兔成骨细胞与纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙人工骨细胞支架生物相容性研究

目的 研究成骨细胞与纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙人工骨细胞支架在体外培养条件下的生物相容性。方法 将成骨细胞株置于含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养，分为纳米支架复合细胞组和单纯细胞组，不同时间用倒置相差显微镜、HE染色光镜及扫描电镜观察。MTT法进行细胞增殖测定，并进行细胞微量蛋白含量检测和碱性磷酸酶的定量检测。结果 成骨细胞体外培养时复合或不复合纳米支架均生长良好，表现出典型的细胞形态特征和生物学特性，纳米支架利于细胞的贴附、生长与增殖，并对细胞的功能无不良影响。结论 纳米支架是较理想的骨组织工程支架材料，成骨细胞复合纳米支架用于骨缺损的修复，具有广阔的临床应用前景。     

WO-1生物衍生骨支架与成骨细胞相容性的实验研究

目的 研究WO-1生物衍生骨复合材料与兔成骨细胞的相容性及体外附着规律，为进一步的体内试验提供基础研究。方法 应用同种异体骨、Ⅰ型胶原及WO-1制备WO-1生物衍生骨复合材料；取幼兔的颅顶骨成骨细胞，经培养液体外培养、扩增后，与WO-1生物衍生骨材料联合培养。通过扫描电镜和倒置相差显微镜观察WO-1生物衍生骨复合材料的形貌特征、细胞与材料的粘附和增殖情况。结果 WO-1生物衍生骨复合材料具有天然骨的三维结构；扫描电镜和倒置相差显微镜均显示复合培养的成骨细胞在材料表面和孔隙内生长良好。结论 WO-1生物衍生骨复合材料具有良好的细胞相容性。     

成骨细胞体外培养技术

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,对它的研究成为研究骨代谢和成骨机制的重要途径。选择便捷高效的体外培养方法,是开展体外成骨细胞研究的前提。随着细胞培养技术的发展,人们已经通过分离培养、诱导分化、与破骨细胞共培养乃至建立3D共培养体系,从许多动物的骨组织中成功培养或者诱导形成具有典型成骨特性的细胞。本文就常见的成骨细胞体外培养技术和鉴定方法做简要概述。     

蛇床子素和纳米氧化锆强韧化磷酸钙支架对成骨细胞增殖影响的研究

目的研究蛇床子素与纳米氧化锆强韧化磷酸钙骨支架的相容性，以及其在体外对幼兔成骨细胞增殖和成骨作用的影响。方法酶消化法分离培养幼兔股骨成骨细胞，噻唑兰法(MTT)测量成骨细胞增殖率，用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性。结果蛇床子素对大鼠新生成骨细胞的增殖和ALP活性具有显著的促进作用，与纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架生物相容性良好。结论纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架复合蛇床子素刺激的成骨细胞，是一种性能良好的复合骨组织工程材料。     

胶原酶阶梯消化法体外培养成骨细胞的研究

目的 采用胶原酶阶梯消化法进行鼠颅盖骨体外培养。方法 将新生的健康Wistar大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净,粉碎漂洗。依次用1．0％、0．5％及0．1％的Ⅰ型胶原酶分3次对颅骨进行消化。制成细胞悬液,接种培养,然后进行细胞内碱性磷酸酶（ALP）染色,最后将成骨细胞纯化、鉴定。结果 纯化处理的培养皿中,ALP染色阳性区域不少于95％,而对照皿中,不超过62％。结论 胶原酶阶梯消化法培养 的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征,且成份单一。     

转染特异性报导基因成骨细胞生物学性状及其与骨支架材料生物相容性的研究

目的研究转染特异性报导基因成骨细胞的生物学性状，并观察该细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。方法常规复苏培养转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞，通过倒置相差显微镜、HE染色、I型胶原免疫组化法染色、碱性磷酸酶（ALP）偶氮偶联法染色、矿化结节茜素红法染色及四环素法染色观察该转基因成骨细胞的生物学性状；并将其与纳米磷酸钙复合骨支架进行体外复合培养，通过扫描电镜观察该转基因成骨细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。结果转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞经培养后能贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，能分泌胶原基质和ALP，经I型胶原免疫组化法染色及ALP偶氮偶联法染色呈强阳性；并能够形成矿化结节，茜素红法染色及四环素法染色呈阳性；该转基因成骨细胞在骨支架材料上具有良好的生长特性和黏附性，并能正常分化、增殖和成熟，分泌大量胶原基质和钙结节。结论转染12×SBE—OC—Luc报导基因后成骨细胞生物学性状未发生改变，其与骨支架材料亦具有良好的生物相容性。     

包埋后的几丁质与软骨细胞体外培养的实验研究

目的 探讨几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法 采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别或工同包埋几丁质与软骨细胞体外培养,观察其产亲水性的改变、对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果 以聚乳酸包埋的几丁质对细胞的生长有抵制作用;以卵磷脂包埋的几柄质亲水性增强;以多聚赖氨酸包埋的几丁质对细胞吸附力增强;以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的几丁质具有良好的亲水性和对细胞吸附力,并可使细胞更好地发挥功能     

大块组织工程骨支架结构设计制造及与人成骨细胞联合培养观察

目的: 提出一种基于计算机辅助设计 (CAD) 和快速成型技术 (RP) 的大块组织工程骨支架结构设计、制造方法, 观察人成骨细胞与支架的相容性及细胞生长情况。方法:应用CAD软件设计生成支架负型CAD模型, 快速成型技术制备树脂模具, 在模具中填充β- 磷酸三钙 (β- TCP), 高温烧结后制成支架。将人成骨细胞与支架复合培养, 扫描电镜 (SEM) 观察细胞生长情况。结果: 支架负型CAD模型为内部呈轮辐形网架结构的圆柱体, 制得树脂模具及支架与设计模型一致。SEM观察: 细胞增殖分化良好, 大量细胞生长入管状孔道内。结论: 该方法实现大块组织工程骨支架结构的精确设计和可控制造, 制得支架与人成骨细胞有良好的生物相容性, 内部结构利于细胞长入支架深部。     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。     

纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙人工骨细胞支架生物学评价

目的：对自行研制的纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙人工成骨细胞支架[hyper-porosity Ca3(PO4)：bone cells frame／NM ZrO2 reinforced以下简称支架]的体外生物相容性进行评价。方法：采用细胞毒性试验、溶血试验和急性全身中毒试验3种方法。结果：(1)培养的L929成骨细胞经支架浸提液处理后形态良好，增值旺盛，材料毒性评级为0级；(2)溶血率为2．23％(小于5％)，符合溶血试验标准要求；(3)无急性全身中毒反应。结论：支架复合物具有良好的生物相容性。     

表皮细胞体外增殖与增殖表型细胞含量变化规律的实验研究

目的研究人表皮细胞(humanepidermalcells,hECs)体外扩增与增殖表型细胞含量变化规律。方法收集2～3岁健康幼儿包皮共20例,对标本拍照,软件分析照片中标本面积,分离、收集表皮细胞,计算原代(P0)细胞获得率(5例)。记录不同代次细胞生长曲线,细胞直径,克隆形成率(5例)。对不同代次细胞的角蛋白19(keratin,K19)和外皮蛋白(involucrin)的mRNA表达情况及阳性细胞率分别进行RTPCR检测(5例)和流式细胞仪(FACS)分析(5例)。结果原代细胞平均获得率为(164±0297)×106cm2。hECs最大可扩增(700±37)倍,第5代(P5)的扩增倍数为(243±13)倍。P0克隆形成率为(45±4)%,随传代依次降低,至第5代(P5)时为(9±2)%,至第6代(P6)时消失。RTPCR检测发现K19mRNA在P5及P5之前表达,P6未见表达;Involucrin各代均表达。FACS检测各代hECs中K19阳性细胞百分率逐渐降低,P0时为(6697±314)%,P6为(465±138)%;外皮蛋白表达阳性细胞百分率逐渐增高,P0时为(1165±162)%,P6为(9703±266)%。结论体外扩增至第5代的幼儿包皮来源的表皮细胞,维持着增殖细胞表型,符合组织工程表皮种子细胞的要求。表皮细胞体外扩增能力逐渐降低与增殖表型细胞含量减少有关。     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

自体骨髓间质干细胞外基质支架在体外软骨组织工程中的应用

 目的 探讨利用自体骨髓间质干细胞外基质(autologous bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular matrix,aBMSC-dECM)支架体外制备组织工程软骨的可行性。方法 取2周龄新西兰大白兔5只,分离、培养骨髓间质干细胞,原代培养4周,收集其分泌的细胞外基质,制备aBMSC-dECM支架。对支架行扫描电镜和HE染色观察。分离培养自体软骨细胞,植入支架内,48 h后对细胞-支架复合物行Live-Dead染色。分别于种植后1、2、4和6周对细胞-支架复合物(组织工程软骨)进行大体观察、体积测量、HE染色、Safranin-O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、Real-Time PCR检测和抗压强度测试。对照为atelocollagen支架。结果 aBMSC-dECM支架呈三维多孔状海绵样结构,孔隙分布均匀,连通性较好,孔径(304.4±108.2) ?滋m,孔隙率93.3%±4.5%。与atelocollagen支架组比较,aBMSC-dECM支架组组织工程软骨呈乳白色,表面光滑有弹性,随观察时间延长体积逐渐增大,软骨细胞数量、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原含量逐渐增多,Ⅱ型胶原及Aggrecan的mRNA持续高表达,抗压强度持续增高。结论 aBMSC-dECM支架有利于维持软骨细胞活性和生物学功能,促进组织工程软骨形成。     

人细胞外基质支架联合脂肪干细胞构建脂肪组织

目的 探讨人脂肪组织细胞外基质(ECM)支架联合人脂肪来源干细胞(ADSCs)构建工程化脂肪组织的可行性.方法 以酶消化法从人抽脂术抽吸物脂质部分获取人ADSCs,体外进行多向分化诱导鉴定,并行DiI荧光标记.从抽脂术的脂质部分分离提取人脂肪组织细胞外基质,经过低温冻干、粉碎、灭菌等处理,制备成粉末状,电镜扫描观察表面特征并将其与ADSCs进行黏附实验,探讨其作为支架材料的可行性.收集人ADSCs,以2×109/L的细胞密度与提取的细胞外基质支架复合后移植于裸鼠背部皮下,同鼠对侧背部皮下移植ECM支架和细胞培养液作为对照,每侧移植0.5 ml,共6只实验鼠.8周后取材,称量标本湿重.取出的标本行苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色进行定性判断,分析人脂肪组织ECM支架联合人ADSCs构建工程化脂肪组织的能力.结果 从脂肪组织中分离得到人ADSCs和ECM支架.ADSCs在相应的诱导环境下能够分化成为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞.ECM支架电镜扫描和大体观察具有疏松、多孔的结构特征,适合ADSCs的黏附生长.ADSCs与支架相容性良好,黏附率达(89.87±2.59)％,细胞在支架表面可充分伸展生长.体内移植8周后,实验组和对照组都能够形成新生物,湿重比较实验组较对照组重(P＜0.05).经HE切片及油红O染色均证实实验组形成成熟的脂肪组织,对照组不能形成脂肪组织.结论 人脂肪组织ECM支架联合人ADSCs在体内能够成功构建成熟的脂肪组织,8周后支架并无明显吸收.     

ATP and adenosine act as a mitogen for osteoblast-like cells (MC3T3-E1)

Extracellular ATP, and to a lesser extent adenosine, an ATP metabolite, stimulated cell proliferation in osteoblast-like cells (MC3T3-E1). ATP increased cytosolic Ca²⁺ due to Ca²⁺ mobilization from intracellular storage in the same concentration range of the nucleotide as that effective for DNA synthesis, suggesting the mediation of the phospholipase C/Ca²⁺ system in the mitogenic action. Since adenosine induced no Ca²⁺ mobilization, P₂-purinergic receptor appears to be associated with ATP actions. The growth-promoting effect of ATP was not inhibited by H7, a protein kinase C inhibitor, and indomethacin, a cyclooxygenase inhibitor, indicating no involvement of activation of protein kinase C and production of prostaglandins in ATP-induced mitogenic signals. Either ATP or adenosine remarkably and synergistically potentiated platelet derived growth factor-induced DNA synthesis. These findings suggest that extracellular ATP and adenosine may play a physiological role in the regulation of bone formation. Received: 17 January 1995 / Accepted: 21 March 1995     

Coculture of elongated neuron axon with poly （D, L-lactide-co-glycolide） biomembrane in vitro

Objective: To elongate human nerve axon in culture and search for suitable support matrices for peripheral nervous system transplantation. Methods: Human embryo cortical neuronal cells, seeded on poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) membrane scaffolds, were elongated with a self-made neuro-axon extending device. The growth and morphological changes of neuron axons were observed to measure axolemmal permeability after elongation. Neurofilament protein was stained by immunohistochemical technique. Results: Human embryo neuron axon could be elongated and cultured on the PLGA membrane and retain their normal form and function. Conclusions: Three dimensional scaffolds with elongated neuron axon have the basic characteristics of artificial nerves, indicating a fundemental theory of nerve repair with elongated neuron axon.