯基-吡啶盐对多巴胺能细胞系SH-SY5Y的毒性作用机制

目的 :探讨与帕金森病发病有关的环境毒素 1 甲基 4 苯基 吡啶盐 (MPP+ )导致多巴胺能细胞死亡的可能机制 .方法 :测定MPP+ 作用于多巴胺能细胞系SH SY5Y后细胞存活率的变化及.OH自由基、超氧化物岐化酶 (SOD)的变化 .结果 :MPP+ 作用于多巴胺能细胞系SY5Y ,可导致细胞存活率显著性减少 ,浓度达到 2 0 0 μmol·L-1以上后 ,细胞存活率的下降呈时间与MPP+ 浓度依赖 ;以 2 0 0 μmol·L-1MPP+ 作用细胞 6～ 4 8h后 ,.OH自由基逐渐增加 ,4 8h后SOD开始显著性减少 .结论 :.OH自由基增加是MPP+ 导致多巴胺能细胞氧化应激的原因 ,而细胞内自由基的清除机制受损 ,则最终导致细胞变性死亡     

DJ-1基因L10P突变导致氧化应激和线粒体功能障碍(英文)

目的：探讨DJ-1基因L10P突变对细胞线粒体功能的影响。方法：应用流式细胞仪、分光光度计、电镜等技术对稳定表达空载体、野生型DJ-1蛋白、L10P突变型DJ-1蛋白的HEK293单克隆细胞株的生长活力、活性氧、膜电位、线粒体复合体酶I活性及线粒体形态进行分析。结果：与空载体组相比较,L10P突变型DJ-1组细胞内活性氧增高,细胞活力、膜电位、线粒体复合体I活性降低,线粒体含量减少(P<0.05),出现线粒体肿胀,甚至线粒体空泡变性,特别是在鱼藤酮的诱导下更明显;野生型DJ-1组细胞内活性氧均较低,细胞活力、膜电位、线粒体复合体I活性均较高(P<0.05),特别是在鱼藤酮的诱导下更明显。结论：L10P突变后使野生型DJ-1蛋白的抗氧化应激能力丧失,并对线粒体的正常功能存在影响。     

Synphilin-1转基因小鼠纹状体多巴胺代谢变化的研究

目的探讨Synphilin-1蛋白对小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元递质传递的影响。方法利用转基因技术制备Synphilin-1转基因小鼠（转基因组,11只）,另以野生型小鼠为非转基因组（11只）作对照。通过加速转圈测试和足迹分析观察两组小鼠的运动能力。分别测定两组小鼠的多巴胺及其代谢产物,并且测定参与纹状体多巴胺代谢酶的表达水平,进行分析比较。结果转基因组小鼠的运动能力较非转基因组下降（转圈能力减弱、步长较短）,且转基因组小鼠表现为短暂步态。Synphilin-1蛋白使黑质纹状体多巴胺能神经元的多巴胺代谢产物/多巴胺的比例明显下降（P＜0.05）,而参与多巴胺代谢的酶的含量并无明显变化（P＞0.05）。结论Synphilin-1蛋白引起小鼠运动能力损害,对黑质纹状体多巴胺代谢影响主要是通过改变突触前膜多巴胺能神经元递质传递来实现的。     

尼古丁对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的：观察尼古丁（NIC）对脂多糖（LPS）诱导的帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用。方法：60只大鼠随机分为4组,每组15只。LPS组（L组）、NIC组（N组）和NIC＋α7型烟碱乙酰胆碱受体（nAChR-α7）阻断剂α-银环蛇毒素组（α-BTX）（M组）分别腹腔注射PBS、NIC和NIC与α-BTX,连续4周,并于2周末一次性黑质内注射LPS。对照组（C组）均给予PBS。4周末进行阿朴吗啡诱导的旋转试验,并用免疫组化方法观测黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数量及离子钙结合蛋白1（Iba1）阳性细胞的形态。结果：4组大鼠旋转实验阳性率及30min内旋转圈数差异有统计学意义（χ2=10.179,P=0.006;F=54.681,P〈0.001）,TH免疫阳性神经元数差异有统计学意义（F=861.541,P〈0.001）。与N组相比,L组及M组旋转实验阳性率降低,旋转圈数减少（P〈0.05）,TH免疫阳性神经元数减少（P〈0.05）。N组Iba1阳性细胞多呈静止期的形态;L组与M组细胞形态相似,大多呈活化期的形态。结论：NIC可能通过nAChR-α7抑制小胶质细胞的活化,对LPS诱导的帕金森病大鼠多巴胺能神经元起保护作用。     

caspase-3在神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子诱发多巴胺能神经元凋亡中的表达

目的:探讨caspase-3在1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium , MPP+)诱发多巴胺能神经元凋亡中的表达.方法:建立MPP+诱发中脑神经细胞凋亡模型,通过免疫组织化学染色及RT-PCR检测方法,检测原代培养的16 d胎鼠的中脑多巴胺能神经元中caspase-3的表达.结果:在正常组和细胞凋亡组(MPP+组)的caspase-3在蛋白质和基因水平均有表达,但在细胞凋亡组中表达强度明显高于正常对照组,二者差异具有显著性.caspase-3的蛋白酶抑制剂Ac-DEVD-CHO可降低caspase-3的表达.结论:caspase-3参与MPP+诱发的多巴胺能神经元的凋亡过程,并起关键作用,以MPP+为诱导剂建立的中脑神经细胞凋亡模型可用于研究与帕金森病(Parkinson disease, PD)有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗PD药物.     

褐藻多糖硫酸酯减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子引起的细胞损伤和氧化应激

目的以1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)为工具药处理MN9D细胞,建立帕金森病(Pakinson’s disease,PD)的细胞模型,观察褐藻多糖硫酸酯对细胞的保护作用,并初步探讨其作用机制。方法用不同浓度(25、50、100、200μmol/L)的MPP+处理MN9D细胞36h,50μmol/L MPP+处理MN9D细胞,时间分别为12、2436、48h,建立细胞损伤模型。用0.01、0.1、1g/L褐藻多糖硫酸酯预孵育MN9D细胞1h后,加入50μmol/L MPP+共同作用36h以探讨褐藻多糖硫酸酯的保护作用。MTT法检测细胞活力、生化法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量,并采用二氯荧光素乙二酯(DCF-DA)染色法检测细胞内的氧化应激水平。结果随着MPP+浓度增加或作用时间延长,MN9D细胞MTT值逐渐降低。50μmol/L MPP+处理细胞36h,MTT值明显下降,LDH释放量增加。而0.1、1g/L的褐藻多糖硫酸酯预孵育1h,可明显减轻MN9D细胞的损伤,提高MTT值并降低LDH释放量,细胞形态学改变与生化实验结果一致。50μmol/L MPP+作用12h,可使MN9D细胞的氧化应激水平明显升高,而0.1、1g/L的褐藻多糖硫酸酯预处理1h,可以拮抗MPP+引起的细胞内氧化应激水平增高。结论褐藻多糖硫酸酯可以有效拮抗MPP+对MN9D细胞的损伤作用,其机制可能与褐藻多糖硫酸酯具有抗氧化活性有关。     

肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型的保护作用

目的:探讨肉苁蓉提取物对帕金森病的神经保护作用及其作用机制。方法:以1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP )介导的SH-SY5Y细胞损伤模型为帕金森病细胞模型,观察不同浓度肉苁蓉提取物对模型细胞生存率、生长抑制和DNA损伤诱导基因153(growth arrest-and DNAdamage-induced gene153,GADD153)及其蛋白表达的影响。结果:100μg/ml肉苁蓉提取物明显提高了1mmol/L MPP 作用48h后的SH-SY5Y细胞的生存率(P<0.01);降低了GADD153 mRNA与蛋白表达(P<0.01)。结论:肉苁蓉提取物对MPP 介导的细胞损伤有保护作用,其作用机制可能与GADD153的mRNA和蛋白水平的表达有关。